Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP
Summary
Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis – en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.
Abstract
Protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania veroorzaken leishmaniasis , een ziekte met variabele klinische manifestaties die miljoenen mensen wereldwijd treft. Infectie met L. donovani kan leiden tot fatale viscerale ziekte. In Panama, Colombia en Costa Rica is L. panamensis verantwoordelijk voor de meeste gemelde gevallen van cutane en mucocutane leishmaniasis. Het bestuderen van een groot aantal kandidaat-geneesmiddelen met de tot nu toe beschikbare methodologieën is vrij moeilijk, aangezien ze zeer bewerkelijk zijn voor het evalueren van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire vormen van de parasiet of voor het uitvoeren van in vivo assays. In dit werk beschrijven we de generatie van L. panamensis en L. donovani stammen met constitutieve expressie van het gen dat codeert voor een verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) geïntegreerd in de locus die codeert voor 18S rRNA (ssu). Het gen dat codeert voor eGFP werd verkregen uit een commerciële vector en versterkt door polymerasekettingreactie (PCR) om het te verrijken en restrictieplaatsen toe te voegen voor de BglII- en KpnI-enzymen. Het eGFP-amplicon werd geïsoleerd door agarosegelzuivering, verteerd met de enzymen BglII en KpnI en geligeerd in de Leishmania-expressievector pLEXSY-sat2.1 die eerder met dezelfde set enzymen werd verteerd. De expressievector met het gekloonde gen werd gepropageerd in E. coli, gezuiverd, en de aanwezigheid van de insert werd geverifieerd door kolonie-PCR. Het gezuiverde plasmide werd gelineariseerd en gebruikt om L. donovani en L. panamensis parasieten te transfecteren. De integratie van het gen werd geverifieerd door PCR. De expressie van het eGFP-gen werd geëvalueerd door flowcytometrie. Fluorescerende parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit werden geselecteerd met behulp van flowcytometrie.
Introduction
Protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania veroorzaken leishmaniasis, een ziekte met een breed scala aan klinische manifestaties. Deze ziekte komt voor in 98 landen en de jaarlijkse incidentie wordt geschat op 0,9 tot 1,6 miljoen gevallen1. Leishmania-soorten die pathogeen zijn voor de mens zijn verdeeld in twee subgenera, namelijk L. (Leishmania) en L. (Viannia). Infectie met sommige soorten die tot de L behoren. (Leishmania) subgenus, zoals L. donovani en L. infantum, kan leiden tot viscerale leishmaniasis (VL), die fataal is als het onbehandeld blijft2. Soorten die behoren tot de L. (Viannia) subgenus zijn geassocieerd met de meeste gevallen van cutane leishmaniasis (CL) en mucocutane leishmaniasis (MCL) in Midden- en Zuid-Amerika, met name in Panama, Colombia en Costa Rica, waarbij L. panamensis de belangrijkste etiologische verwekker is van deze klinische presentaties 3,4.
Bestaande anti-leishmania chemotherapie die geneesmiddelen zoals pentavalente antimonialen, miltefosine en amfotericine B omvat, is zeer giftig en duur. Bovendien is de toegenomen resistentie tegen geneesmiddelen in de afgelopen decennia toegevoegd aan de factoren die de effectieve behandeling van patiënten wereldwijd verstoren5. Er zijn aanzienlijke verschillen aangetoond tussen soorten van het geslacht Leishmania met betrekking tot de gevoeligheid voor geneesmiddelen, met name tussen nieuwe en oude wereldsoorten 6,7. Om deze redenen is het noodzakelijk om de inspanningen te richten op de identificatie en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen tegen leishmania, met speciale aandacht voor soortspecifieke benaderingen. Het bestuderen van grote bibliotheken van kandidaat-geneesmiddelen met traditionele methodologieën is vrij moeilijk, aangezien deze methodologieën zeer arbeidsintensief zijn voor het evalueren van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire amastigoten of voor het uitvoeren van in vivo experimenten8; Daarom was het noodzakelijk om nieuwe technieken te ontwikkelen die deze nadelen verminderen, waaronder de implementatie van reportergenen en de ontwikkeling van fenotypische screeningstests met een hoog gehalte9.
Het gebruik van reportergenen heeft het potentieel aangetoond om de efficiëntie van het screeningproces van geneesmiddelen te verhogen, omdat het de ontwikkeling van high-throughput en in vivo assays vergemakkelijkt. Recombinante Leishmania-parasieten die verschillende reportergenen tot expressie brengen, zijn gegenereerd door verschillende onderzoeksgroepen. Reportergenen, zoals β-galactosidase, β-lactamase en luciferase, zijn geïntroduceerd in verschillende Leishmania-soorten met behulp van episomale vectoren, wat een beperkt nut aantoont voor geneesmiddelenscreening in extra- en intracellulaire vormen van de parasiet 10,11,12,13,14,15. Deze benaderingen hebben de beperking van het vereisen van een sterke selectieve druk in cultuur om de eliminatie van het episomale construct te voorkomen, evenals het gebruik van extra reagentia om de activiteit van het reportergen te onthullen. Omgekeerd zijn het groene fluorescerende eiwit (GFP) en zijn variant, het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP), gebruikt bij het genereren van een groot aantal transgene Leishmania-stammen voor in vitro screeningtests voor geneesmiddelen vanwege hun flexibiliteit en gevoeligheid, evenals de mogelijkheid om het screeningsproces te automatiseren met behulp van flowcytometrie of fluorometrie15, 16,17,18,19. Ondanks veelbelovende resultaten waren culturen van deze transgene stammen zeer heterogeen in hun fluorescentieniveaus, omdat het aantal kopieën van het GFP-gen niet bij alle parasieten hetzelfde was. Bovendien vereiste het handhaven van fluorescentie een constante selectieve druk op de parasieten in cultuur, omdat het GFP-gen werd geïntroduceerd in een episomale constructie.
Om de eerder genoemde redenen zijn veel inspanningen gericht op het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het produceren van stabiele recombinante stammen. Deze inspanningen zijn meestal gebaseerd op de integratie van reportergenen in ribosomale loci, waarbij gebruik werd gemaakt van de hogere transcriptiesnelheden van ribosomale genen20. Stammen van L. infantum en L. amazonensis zijn gegenereerd met de integratie van de genen die coderen voor β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP 22 en tdTomato 23, en ze zijn geëvalueerd op hun bruikbaarheid in medicijnscreeningtests. Verschillende groepen hebben L. donovani-stammen ontwikkeld die GFP constitutief tot expressie brengen door het coderende gen te integreren in de 18S ribosomale RNA-locus (ssu locus) door homologe recombinatie24,25; ze vertoonden stabiele en homogene GFP-expressie in de getransfecteerde populatie, waaronder intracellulaire amastigoten 24,25, en ze werden met succes geïmplementeerd in medicijnscreeningstests24,25,26. Bolhassani et al.27 ontwikkelden stammen van L. major en L. infantum die GFP tot expressie brachten als een geïntegreerd transgen. Ze gebruikten de integratievector pLEXSY, oorspronkelijk ontworpen voor de transgene expressie van eiwitten in een systeem met L. tarentolae als gastheer28. De pLEXSY-GFP-vector is zeer efficiënt gebleken voor het genereren van verschillende Leishmania-stammen die constitutief GFP 24,25,27,29,30 tot expressie brengen. Bij deze parasieten is fluorescentie homogeen en wordt het gehandhaafd in de intracellulaire vormen, waardoor het kan worden gedetecteerd in voetzoollaesies van geïnfecteerde muizen27.
In dit werk beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis – en L. donovani-stammen die het gen dat codeert voor eGFP tot expressie brengen als een geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. De stammen die door dit proces worden gegenereerd, worden in ons laboratorium gebruikt voor het uitvoeren van medicijnscreeningstests die de potentiële anti-leishmania-activiteit van moleculen van natuurlijke en synthetische oorsprong evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De voor- en nadelen van verschillende reportergenen zijn bestudeerd in verschillende protozoaire parasieten. Onder hen zijn GFP en eGFP intrinsiek fluorescerend en maken eenvoudige kwantificering en beeldvorming mogelijk. De fluorescerende activiteit van deze eiwitten kan worden gedetecteerd met minimale manipulatie met behulp van fluorescentiemicroscopie, fluorimetrie of flowcytometrie. Er zijn weinig studies uitgevoerd voor het genereren van GFP-expressing L. (Viannia) stammen, ondanks de aangetoonde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, subsidienummer NI-177-2016, en Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, subsidienummers SNI-169-2018, SNI-008-2022 en SNI-060-2022.
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
