Summary
В данной работе описывается методология получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген eGFP в виде стабильного интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Трансфицированных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с самой высокой интенсивностью флуоресценции у обоих видов были отобраны для дальнейшего использования в скрининговых анализах на наркотики.
Abstract
Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с разнообразными клиническими проявлениями, которое поражает миллионы людей во всем мире. Инфекция, вызванная L. donovani, может привести к смертельному заболеванию висцеральных органов. В Панаме, Колумбии и Коста-Рике L. panamensis является причиной большинства зарегистрированных случаев кожного и кожно-кожного лейшманиоза. Изучение большого количества препаратов-кандидатов с помощью доступных на сегодняшний день методик является достаточно сложным, учитывая, что они очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных форм паразита или для проведения анализов in vivo . В данной работе описывается генерация штаммов L. panamensis и L. donovani с конститутивной экспрессией гена, кодирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), интегрированный в локус, кодирующий 18S рРНК (ssu). Ген, кодирующий eGFP, был получен из коммерческого вектора и амплифицирован методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью его обогащения и добавления сайтов рестрикции для ферментов BglII и KpnI. Ампликон eGFP выделяли путем очистки агарозным гелем, расщепляли ферментами BglII и KpnI и лигировали в вектор экспрессии Leishmania pLEXSY-sat2.1, предварительно расщепленный тем же набором ферментов. Вектор экспрессии с клонированным геном размножали в кишечной палочке, очищали, а наличие вставки проверяли методом ПЦР колонии. Очищенную плазмиду линеаризировали и использовали для трансфекции паразитов L . donovani и L . panamensis. Интеграция гена была подтверждена методом ПЦР. Экспрессию гена eGFP оценивали методом проточной цитометрии. Флуоресцентных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с наибольшей интенсивностью флуоресценции отбирали с помощью проточной цитометрии.
Introduction
Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с широким спектром клинических проявлений. Это заболевание распространено в 98 странах, а его ежегодная заболеваемость оценивается в 0,9–1,6 миллионаслучаев1. Виды Leishmania, патогенные для человека, подразделяются на два подрода, а именно L. (Leishmania) и L. (Вянния). Заражение некоторыми видами, относящимися к L. Подроды (Leishmania), такие как L. donovani и L. infantum, могут приводить к висцеральному лейшманиозу (ВЛ), который приводит к летальному исходу, если его не лечить2. Виды, принадлежащие к семейству L. Подрод (Viannia) ассоциирован с большинством случаев кожного лейшманиоза (КЛ) и слизисто-кожного лейшманиоза (МКЛ) в Центральной и Южной Америке, особенно в Панаме, Колумбии и Коста-Рике, причем L. panamensis является основным этиологическим агентом этих клинических проявлений 3,4.
Существующая химиотерапия против лейшмании, которая включает такие препараты, как пятивалентные сурьмяны, милтефосин и амфотерицин В, является высокотоксичной и дорогостоящей. Кроме того, к факторам, препятствующим эффективному лечениюпациентов во всем мире, добавилась возросшая в последние десятилетия лекарственная устойчивость 5. Существенные различия были продемонстрированы между видами рода Leishmania в отношении восприимчивости к лекарственным препаратам, особенно между видами Нового и Старого Света 6,7. По этим причинам необходимо направлять усилия на выявление и разработку новых препаратов против лейшмании, уделяя особое внимание видоспецифичным подходам. Изучение больших библиотек лекарственных препаратов-кандидатов с помощью традиционных методологий является достаточно сложным, учитывая, что эти методики очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных амастигот или для проведения экспериментов in vivo 8; В связи с этим возникла необходимость в разработке новых методов, позволяющих уменьшить эти недостатки, включая внедрение репортерных генов и разработку высокосодержательных фенотипических скрининговых тестов9.
Использование репортерных генов показало потенциал для повышения эффективности процесса скрининга лекарственных средств, поскольку это облегчает разработку высокопроизводительных анализов и анализов in vivo. Рекомбинантные паразиты Leishmania, экспрессирующие несколько репортерных генов, были созданы различными исследовательскими группами. Репортерные гены, такие как β-галактозидаза, β-лактамаза и люцифераза, были введены у нескольких видов Leishmania с использованием эписомальных векторов, что показало ограниченную полезность для скрининга лекарств во вне- и внутриклеточных формах паразита 10,11,12,13,14,15. Эти подходы имеют ограничение, заключающееся в том, что они требуют сильного селективного давления в культуре, чтобы избежать элиминации эписомальной конструкции, а также использования дополнительных реагентов для выявления активности репортерного гена. И наоборот, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариант, усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), были использованы при генерации большого количества трансгенных штаммов лейшмании для скрининговых анализов на лекарственные препараты in vitro благодаря их гибкости и чувствительности, а также возможности автоматизации процесса скрининга с помощью проточной цитометрии или флуорометрии15. 16,17,18,19. Несмотря на многообещающие результаты, культуры этих трансгенных штаммов были крайне неоднородны по уровню флуоресценции, поскольку количество копий гена GFP не было одинаковым у всех паразитов. Кроме того, поддержание флуоресценции требовало постоянного селективного давления на паразитов в культуре, поскольку ген GFP был введен в эписомальную конструкцию.
По причинам, изложенным выше, многие усилия были сосредоточены на разработке новых методологий получения стабильных рекомбинантных штаммов. Эти усилия в основном основывались на интеграции репортерных генов в рибосомные локусы, используя преимущества более высокой скорости транскрипции рибосомных генов20. Штаммы L. infantum и L. amazonensis были получены с интеграцией генов, кодирующих β-галактоцидазу 21, IFP 1.4, iRFP22 и tdTomato23, и они были оценены на предмет их полезности в скрининговых тестах на наркотики. В различных группах были выведены штаммы L. donovani, которые конститутивно экспрессируют GFP путем интеграции его кодирующего гена в локус 18S рибосомной РНК (локус ssu) посредством гомологичной рекомбинации24,25; они показали стабильную и гомогенную экспрессию GFP в трансфицированной популяции, включая внутриклеточные амастиготы 24,25, и были успешно реализованы в скрининговых анализах на лекарственные препараты24,25,26. Bolhassani et al.27 разработали штаммы L. major и L. infantum, экспрессирующие GFP в виде интегрированного трансгена. Они использовали интеграционный вектор pLEXSY, первоначально разработанный для трансгенной экспрессии белков в системе, использующей L. tarentolae в качестве хозяина28. Вектор pLEXSY-GFP показал себя очень эффективным для генерации различных штаммов Leishmania, конститутивно экспрессирующих GFP 24,25,27,29,30. У этих паразитов флуоресценция однородна и поддерживается во внутриклеточных формах, что может быть обнаружено в поражениях подушечек лап инфицированных мышей27.
В данной работе описана методика получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген, кодирующий eGFP, в виде интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Штаммы, полученные в результате этого процесса, используются в нашей лаборатории для проведения скрининговых анализов на наркотики, которые оценивают потенциальную антилейшманийную активность молекул природного и синтетического происхождения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для поддержания стерильности образцов все этапы, связанные с культивированием паразитов, должны выполняться в колпаке уровня биобезопасности 2 (BSL-2) или в соответствии с местными правилами охраны труда и техники безопасности. Графическое описание этого протокола можно найти на рисунке 1.
Рисунок 1: Сводная схема протокола генерации eGFP-экспрессирующих паразитов L. panamensis и L. donovani с использованием семейства векторов pLEXSY-2.1. Здесь изображены все шесть основных разделов, описанных в статье. 1) Амплификация и вставка гена eGFP в вектор pLEXSY-2.1: ген-мишень амплифицируют, добавляя сайты узнавания ферментов KpnI и BglII, и ампликон eGFP и плазмиду pLEXSY последовательно расщепляют обоими ферментами для последующего лигирования Т4-лигазой. 2) Линеаризация плазмиды экспрессии pLEXSY: конструкция pLEXSY + eGFP расщепляется с помощью SwaI для линеаризации и очистки кассеты экспрессии 7-8 kbp. 3) Трансфекция и 4) поликлональная селекция: промастиготы Leishmania трансфицируют экспрессионной кассетой методом электропорации и помещают обратно в культуру для антибиотикоотбора рекомбинантных паразитов. Флуоресценция паразита подтверждается с помощью проточной цитометрии. 5) Подтверждение геномной интеграции и 6) клонирование путем предельного разведения: интеграция экспрессионной кассеты pLEXSY-eGFP подтверждается диагностической ПЦР с использованием прямой гибридизации праймера с экспрессионной кассетой и обратной гибридизации праймера с хромосомной последовательностью, отсутствующей в экспрессионной кассете. Трансфицированные культуры могут быть обогащены для флуоресцентных паразитов путем клонирования путем ограничения разведения, а клоны с самой высокой средней интенсивностью флуоресценции могут быть отобраны для дальнейшего применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
1. Амплификация и вставка гена eGFP в вектор pLEXSY-2.1
- Амплификация гена eGFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом протоколе используется семейство векторов pLEXSY-2.1 (см. таблицу материалов) для конститутивной экспрессии белков-мишеней после интеграции экспрессионной кассеты в хромосомный локус 18S рРНК (ssu) видов Leishmania , первым шагом является введение в ген eGFP последовательностей, содержащих сайты рестрикции, которые позволяют его встраивать в векторы pLEXSY-2.1. В этом случае, поскольку eGFP требуется только цитозольная экспрессия, сайты рестрикции для ферментов BglII и KpnI были добавлены в 5' и 3' конце гена eGFP соответственно. Клонирование с помощью KpnI приводит к слиянию белка-мишени с С-концевой полигистидиновой меткой из шести остатков, за которой следует стоп-кодон, кодируемый в плазмиде pLEXSY-2.1 для дальнейшей очистки интересующего белка. По этой причине последовательность обратного праймера не содержит стоп-кодона.- В зависимости от источника плазмиды для eGFP проанализируйте целевую последовательность с помощью инструмента рестрикционного анализа, такого как NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 , чтобы убедиться, что она не содержит внутренних сайтов для ферментов рестрикции, используемых для клонирования (BglII и KpnI), или для SwaI, фермента, используемого для векторной линеаризации перед трансфекцией.
- Разработка прямых и обратных праймеров для амплификации eGFP, содержащих рестрикционные последовательности BglII и KpnI. В качестве примера, источником eGFP для этого протокола была плазмида pEGFP-N1-1X32, а последовательностями праймеров были те, о которых сообщили Bolhassani et al.27:
Передний праймер (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (сайт ограничения BglII выделен жирным шрифтом).
Обратный праймер (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI сайт ограничения выделен жирным шрифтом). - Амплифицировать ген-мишень с помощью полимеразы высокой точности, чтобы обеспечить сохранность кодирующей последовательности. Например, для праймеров EGFP1 и EGFP2 используйте протокол циклического ПЦР, как сообщают Bolhassani et al.27. Выполните начальную денатурацию в течение 2 минут при 94 °C, затем 30 циклов по 30 с при 94 °C, 30 с при 57 °C и 1 мин при 72 °C. Выполните заключительный этап удлинения продолжительностью 10 минут при температуре 72 °C. Добавьте праймеры в конечной концентрации 0,2 мкМ.
- Очищают фрагмент с помощью обычного набора для очистки продукта ПЦР или стандартного осаждения ацетата натрия и этанола, как описано в другом месте33.
- Вставка eGFP в вектор экспрессии pLEXSY-2.1
- Обрежьте концы продукта eGFP-PCR с помощью BglII и KpnI, следуя инструкциям производителя.
- Сначала устанавливают реакцию для фермента, требующего наименьшей концентрации соли (в данном случае KpnI), в соответствии с инструкциями производителя, и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
- Затем добавляют 100 мМ NaCl и 10 единиц BglII и инкубируют в течение 15 минут. Очистите реакцию, как описано в шаге 1.1.4.
- Переварите вектор экспрессии pLEXSY с помощью BglII и KpnI, следуя протоколу последовательного разложения, описанному в шаге 1.2.1.
- Лигируйте вектор pLEXSY и ген eGFP Т4-лигазой, используя молярное соотношение 1:3 (вектор:вставка). Кратковременно добавляют 100 нг переваренного pLEXSY и 28 нг переваренного продукта eGFP в реакцию, содержащую 20 мкл лигазный буфер при конечной концентрации 1x и 3 единиц ДНК-лигазы T4. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
- Трансформируют компетентные клетки E. coli , такие как XL-10, DH5α или DH10B, продуктом лигирования, полученным на этапе 1.2.3, с использованием стандартных протоколов трансформации33. Трансформированные клетки помещают в ампициллиновый агар Луира-Бертани (LB) и инкубируют в течение 24 ч при 30 °C для отбора рекомбинантных клонов (плазмиды pLEXSY более стабильны в E. coli при 30 °C, чем при 37 °C).
- Скрининг на наличие вставки в плазмидах методом колонной ПЦР.
- Отбирают отдельные колонии, ресуспендируют в 20 мкл воды, не содержащей нуклеаз, нагревают при 95 °C в течение 15 мин и берут 1 мкл лизата в качестве матрицы ДНК для ПЦР колоний. Используйте прямой праймер для амплификации eGFP, описанный в шаге 1.1.2 (в данном примере EGFP1), и праймер A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACTACTACTAAAAAG-3') в качестве обратного праймера29.
- Праймер А264 предназначен для отжига 80.н. после стоп-кодона вставки в векторах экспрессии pLEXSY-2.1. В качестве примера для пары праймеров EGFP1 + A264 используют протокол циклирования ПЦР, состоящий из начальной денатурации 2 мин при 94 °С, за которыми следуют 30 циклов по 30 с при 94 °С, 30 с при 50 °С и 1 мин при 72 °С. Выполните заключительный этап удлинения продолжительностью 10 минут при температуре 72 °C. Праймеры добавляются в конечной концентрации 0,2 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый продукт, использующий этот набор праймеров, имеет длину 859.н. Участки отжига грунтовок EGFP1 и A264 изображены на рисунке 2.
- Подготавливают очищенную плазмидную ДНК из положительного клона для последующей трансфекции с помощью коммерческого набора для выделения плазмид или стандартного щелочного осаждения33. Используйте 50 мл ночной культуры при 30 °C для выделения не менее 10 мкг плазмидного/положительного клона.
- Обрежьте концы продукта eGFP-PCR с помощью BglII и KpnI, следуя инструкциям производителя.
2. Линеаризация плазмиды экспрессии pLEXSY
- Используйте не менее 10 мкг очищенной плазмиды pLEXSY-eGFP для расщепления с SwaI (сайт узнавания: 5'-ATTTAAAT-3'). Выдерживают в течение 3-4 ч при 25 °C и нагревают при 65 °C в течение 20 мин.
- Пропустите продукт сбраживания в электрофорезе агарозного геля, чтобы отделить полученные фрагменты. В результате этого разложения образуются два фрагмента: фрагмент массой 2,9 к..н., представляющий элементы, необходимые для репликации и отбора в E. coli, и фрагмент массой 7-8 тыс..н., представляющий линеаризованную экспрессионную кассету.
- Очистите кассету для сцеживания с помощью коммерческого набора для экстракции агарозным гелем.
3. Трансфекция L. panamensis и L. donovani методом электропорации
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование лейшмании проводится, как описано в другом месте34. В этом примере промастиготы L. panamensis и L . donovani культивировали в среде насекомых Шнайдера, добавляли 20% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 26 °C.
- Выращивайте культуры паразитов до тех пор, пока не накопится достаточное количество промастигот в логарифмической или ранней стационарной фазе, чтобы использовать примерно 4 x 107 паразитов за одну трансфекцию. Максимальная плотность клеток на культуральную колбу до достижения стационарной фазы может варьироваться в зависимости от вида Leishmania и того, насколько хорошо штаммы адаптированы к лабораторным условиям. При необходимости объедините содержимое нескольких колб с культурой.
- Центрифугируют культуру паразитов при 2 000 x g в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
- Ресуспендируйте гранулу в электропорационном буфере при 4 °C (21 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,7 мМNa2HPO4 и 6 мМ глюкозы; pH 7,5)27 до получения концентрации 1 x 108 паразитов/мл. Поставить на лед на 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием электропорационный буфер должен быть стерилизован путем фильтрации. - Параллельно с этим пробирки предварительного охлаждения с 2-10 мкг линеаризованного pLEXSY-eGFP конструируются в максимальном объеме 50 мкл воды или 10 мМ трис-буфера (pH 8,0) и электропорационных кюветах d = 2 мм.
- Добавьте в пробирку с линеаризованной плазмидой 350 мкл предварительно охлажденных паразитов и перенесите все 400 мкл в электропорационную кювету на льду. Параллельно электропорируют клетки паразита без плазмидной ДНК в качестве отрицательного контроля.
- Электропорация по одному из этих двух протоколов:
Экспоненциальный спад: 450 В, 450 мкФ, один импульс.
Постоянная времени: 450 В, T = 3,5 мс, один импульс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти протоколы были запущены с использованием коммерческого генератора генов (таблица материалов) с модулями PC и CE. - Поставьте кювету обратно на лед на 10 мин и перенесите электропорированных паразитов в 5 мл соответствующей питательной среды. В этом примере использовалась среда Шнайдера для насекомых, дополненная 20% (v/v) FBS. Инкубируют при 26 °C в течение 20 ч.
4. Поликлональный отбор в культуре
- Примерно через 20 ч после электропорации наблюдают за культурами под микроскопом. Не менее половины популяции паразитов должны демонстрировать визуально хорошую морфологию и подвижность (каплевидные промастиготы с осциллирующим жгутиком, движущимся по среде и/или образующим активные агрегаты паразита). Добавьте соответствующий селективный антибиотик в зависимости от используемой плазмиды pLEXSY. В данном примере используется pLEXSY-sat2.1, который содержит стрептотрицинацетилтрансферазу в качестве селекционного маркера. Поэтому используют нурсеотрицин в качестве селективного антибиотика в концентрации 0,1 мг/мл.
- Наблюдайте за посевами под микроскопом до тех пор, пока не будет видна четкая разница между паразитами, электропорированными с плазмидной ДНК и без нее.
- Проверьте флуоресценцию паразита с помощью проточной цитометрии.
- Центрифугу 1 мл культуры в неподвижной фазе при 2 000 x g в течение 3 мин при RT. Дважды промывают в PBS и повторно суспендируют конечную гранулу в 1 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция eGFP может быть обнаружена в канале FL1 большинства коммерческих цитометров. Настройки усиления для прямого и бокового рассеяния, а также канала FL1 могут различаться в зависимости от цитометра. Для этого примера был использован цитометр CyFlow space (Sysmex). - Запустите выборки, собрав 20 000 событий со скоростью 0,5 мкл/с, и установите значения усиления для каналов прямого рассеяния (FSC), бокового рассеяния (SSC) и флуоресценции 1 (FL-1) равными 225,0, 200,0 и 520,0 соответственно. Запустите контрольную выборку с нефлуоресцентными паразитами, чтобы определить популяцию паразитов на точечной диаграмме FSC и SSC.
- Создайте вентиль (G1), содержащий популяцию паразитов, и отфильтруйте канал FL-1 через этот вентиль для определения автофлуоресценции промастигот и установки вентили диапазона (G2) для канала FL-1.
- Запустите трансфицированных паразитов, чтобы проверить, есть ли флуоресценция. Запишите процент флуоресцентных паразитов в G1 и среднюю интенсивность флуоресценции в G2.
- Центрифугу 1 мл культуры в неподвижной фазе при 2 000 x g в течение 3 мин при RT. Дважды промывают в PBS и повторно суспендируют конечную гранулу в 1 мл PBS.
5. Подтверждение геномной интеграции
ПРИМЕЧАНИЕ: Интеграция экспрессионной кассеты pLEXSY-eGFP может быть подтверждена с помощью диагностической ПЦР с использованием прямой гибридизации праймера с экспрессионной кассетой (варьируется в зависимости от используемого вектора pLEXSY-2.1) и обратной гибридизации праймера F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACTACAGCTAC-3') с хромосомной ssu-фланговой последовательностью, отсутствующей в экспрессионной кассете. В этом примере прямой праймер F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') используется при гибридизации в экспрессионной кассете pLEXSY-sat2.1. Схематическое изображение интегрированной экспресс-кассеты и участков отжига праймера для диагностической ПЦР изображено на рисунке 2.
- Очистите геномную ДНК от 2-5 мл культуры паразитов в стационарной фазе с помощью обычной экстракции фенол/хлороформ35 или с помощью коммерческого набора.
- Выполните диагностическую ПЦР для pLEXSY-sat2.1 с использованием протокола циклирования, состоящего из начальной денатурации 2 мин при 94 °C, за которыми следуют 30 циклов по 30 с при 94 °C, 30 с при 53 °C и 1 мин при 72 °C. Выполните заключительный этап удлинения продолжительностью 10 минут при температуре 72 °C. Праймеры добавляются в конечной концентрации 0,2 мкМ.
Рисунок 2: Схематическое изображение интегрированной кассеты экспрессии. Прямоугольники, помеченные как Chr-S (серого цвета), представляют собой соседние хромосомные последовательности локуса 18S рРНК (ssu), в который интегрирована экспрессионная кассета. Интегрированная экспрессионная кассета состоит из 5'- и 3'-последовательностей (синий) для гомологичной рекомбинации в локус ssu , дополнительного рибосомного промотора Leishmania (красный) для усиленной продукции белка, гена eGFP (зеленый), гена-маркера отбора (желтый) и трех нетранслируемых областей (светло-серый), а именно utr1, 2 и 3, которые обеспечивают сигналы сплайсинга для посттранскрипционной обработки мРНК для оптимизации экспрессии eGFP и маркера отбора у паразитов Leishmania . Участки отжига прямых и обратных праймеров, используемых для проверки наличия вставки методом колонной ПЦР (шаг 1.2.5), отмечены черными стрелками, обозначенными как cpcr-fwd (праймер EGFP1) и cpcr-rev (праймер A264) соответственно, которые разграничивают продукт с молекулярной массой 859.н. Участки отжига прямых и обратных праймеров, используемых для верификации геномной интеграции с помощью диагностической ПЦР (шаг 5), отмечены черными стрелками, помеченными как sat-fwd (праймер F2999) и ssu-rev (праймер F3002) соответственно, которые разграничивают продукт 2,271.о. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
6. Клонирование путем предельного разбавления (опционально)
- После подтверждения флуоресценции методом проточной цитометрии готовят разведение рекомбинантных паразитов в концентрации пять промастигот/мл36.
- Добавьте 100 мкл этого разведения в каждую лунку 96-луночного планшета. Таким образом, планшеты засеваются со средней плотностью 0,5 промастиготы/лунку, что гарантирует, что в некоторые лунки попадет один паразит, сводя к минимуму вероятность наличия более одного паразита на лунку36.
- Оставьте тарелку нетронутой минимум на 12 часов. Следите за планшетом под микроскопом при минимальном увеличении 100x до тех пор, пока не будут обнаружены лунки с ростом паразитов.
- Когда лунка планшета заполнена паразитами, используйте содержимое для посева культуры объемом 5 мл. Это занимает 1-2 недели.
- Когда клонированные культуры достигнут стационарной фазы, проверьте флуоресценцию с помощью проточной цитометрии, как описано в шаге 4.3. Выберите клоны, которые будут использоваться для дальнейших анализов in vitro и in vivo на основе процентного содержания флуоресцентных паразитов и средней интенсивности флуоресценции, измеренной в канале FL-1. Стремитесь к клонам с 98%-99% флуоресцентных паразитов и выбирайте те, у которых самая высокая средняя интенсивность флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После построения конструкции pLEXSY-eGFP и трансформации компетентных клеток E. coli колонии, содержащие конструкцию со вставкой eGFP, будут генерировать продукт примерно 859.н. после проведения ПЦР колоний, описанной в разделе 1.2 (рис. 3A). При полном расщеплении очищенной плазмиды из позитивных колоний с помощью SwaI при гель-электрофорезе должны быть получены два характерных фрагмента: фрагмент массой 2,9 к..н., представляющий собой часть вектора PLEXSY, содержащий все необходимые элементы для репликации и селекции в E. coli, и фрагмент размером 7-8..н., представляющий собой линеаризованную экспрессионную кассету, используемую для трансфекции (рис. 3Б).
После трансфекции поликлональный отбор производится в основном качественно. Состояние культур паразитов во время отбора антибиотиками контролируется под микроскопом, обращая особое внимание на морфологию и подвижность паразитов. После успешного восстановления культуры трансфицированных паразитов в канале FL-1 проточного цитометра должны быть обнаружены те, которые эффективно экспрессируют eGFP (рис. 4А); Эффективность трансфекции может варьироваться у разных видов Leishmania . В этой работе после поликлональной селекции 98,44% паразитов L. donovani , проанализированных методом проточной цитометрии, были флуоресцентными по сравнению с 82,00% L. panamensis (рис. 4B). Если экспрессионная кассета pLEXSY-eGFP была успешно интегрирована в локус ssu , то после проведения диагностической ПЦР, описанной в разделе 5 (рис. 4C), следует наблюдать продукт с молекулярной массой 2,3 кбит/. Эти результаты гарантируют, что будут получены рекомбинантные паразиты, которые конститутивно экспрессируют eGFP в виде интегрированного трансгена и будут оставаться стабильными в последующих пассажах культуры паразитов.
Клонирование путем предельного разведения позволяет обогащать популяцию флуоресцентных паразитов с более низкой эффективностью трансфекции, таких как L. panamensis, а также отбирать клоны с самой высокой интенсивностью флуоресценции. Для каждого из использованных в работе видов Leishmania было получено по четыре клона (табл. 1): Lpan-A7, F11, F12 и H2 для L. panamensis, и Ldon-C1, G4, F2 и H1 для L. donovani. Клоны с наибольшим процентом флуоресцентных паразитов (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16%) и средняя интенсивность флуоресценции (Lpan-F11 = 35,63 относительных единиц флуоресценции [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) были отобраны для дальнейшего использования в скрининговых анализах лекарственных средств.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты подготовки конструкции pLEXSY-eGFP к трансфекции. (A) Репрезентативные результаты ПЦР колонии. Дорожка 1: лестничная лестница размером 1 кб (блоки в парах оснований); дорожки 2, 10 и 12: отрицательные образцы на наличие вставки eGFP; дорожки 3-9 и 13-14: положительные пробы на наличие вставки eGFP. (B) Результаты линеаризации с помощью лестницы SwaI. Lane 1: 1 kb (единицы в парах оснований); дорожки 2-4: реакции пищеварения плазмид, очищенных от трех различных колоний, положительные на наличие вставки eGFP. Наблюдаются фрагмент массой 2,9 кбит/с, представляющий элементы, необходимые для репликации и селекции у E. coli, и фрагмент массой 7-8 кбит/, представляющий линеаризованную экспрессионную кассету. Оба геля готовили при агарозной концентрации 1%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты подтверждения экспрессии eGFP и хромосомной вставки экспрессионной кассеты . (A) Гистограмма проточной цитометрии в канале FL-1. Красный: клетки дикого типа без eGFP; Синий цвет: трансфицированные паразиты L. panamensis , экспрессирующие eGFP у 82,00% популяции. (B) Сравнение результатов трансфекции между L. panamensis (Lpan-1) и L. donovani (Ldon-1). Более высокая эффективность трансфекции наблюдалась у L. donovani (98,44%), чем у L. panamensis (82,00%) после поликлональной селекции. (C) Результаты ПЦР для подтверждения геномной интеграции. L: лестница 100.н. (единицы в парах оснований); дорожки 1-4: образцы из четырех различных клонов L. panamensis , демонстрирующие характерный продукт 2,3 кбит/для интеграции pLEXSY-sat2.1 в локус ssu . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Вид | Клонирование кода | Процентное содержание флуоресцентных паразитов | Средняя интенсивность флуоресценции* |
| Л. панаменсис | ЛПАН-А7 | 90.00 | 24.70 |
| ЛПАН-Ф11 | 95.74 | 35.63 | |
| ЛПАН-Ф12 | 92.85 | 34.44 | |
| ЛПАН-Н2 | 85.00 | 20.66 | |
| Л. доновани | Лдон-С1 | 99.16 | 14.12 |
| Лдон-Г4 | 99.21 | 13.96 | |
| Лдон-Ф2 | 97.96 | 11.67 | |
| Лдон-Н1 | 98.97 | 12.90 |
Таблица 1: Клоны, полученные путем предельного разведения. Четыре клона были получены путем предельного разведения для каждого из видов Leishmania , использованных в данной работе. Для каждого клона указывается процентное содержание флуоресцентных паразитов и средняя интенсивность флуоресценции. *Флуоресценция выражается в относительных единицах флуоресценции (РФС).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества и недостатки различных репортерных генов были изучены у нескольких простейших паразитов. Среди них GFP и eGFP по своей природе флуоресцентны и позволяют легко проводить количественную оценку и визуализацию. Флуоресцентная активность этих белков может быть обнаружена с минимальными манипуляциями с помощью флуоресцентной микроскопии, флуориметрии или проточной цитометрии. Было проведено мало исследований по генерации GFP-экспрессирующей L. (Viannia), несмотря на продемонстрированную устойчивость GFP и их производных в качестве репортерных генов у видов Leishmania Старого Света 15,16,18,24. Varela et al.37 разработали штаммы L. panamensis, которые экспрессируют GFP в качестве эписомального трансгена. Анализ проточной цитометрии как аксенических промастигот, так и внутриклеточных амастигот показал полезность этих паразитов для скрининговых анализов лекарственных препаратов. Однако флуоресценция была очень неоднородной, а количество флуоресцентных паразитов в трансфицированной популяции зависело от постоянного селективного давления антибиотиком туникамицином. Эти факты ограничивают использование этих паразитов в качестве внутриклеточных амастигот для скрининговых анализов на наркотики, учитывая, что туникамицин не может быть добавлен к инфицированным макрофагам38, в результате чего паразиты с низкой флуоресценцией присутствуют в популяции внутриклеточных амастигот, что может повлиять на количественную оценку инфицированных макрофагов.
Использование таких векторов, как pLEXSY, представляет собой мощный и надежный инструмент для стабильной модификации паразитов вида Leishmania путем интеграции трансгенов посредством гомологичной рекомбинации28. Кассета pLEXSY интегрирована в локус 18S рРНК (ssu), транскрипция которого находится под контролем сильного промотора РНК-полимеразы I, что приводит к более высокой скорости транскрипции20. Доказано, что использование этой системы обеспечивает стабильную и однородную экспрессию целевого белка27. Эти характеристики благоприятствуют экспрессии eGFP и его использованию во внутриклеточных анализах с однородными уровнями флуоресценции в инфицированных клетках, а также его использованию для экспериментальных инфекций на мышиных моделях. Семейство векторов pLEXSY-2.1, используемое в этом протоколе, было разработано с дополнительным рибосомным промотором Leishmania перед экспрессионной кассетой, усиливающим продукцию белка29,30.
В этом протоколе есть несколько важных шагов для получения оптимальных результатов. Во-первых, клонирование гена-мишени должно быть выполнено с использованием высокоточной полимеразы33, а расщепление целевой ДНК и вектора экспрессии должно быть выполнено с использованием протокола последовательного расщепления при использовании комбинации BglII/KpnI для клонирования. Последнее связано с тем, что не существует буфера, в котором BglII и KpnI проявляют оптимальную активность, хотя оба фермента оптимально активны при одинаковой температуре (37 °C). Во-вторых, отбор рекомбинантных клонов после трансформации в E. coli следует проводить при 30 °С, так как плазмиды pLEXSY более стабильны при этой температуре у E. coli28,29. Кроме того, темпы роста L. panamensis и L. donavani могут быть совершенно разными. Во время проведения экспериментов, описанных в этой статье, L. panamensis обычно дольше достигал стационарной фазы. Темпы роста также могут варьироваться от штамма к штамму в разных лабораториях; Поэтому для оценки времени, необходимого для достижения концентрации паразита, необходимой для электропорации, необходимо охарактеризовать скорости роста лабораторных штаммов. Использование буфера, о котором сообщили Bolhassani et al.27, для электропорации является важной модификацией, которая значительно увеличивает выживаемость электропорированных паразитов по сравнению с прямой электропорацией в питательной среде, как это было предложено в оригинальном протоколе Jena Bioscience. При поликлональной селекции крайне важно не допустить перерастания электропорированных культур перед добавлением селективного антибиотика; В противном случае нерекомбинантные паразиты перерастут рекомбинантных27. Потребуется один или два последовательных прохода (посев 1:10) в свежую среду с соответствующим антибиотиком, чтобы получить мутную культуру устойчивых к антибиотикам рекомбинантных паразитов и четкий отрицательный контроль. Пассажи должны быть сделаны в течение 5 дней после первого добавления антибиотика. Наконец, существуют заметные различия в эффективности трансфекции и интеграции экспрессионной кассеты pLEXSY между L. panamensis и L. donovani24,37. В то время как у L. donovani почти 98% всей популяции, проанализированной с помощью проточной цитометрии, после поликлональной селекции показывают флуоресценцию, у L. panamesis процент флуоресцентных паразитов составляет около 80%. По этой причине факультативный этап клонирования путем ограничения разведения является модификацией, которая в основном требуется для получения популяции L. panamensis, в которой более 95% паразитов, анализируемых с помощью проточной цитометрии, являются флуоресцентными. Использование плазмид pLEXSY ограничено геномной модификацией видов Leishmania, поскольку изначально они были разработаны для использования L. tarentolae в качестве платформ для продуцирования белка28. Несмотря на то, что было доказано, что pLEXSY работает у нескольких видов Leishmania, отличных от L. tarentolae21,24,27, важно проверить сохранность последовательности ssu при работе с новым видом Leishmania, чтобы убедиться, что сайты рекомбинации в плазмиде pLEXSY будут работать.
Метод, описанный в этой статье, позволяет производить рекомбинантных паразитов Leishmania с конститутивной и стабильной экспрессией eGFP или любого другого интересующего нас репортера. У этих паразитов флуоресценция однородна, и она поддерживается во внутриклеточных формах. Таким образом, штаммы, полученные в ходе этого процесса, могут быть использованы для стандартизации высокопроизводительных скрининговых анализов лекарственных средств для оценки потенциальной антилейшманийной активности молекул природного и синтетического происхождения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Национальным секретарем науки, технологий и инноваций (SENACYT), Панама, номер гранта NI-177-2016, и Sistema Nacional de Investigación (SNI), Панама, номера грантов SNI-169-2018, SNI-008-2022 и SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
