Summary
במאמר זה נתאר את המתודולוגיה ששימשה ליצירת הזנים L. panamensis ו-L . donovani המבטאים את הגן ל-eGFP כטרנסגן משולב יציב באמצעות מערכת pLEXSY. טפילים נגועים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר בשני המינים נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות.
Abstract
טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס , מחלה בעלת ביטויים קליניים משתנים המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם. זיהום עם L. donovani יכול לגרום למחלה קרבית קטלנית. בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, L. panamensis אחראי לרוב המקרים המדווחים של לישמניאזיס עורית ורירית. לימוד מספר רב של מועמדים לתרופות עם המתודולוגיות הזמינות עד כה הוא די קשה, בהתחשב בכך שהם מייגעים מאוד להערכת הפעילות של תרכובות נגד צורות תאיות של הטפיל או לביצוע בדיקות in vivo . בעבודה זו אנו מתארים את הדור של הזנים L. panamensis ו-L. donovani עם ביטוי מכונן של הגן המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) המשולב בלוקוס המקודד ל-18S rRNA (ssu). הגן המקודד eGFP התקבל מווקטור מסחרי והוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להעשיר אותו ולהוסיף אתרי הגבלה לאנזימים BglII ו-KpnI. האמפליקון eGFP בודד על ידי טיהור ג'ל אגרוז, עוכל עם האנזימים BglII ו-KpnI, ונקשר לווקטור ביטוי הלישמניה pLEXSY-sat2.1 שעוכל בעבר עם אותה קבוצה של אנזימים. וקטור הביטוי עם הגן המשובט הופץ ב- E. coli, מטוהר, ונוכחות העלון אומתה על ידי PCR המושבה. הפלסמיד המטוהר היה ליניארי ושימש להעברת טפילי L. donovani ו - L. panamensis. שילוב הגן אומת על ידי PCR. הביטוי של הגן eGFP הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. טפילים פלואורסצנטיים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר נבחרו באמצעות ציטומטריית זרימה.
Introduction
טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס, מחלה בעלת מגוון רחב של ביטויים קליניים. מחלה זו נפוצה ב-98 מדינות, ושכיחותה השנתית נאמדת ב-0.9 עד 1.6 מיליון מקרים1. מיני לישמניה שהם פתוגניים לבני אדם מחולקים לשני תת-סוגים, כלומר L. (לישמניה) ול'. (ויאניה). זיהום עם כמה מינים השייכים L. תת-סוג (לישמניה), כגון L. donovani ו-L. infantum, עלול לגרום ללישמניאזיס ויסצרלי (VL), שהוא קטלני אם אינו מטופל2. מינים השייכים ל- L. תת-סוג (Viannia) קשור לרוב המקרים של לישמניאזיס עורי (CL) ולישמניאזיס רירית (MCL) במרכז ודרום אמריקה, במיוחד בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, כאשר L. panamensis הוא הסוכן האטיולוגי העיקרי של מצגות קליניות אלה 3,4.
כימותרפיה קיימת נגד לישמניה הכוללת תרופות כגון אנטימוניאלים מחומשים, מילטפוסין ואמפוטריצין B היא רעילה מאוד ויקרה. יתר על כן, עמידות מוגברת לתרופות בעשורים האחרונים נוספה לגורמים המפריעים לטיפול יעיל בחולים ברחבי העולם5. הבדלים משמעותיים הודגמו בין מינים בסוג לישמניה ביחס לרגישות לתרופות, במיוחד בין מינים בעולם החדש והישן 6,7. מסיבות אלה, יש צורך להפנות מאמצים לזיהוי ופיתוח של תרופות חדשות נגד לישמניה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לגישות ספציפיות למינים. לימוד ספריות גדולות של מועמדים לתרופות עם מתודולוגיות מסורתיות הוא די קשה, בהתחשב בכך מתודולוגיות אלה הם מאוד מייגע להערכת הפעילות של תרכובות נגד amastigotes תאית או לביצוע ניסויים in vivo 8; לכן, היה צורך לפתח טכניקות חדשות המפחיתות חסרונות אלה, כולל יישום גנים של כתב ופיתוח בדיקות סינון פנוטיפיות בעלות תוכן גבוה9.
השימוש בגנים של כתבים הראה את הפוטנציאל להגביר את היעילות של תהליך סינון התרופות מכיוון שהוא מאפשר פיתוח של מבחני תפוקה גבוהה ו- in vivo. טפילי לישמניה רקומביננטיים המבטאים מספר גנים של כתבים נוצרו על ידי קבוצות מחקר שונות. גנים עיתונאיים, כגון β-גלקטוזידאז, β-לקטמאז ולוציפראז, הוכנסו למספר מיני לישמניה באמצעות וקטורים אפיזומליים, והראו תועלת מוגבלת לבדיקת תרופות בצורות חוץ-תאיות ותוך-תאיות של הטפיל 10,11,12,13,14,15. גישות אלה יש את המגבלה של דרישת לחץ סלקטיבי חזק בתרבית כדי למנוע חיסול של המבנה האפיזומלי, כמו גם את השימוש בריאגנטים נוספים כדי לחשוף את הפעילות של הגן המדווח. לעומת זאת, החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) וגרסתו, החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (eGFP), שימשו ביצירת מספר רב של זני לישמניה טרנסגניים לבדיקות סקר תרופות חוץ גופיות בשל גמישותם ורגישותם, כמו גם האפשרות להפוך את תהליך הסינון לאוטומטי באמצעות ציטומטריית זרימה או פלואורומטריה15, 16,17,18,19. למרות התוצאות המבטיחות, תרביות של זנים טרנסגניים אלה היו הטרוגניות מאוד ברמות הפלואורסצנטיות שלהם, שכן מספר העותקים של הגן GFP לא היה זהה בכל הטפילים. יתר על כן, שמירה על פלואורסצנטיות דרשה לחץ סלקטיבי מתמיד על הטפילים בתרבית, שכן הגן GFP הוכנס במבנה אפיזומלי.
מהסיבות שצוינו קודם לכן, מאמצים רבים התמקדו בפיתוח מתודולוגיות חדשות לייצור זנים רקומביננטיים יציבים. מאמצים אלה הסתמכו בעיקר על שילוב של גנים מדווחים לתוך loci ריבוזומלי, תוך ניצול שיעורי השעתוק הגבוהים יותר של גנים ריבוזומליים20. זנים של L. infantum ו- L. amazonensis נוצרו לאחר ששילבו את הגנים המקודדים עבור β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 ו- tdTomato23, והם הוערכו על יעילותם בבדיקות סינון תרופות. קבוצות שונות פיתחו זני L. donovani המבטאים GFP באופן קונסטיטוטיבי על ידי שילוב גן הקידוד שלו בלוקוס RNA ריבוזומלי 18S (ssu locus) באמצעות רקומבינציה הומולוגית24,25; הם הראו ביטוי GFP יציב והומוגני באוכלוסייה הנגועה, כולל אמסטיגוטים תוך-תאיים 24,25, והם יושמו בהצלחה בבדיקות סקר תרופות24,25,26. Bolhassani et al.27 פיתחו זנים של L. major ו- L. infantum המבטאים GFP כטרנסגן משולב. הם השתמשו בווקטור האינטגרציה pLEXSY, שתוכנן במקור עבור ביטוי מהונדס של חלבונים במערכת באמצעות L. tarentolae כמארח28. וקטור pLEXSY-GFP הוכח כיעיל מאוד ליצירת זני לישמניה שונים המבטאים באופן מכונן GFP 24,25,27,29,30. בטפילים אלה, פלואורסצנטיות היא הומוגנית ומתוחזקת בצורות תוך תאיות, להיות מסוגל להיות מזוהה נגעים כרית רגל של עכברים נגועים27.
בעבודה זו, אנו מתארים את המתודולוגיה המשמשת ליצירת זנים L. panamensis ו- L. donovani המבטאים את הגן המקודד ל- eGFP כטרנסגן משולב באמצעות מערכת pLEXSY. הזנים הנוצרים בתהליך זה משמשים במעבדה שלנו לביצוע בדיקות סינון תרופות המעריכות את הפעילות האנטי-לישמניה הפוטנציאלית של מולקולות ממקור טבעי וסינתטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כדי לשמור על הדגימות סטריליות, כל השלבים הכוללים תרבית טפילים צריכים להתבצע בתוך מכסה מנוע ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) או על פי תקנות הבריאות והבטיחות המקומיות. סיכום גרפי של פרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.
איור 1: סכמה מסכמת של הפרוטוקול ליצירת טפילי L. panamensis ו-L. donovani המבטאים eGFP באמצעות משפחת הווקטורים pLEXSY-2.1. כל ששת הסעיפים העיקריים המתוארים במאמר מתוארים כאן. 1) הגברה והחדרה של הגן eGFP לווקטור pLEXSY-2.1: גן המטרה מוגבר, ומוסיף את אתרי הזיהוי של האנזימים KpnI ו- BglII, וגם אמפליקון eGFP וגם פלסמיד pLEXSY מתעכלים ברצף עם שני האנזימים לקשירה עוקבת עם ליגאז T4. 2) ליניאריזציה של פלסמיד ביטוי pLEXSY: מבנה pLEXSY + eGFP מתעכל עם SwaI לליניאריזציה וטיהור של קלטת ביטוי 7-8 kbp. 3) טרנספקציה 4) ברירה רב-שבטית: פרומסטיגוטות לישמניה מועברות בקלטת הביטוי על ידי אלקטרופורציה ומוחזרות לתרבית לבחירת אנטיביוטיקה של טפילים רקומביננטיים. פלואורסצנטיות הטפיל מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה. 5) אישור אינטגרציה גנומית 6) שיבוט על ידי הגבלת דילול: אינטגרציה של קלטת הביטוי pLEXSY-eGFP מאושרת על ידי PCR אבחנתי, באמצעות הכלאה של פריימר קדמי לקלטת הביטוי והכלאה של פריימר הפוך לרצף כרומוזומלי הנעדר בקלטת הביטוי. תרביות נגועות יכולות להיות מועשרות עבור טפילים פלואורסצנטיים על ידי שיבוט על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים עם עוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות הגבוהות ביותר ניתן לבחור ליישומים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
1. הגברה והחדרה של הגן eGFP לווקטור pLEXSY-2.1
- הגברה של הגן eGFP
הערה: מכיוון שפרוטוקול זה משתמש במשפחת הווקטורים pLEXSY-2.1 (ראה טבלת חומרים) לביטוי מכונן של חלבוני מטרה בעקבות שילוב קלטת הביטוי לתוך מוקד rRNA כרומוזומלי 18S (ssu) של מיני לישמניה , הצעד הראשון הוא להכניס לגן eGFP את הרצפים המכילים את אתרי ההגבלה המאפשרים את הכנסתו לווקטורים pLEXSY-2.1. במקרה זה, מכיוון ש-eGFP נדרש להתבטא רק באופן ציטוסולי, אתרי ההגבלה של האנזימים BglII ו-KpnI נוספו בקצוות 5' ו-3' של הגן eGFP, בהתאמה. שיבוט עם KpnI גורם לאיחוי של חלבון המטרה לתג פוליהיסטידין C-terminal של שש שאריות, ואחריו קודון עצירה המקודד בפלסמיד pLEXSY-2.1 לטיהור נוסף של החלבון המעניין. מסיבה זו, רצף הפריימר ההפוך אינו מכיל קודון עצירה.- בהתאם למקור הפלסמיד עבור eGFP, נתח את רצף המטרה באמצעות כלי ניתוח הגבלה כגון NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 כדי לוודא שהוא אינו מכיל אתרים פנימיים עבור אנזימי הגבלה המשמשים לשיבוט (BglII ו - KpnI) או עבור SwaI, שהוא האנזים המשמש לליניאריזציה וקטורית לפני טרנספקציה.
- תכננו פריימרים קדימה ואחורה להגברה eGFP המכילים את רצפי ההגבלה BglII ו-KpnI. לדוגמה, מקור ה-eGFP לפרוטוקול זה היה פלסמיד32 pEGFP-N1-1X, ורצפי הפריימר היו אלה שדווחו על ידי Bolhassani et al.27:
פריימר קדמי (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (אתר הגבלת BglII מודגש).
פריימר הפוך (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (אתר הגבלת KpnI מודגש). - להגביר את גן המטרה באמצעות פולימראז באיכות גבוהה כדי להבטיח את שימור רצף הקידוד. לדוגמה, עבור פריימרים EGFP1 ו- EGFP2, הפעל את פרוטוקול מחזור PCR כפי שדווח על ידי Bolhassani et al.27. הפעל דנטורציה ראשונית של 2 דקות ב- 94 ° C, ואחריה 30 מחזורים של 30 שניות ב- 94 °C, 30 שניות ב- 57 °C ודקה אחת ב- 72 °C. הפעל שלב הארכה אחרון של 10 דקות ב- 72 ° C. מוסיפים את הפריימרים בריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
- לטהר את הקטע באמצעות ערכת טיהור מוצר PCR קונבנציונלית, או משקעים סטנדרטיים של נתרן אצטט ואתנול, כמתואר במקום אחר33.
- הכנסת eGFP לווקטור הביטוי pLEXSY-2.1
- חתוך את הקצוות של מוצר eGFP-PCR באמצעות BglII ו - KpnI, בהתאם להוראות היצרן.
- ראשית, הגדר את התגובה עבור האנזים הדורש את ריכוז המלח הנמוך ביותר (במקרה זה, KpnI), על פי הוראות היצרן, ודגר ב 37 ° C במשך 1 שעות.
- לאחר מכן, להוסיף 100 mM NaCl ו 10 יחידות של BglII ולדגור במשך 15 דקות. לטהר את התגובה, כמתואר בשלב 1.1.4.
- עכל את וקטור ביטוי pLEXSY עם BglII ו - KpnI, בהתאם לפרוטוקול העיכול הרציף המתואר בשלב 1.2.1.
- קשר את וקטור pLEXSY ואת הגן eGFP עם ליגאז T4 באמצעות יחס מולארי של 1:3 (וקטור:insert). הוסף בקצרה 100 ng של pLEXSY מעוכל ו 28 ng של מוצר eGFP מעוכל לתגובה של 20 μL המכילה חיץ ליגאז בריכוז סופי של 1x ו -3 יחידות של ליגאז T4 DNA. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
- התמירו תאי E. coli מתאימים, כגון XL-10, DH5α או DH10B, עם מוצר הקשירה שהתקבל בשלב 1.2.3 באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים33. צלחת את התאים מותמרים באגר Luira-Bertani (LB)-ampicillin ולדגור במשך 24 שעות ב 30 ° C כדי לבחור שיבוטים רקומביננטיים (פלסמידים pLEXSY יציבים יותר E . coli ב 30 ° C מאשר ב 37 ° C).
- מסך לנוכחות של הכנס פלסמידים על ידי PCR מושבה.
- בחרו מושבות בודדות, השהו מחדש ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, חממו ב-95°C למשך 15 דקות, וקחו 1 μL של הליזט כתבנית DNA עבור PCR מושבה. השתמש בפריימר קדימה להגברת eGFP, המתואר בשלב 1.1.2 (בדוגמה זו, EGFP1), ובפריימר A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') כפריימר הפוך29.
- הפריימר A264 מתוכנן לאשל 80 bp לאחר קודון העצירה של ההוספה בווקטורי ביטוי pLEXSY-2.1. לדוגמה, עבור זוג הפריימר EGFP1 + A264, השתמש בפרוטוקול מחזור PCR המורכב מדנטורציה ראשונית של 2 דקות ב- 94 ° C, ואחריה 30 מחזורים של 30 שניות ב- 94 ° C, 30 s ב- 50 ° C ודקה אחת ב- 72 ° C. הפעל שלב הארכה אחרון של 10 דקות ב- 72 ° C. הפריימרים מתווספים בריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
הערה: המוצר הצפוי בשימוש בערכת פריימר זו הוא באורך 859 bp. אתרי החישול של הפריימרים EGFP1 ו-A264 מתוארים באיור 2.
- הכן את DNA פלסמיד מטוהר משיבוט חיובי עבור transfection הבא באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מסחרית או משקעים אלקליין סטנדרטי33. השתמש 50 מ"ל של תרבית לילה ב 30 ° C לבידוד של מינימום של 10 מיקרוגרם של שיבוט פלסמיד/חיובי.
- חתוך את הקצוות של מוצר eGFP-PCR באמצעות BglII ו - KpnI, בהתאם להוראות היצרן.
2. ליניאריזציה של פלסמיד ביטוי pLEXSY
- השתמש לפחות 10 מיקרוגרם של פלסמיד pLEXSY-eGFP מטוהר לעיכול עם SwaI (אתר זיהוי: 5'-ATTTAAAT-3). יש לעכל במשך 3-4 שעות ב-25°C ולהשבית בחום ב-65°C למשך 20 דקות.
- הפעל את מוצר העיכול באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי להפריד את השברים המתקבלים. עיכול זה ייצור שני פרגמנטים, מקטע 2.9 kbp המייצג את האלמנטים הדרושים לשכפול ובחירה ב- E. coli, ומקטע 7-8 kbp המייצג את קלטת הביטוי הליניארית.
- לטהר את קלטת הביטוי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל אגרוז מסחרית.
3. טרנספקציה של L. panamensis ו L. donovani על ידי electroporation
הערה: תרבות הלישמניה מבוצעת כמתואר במקום אחר34. בדוגמה זו, L. panamensis ו-L . donovani promastigotes תורבתו בתווך החרקים של שניידר, בתוספת 20% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, והודגרו בטמפרטורה של 26°C.
- לגדל את תרביות הטפילים עד שיש מספיק promastigotes בשלב לוג או בשלב נייח מוקדם להשתמש בערך 4 x 107 טפילים לכל transfection. צפיפות התאים המרבית לבקבוק תרבית לפני ההגעה לשלב הנייח עשויה להשתנות בהתאם למין הלישמניה ועד כמה הזנים מותאמים לתנאי המעבדה. אגרו את התוכן של צלוחיות תרבית מרובות במידת הצורך.
- צנטריפוגה את תרבית הטפיל ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- יש להשהות מחדש את הגלולה בחיץ אלקטרופורציה בטמפרטורה של 4°C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4 ו-6 mM גלוקוז; pH 7.5)27 כדי לקבל ריכוז של 1 x 108 טפילים/מ"ל. לשים על קרח במשך 10 דקות.
הערה: יש לעקר את מאגר האלקטרופורציה על-ידי סינון לפני השימוש. - במקביל, צינורות pre-chill עם 2-10 מיקרוגרם של pLEXSY-eGFP ליניארי לבנות בנפח מרבי של 50 μL של מים או 10 mM tris buffer (pH 8.0) ו electroporation cuvettes של d = 2 מ"מ.
- הוסף 350 μL של טפילים מקוררים מראש לצינור עם פלסמיד ליניארי ולהעביר את כל 400 μL לקובט electroporation על קרח. במקביל, אלקטרופורציה תאי הטפיל ללא DNA פלסמיד כבקרה שלילית.
- אלקטרופורט באמצעות אחד משני הפרוטוקולים הבאים:
דעיכה מעריכית: 450 V, 450 μF, פעימה אחת.
קבוע זמן: 450 V, T = 3.5 אלפיות השנייה, פעימה אחת.
הערה: פרוטוקולים אלה הופעלו באמצעות פולסר גנים מסחרי (Table of Materials) עם מודולי PC ו-CE. - מחזירים את הקובט לקרח למשך 10 דקות ומעבירים את הטפילים המחושמלים ל-5 מ"ל של מדיום התרבית המתאים. דוגמה זו השתמשה בתווך החרקים של שניידר בתוספת FBS של 20% (v/v). לדגור ב 26 ° C במשך 20 שעות.
4. ברירה רב-שבטית בתרבית
- כ-20 שעות לאחר ההתחשמלות, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ. לפחות מחצית מאוכלוסיית הטפילים צריכה להראות מורפולוגיה ותנועתיות טובות מבחינה חזותית (פרומסטיגוטים דמויי טיפות עם שוטונים מתנדנדים הנעים במדיה ו/או יוצרים אגרגטים פעילים של טפילים). הוסף את האנטיביוטיקה הסלקטיבית המתאימה בהתאם לפלסמיד pLEXSY בשימוש. בדוגמה זו, pLEXSY-sat2.1 משמש, המכיל סטרפטוטריצין אצטילטרנספראז כסמן בחירה. לכן, השתמש nourseothricin כאנטיביוטיקה סלקטיבית בריכוז 0.1 מ"ג / מ"ל.
- עקבו אחר התרביות באופן מיקרוסקופי עד שנראה הבדל ברור בין הטפילים שהתחשמלו עם ובלי DNA פלסמיד.
- אמת את פלואורסצנטיות הטפיל באמצעות ציטומטריית זרימה.
- צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבית השלב הנייח ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. לשטוף פעמיים PBS ולהשעות מחדש את הגלולה הסופית ב 1 מ"ל של PBS.
הערה: ניתן לזהות את הפלואורסצנטיות של eGFP בערוץ FL1 של רוב הציטומטרים המסחריים. השג הגדרות עבור פיזור קדימה וצדדי, וערוץ FL1 עשוי להשתנות בין ציטומטרים. עבור דוגמה זו, נעשה שימוש בציטומטר מרחב CyFlow (Sysmex). - הפעל את הדגימות, תוך איסוף 20,000 אירועים במהירות של 0.5 μL/s, והגדר את ערכי הרווח עבור ערוצי הפיזור קדימה (FSC), פיזור הצד (SSC) והפלואורסצנטיות 1 (FL-1) כ- 225.0, 200.0 ו- 520.0, בהתאמה. הפעל דגימת ביקורת עם טפילים שאינם פלואורסצנטיים כדי לקבוע את אוכלוסיית הטפילים בתרשים נקודות FSC לעומת SSC.
- צור שער (G1) המכיל את אוכלוסיית הטפילים וסנן את תעלת FL-1 דרך שער זה לצורך קביעת האוטופלואורסצנטיות של פרומסטיגוטים וקביעת שער טווח (G2) עבור ערוץ FL-1.
- הפעל את הטפילים הנגועים כדי לוודא אם יש פלואורסצנטיות. רשום את אחוז הטפילים ב- G1 שהם פלואורסצנטיים ואת הממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות ב- G2.
- צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבית השלב הנייח ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. לשטוף פעמיים PBS ולהשעות מחדש את הגלולה הסופית ב 1 מ"ל של PBS.
5. אישור אינטגרציה גנומית
הערה: ניתן לאשר שילוב של קלטת הביטוי pLEXSY-eGFP על ידי PCR אבחנתי, באמצעות הכלאה של פריימר קדמי לקלטת הביטוי (משתנה בהתאם לווקטור pLEXSY-2.1 בשימוש) והכלאה של פריימר הפוך F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') לרצף כרומוזומלי של איגוף ssu, הנעדר בקלטת הביטוי. בדוגמה זו, הפריימר F2999 קדימה (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') משמש להכלאה בקסטת הביטוי pLEXSY-sat2.1. ייצוג סכמטי של קלטת הביטוי המשולבת ואתרי חישול פריימר עבור PCR אבחוני מתואר באיור 2.
- לטהר את הדנ"א הגנומי מ 2-5 מ"ל של תרבית טפיל בשלב נייח על ידי מיצוי פנול / כלורופורם קונבנציונאלי35 או עם ערכה מסחרית.
- בצע את ה- PCR האבחנתי עבור pLEXSY-sat2.1 באמצעות פרוטוקול רכיבה על אופניים המורכב מדנטורציה ראשונית של 2 דקות ב- 94 מעלות צלזיוס, ואחריה 30 מחזורים של 30 שניות ב- 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב- 53 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב- 72 מעלות צלזיוס. הפעל שלב הארכה אחרון של 10 דקות ב- 72 ° C. הפריימרים מתווספים בריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
איור 2: ייצוג סכמטי של קלטת הביטוי המשולבת. תיבות המסומנות כ-Chr-S (אפור) מייצגות את הרצפים הכרומוזומליים הסמוכים של מוקד ה-rRNA 18S (ssu) שבו משולבת קלטת הביטוי. קלטת הביטוי המשולבת מורכבת מרצפים של 5' ו-3' (כחול) עבור רקומבינציה הומולוגית לתוך לוקוס ssu , מקדם ריבוזומלי נוסף של לישמניה (אדום) לייצור חלבון משופר, גן eGFP (ירוק), גן סמן ברירה (צהוב), ושלושה אזורים לא מתורגמים (אפור בהיר), כלומר utr1, 2 ו-3, המספקים את אותות השחבור לעיבוד mRNA לאחר שעתוק לביטוי אופטימלי של eGFP וסמן הבחירה בטפילי לישמניה . אתרי חישול עבור פריימרים קדימה ואחורה המשמשים לאימות נוכחות ההוספה על ידי PCR מושבה (שלב 1.2.5) מסומנים על ידי החיצים השחורים המסומנים כ- cpcr-fwd (פריימר EGFP1) ו- cpcr-rev (פריימר A264) בהתאמה, התוחמים מוצר של 859 bp. אתרי החישול של פריימרים קדימה ואחורה המשמשים לאימות אינטגרציה גנומית על ידי PCR אבחוני (שלב 5) מסומנים בחצים השחורים המסומנים כ-sat-fwd (פריימר F2999) ו-ssu-rev (פריימר F3002), בהתאמה, התוחמים מוצר של 2,271 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
6. שיבוט על ידי הגבלת דילול (אופציונלי)
- לאחר אישור פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטריית זרימה, יש להכין דילול של טפילים רקומביננטיים בריכוז של חמישה פרומסטיגוטים/מ"ל36.
- הוסף 100 μL של דילול זה לתוך כל באר של צלחת 96 באר. באופן זה, הלוחות נזרעים בצפיפות ממוצעת של 0.5 פרומסטיגוטות/באר, מה שמבטיח שחלק מהבארות יקבלו טפיל בודד תוך מזעור ההסתברות ליותר מטפיל אחד לכל באר36.
- השאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך 12 שעות לפחות. עקבו אחר הצלחת באופן מיקרוסקופי בהגדלה מינימלית של פי 100 עד לגילוי בארות עם צמיחת טפילים.
- כאשר צלחת מלאה בטפילים, השתמש בתוכן כדי לחסן תרבית 5 מ"ל. זה לוקח 1-2 שבועות.
- כאשר תרביות זרעי שיבוט מגיעות לשלב הנייח, אמת פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטריית זרימה, כמתואר בשלב 4.3. בחר את השיבוטים שישמשו לבדיקות מבחנה ו- in vivo נוספות בהתבסס על אחוז הטפילים הפלואורסצנטיים ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת שנמדדה בערוץ FL-1 . כוונו לשיבוטים עם 98%-99% של טפילים פלואורסצנטיים ובחרו את אלה עם עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הגבוהה ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר בניית מבנה pLEXSY-eGFP והפיכת תאי E. coli מוכשרים, מושבות המכילות את המבנה עם תוספת eGFP יפיקו תוצר של כ- 859 bp לאחר הפעלת PCR המושבה המתואר בסעיף 1.2 (איור 3A). עיכול כולל של הפלסמיד המטוהר ממושבות חיוביות באמצעות SwaI צריך לתת שני מקטעים אופייניים באלקטרופורזה של ג'ל, מקטע 2.9 kbp שהוא החלק של וקטור PLEXSY המכיל את כל האלמנטים הדרושים לשכפול ובחירה ב- E. coli, ומקטע 7-8 kpb המייצג את קלטת הביטוי הלינארית המשמשת לטרנספקציה (איור 3B).
לאחר טרנספקציה, הבחירה polyclonal נעשה בעיקר איכותי. מצב תרביות הטפילים במהלך הברירה באנטיביוטיקה מנוטר מיקרוסקופית, תוך מתן תשומת לב מיוחדת למורפולוגיה ולתנועתיות של הטפיל. לאחר התאוששות מוצלחת של תרבית של טפילים נגועים, אלה שמבטאים ביעילות eGFP צריכים להיות מזוהים בערוץ FL-1 של ציטומטר זרימה (איור 4A); יעילות ההעברה עשויה להשתנות בין מיני לישמניה שונים. בעבודה זו, לאחר ברירה רב-שבטית 98.44% מהטפילים של L. donovani שנותחו על-ידי ציטומטריית זרימה היו פלואורסצנטיים בהשוואה ל-82.00% של L. panamensis (איור 4B). אם קלטת הביטוי pLEXSY-eGFP שולבה בהצלחה בלוקוס ssu , יש לצפות במוצר של 2.3 kbp לאחר הפעלת ה- PCR האבחנתי המתואר בסעיף 5 (איור 4C). תוצאות אלה מבטיחות קבלת טפילים רקומביננטיים המבטאים באופן מכונן eGFP כטרנסגן משולב ויישארו יציבים במעברים הבאים של תרבית הטפיל.
שיבוט על ידי הגבלת דילול מאפשר העשרה של אוכלוסיית הטפילים הפלואורסצנטיים עם יעילות טרנספקציה נמוכה יותר, כגון L. panamensis, כמו גם בחירת שיבוטים עם עוצמות הפלואורסצנטיות הגבוהות ביותר. ארבעה שיבוטים התקבלו עבור כל אחד ממיני הלישמניה ששימשו בעבודה זו (טבלה 1), כלומר Lpan-A7, F11, F12 ו-H2 עבור L. panamensis, ו-Ldon-C1, G4, F2 ו-H1 עבור L. donovani. שיבוטים עם האחוז הגבוה ביותר של טפילים פלואורסצנטיים (Lpan-F11 = 95.74%; Ldon-C1 = 99.16%) ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (Lpan-F11 = 35.63 יחידות פלואורסצנטיות יחסיות [RFU]; Ldon-C1 = 14.12 RFU) נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון סמים.
איור 3: תוצאות מייצגות של הכנת מבנה pLEXSY-eGFP לטרנספקציה. (A) תוצאות מייצגות של PCR המושבה. נתיב 1: סולם 1 KB (יחידות בזוגות בסיס); נתיבים 2, 10 ו-12: דגימות שליליות לנוכחות עלון eGFP; נתיבים 3-9 ו-13-14: דגימות חיוביות לנוכחות של תוספת eGFP. (B) תוצאות הלינאריות עם SwaI. Lane 1: סולם 1 KB (יחידות בזוגות בסיסים); נתיבים 2-4: תגובות עיכול של פלסמידים מטוהרים משלוש מושבות שונות חיוביות לנוכחות של תוספת eGFP. נצפים קטע של 2.9 kbp המייצג את האלמנטים הדרושים לשכפול ובחירה ב- E. coli, ומקטע 7-8 kpb המייצג את קלטת הביטוי הליניארית. שני הג'לים הוכנו בריכוז אגרוז של 1%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של אישור ביטוי eGFP והחדרה כרומוזומלית של קלטת הביטוי . (A) היסטוגרמה של ציטומטריית זרימה בערוץ FL-1. אדום: תאים מסוג בר ללא eGFP; כחול: טפילי L. panamensis נגועים עם 82.00% מהאוכלוסייה המבטאים eGFP. (B) השוואת תוצאות הטרנספקציה בין L. panamensis (Lpan-1) ו-L. donovani (Ldon-1 ). יעילות העברה גבוהה יותר נצפתה ב- L. donovani (98.44%) מאשר L. panamensis (82.00%) לאחר ברירה רב-שבטית. (ג) תוצאות ה-PCR לאישור אינטגרציה גנומית. L: סולם 100 bp (יחידות בזוגות בסיס); נתיבים 1-4: דגימות מארבעה שיבוטים שונים של L. panamensis המראות מוצר אופייני של 2.3 kbp לשילוב pLEXSY-sat2.1 בלוקוס SSU . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מינים | קוד שכפול | אחוז הטפילים הפלואורסצנטיים | עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת* |
| ל. פנמנסיס | Lpan-A7 | 90.00 | 24.70 |
| Lpan-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| Lpan-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| Lpan-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| ל. דונובאני | לדון-C1 | 99.16 | 14.12 |
| לדון-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| לדון-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| לדון-H1 | 98.97 | 12.90 |
טבלה 1: שיבוטים המתקבלים על-ידי הגבלת דילול. ארבעה שיבוטים הושגו על ידי הגבלת דילול עבור כל אחד ממיני הלישמניה ששימשו בעבודה זו. אחוז הטפילים הפלואורסצנטיים ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת מדווחים עבור כל שיבוט. *פלואורסצנטיות מתבטאת ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרונות והחסרונות של גנים שונים נחקרו במספר טפילים פרוטוזואים. ביניהם, GFP ו- eGFP הם פלואורסצנטיים במהותם ומאפשרים כימות והדמיה קלים. ניתן לזהות את הפעילות הפלואורסצנטית של חלבונים אלה עם מניפולציה מינימלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פלואורימטריה או ציטומטריית זרימה. מחקרים מעטים בוצעו ליצירת L המבטא GFP. (Viannia) זנים, למרות החוסן המוכח של GFP ונגזרותיהם כגנים כתבתיים במינים לישמניה בעולם הישן15,16,18,24. Varela et al.37 פיתחו זני L. panamensis המבטאים GFP כטרנסגן אפיזומלי. ניתוח ציטומטריית זרימה של פרומסטיגוטים אקסניים ואמסטיגוטים תוך תאיים הראה את התועלת של טפילים אלה לבדיקות סקר תרופות. עם זאת, הפלואורסצנטיות הייתה הטרוגנית מאוד, ומספר הטפילים הפלואורסצנטיים באוכלוסייה הנגועה היה תלוי בלחץ סלקטיבי מתמיד עם הטוניקמיצין האנטיביוטי. עובדות אלה מגבילות את השימוש בטפילים אלה כאמסטיגוטים תוך-תאיים לבדיקות סקר תרופתיות, בהתחשב בכך שלא ניתן להוסיף טוניקמיצין למקרופאגים נגועים38, מה שמשאיר טפילים עם פלואורסצנטיות נמוכה הקיימת באוכלוסיית האמסטיגוטים התוך-תאיים שעלולה להטות את הכימות של מקרופאגים נגועים.
השימוש בווקטורים כגון pLEXSY מהווה כלי רב עוצמה ואמין לשינוי יציב של טפילי מיני לישמניה באמצעות אינטגרציה של טרנסגנים באמצעות רקומבינציה הומולוגית28. קלטת pLEXSY משולבת בלוקוס rRNA 18S (ssu), שהשעתוק שלו נמצא תחת בקרה של מקדם RNA פולימראז I חזק, מה שמוביל לשיעורי שעתוק גבוהים יותר20. השימוש במערכת זו הוכח כמאפשר ביטוי יציב והומוגני של חלבון המטרה27. מאפיינים אלה מעדיפים את הביטוי של eGFP ואת השימוש בו בבדיקות תוך תאיות עם רמות הומוגניות של פלואורסצנטיות בתאים נגועים, כמו גם את השימוש בו לזיהומים ניסיוניים במודלים murine. משפחת הווקטורים pLEXSY-2.1 המשמשת בפרוטוקול זה תוכננה עם מקדם ריבוזומלי נוסף של לישמניה לפני קלטת הביטוי, מה שמשפר את ייצור החלבונים29,30.
בפרוטוקול זה, ישנם מספר שלבים קריטיים להשגת תוצאות אופטימליות. ראשית, שיבוט של גן המטרה צריך להתבצע באמצעות פולימראז33 באיכות גבוהה, ועיכול של DNA המטרה וקטור הביטוי צריך להיעשות באמצעות פרוטוקול עיכול רציף בעת שימוש בשילוב BglII/KpnI לשיבוט. הסיבה השנייה היא שאין חיץ שבו גם BglII וגם KpnI מפגינים פעילות אופטימלית, למרות ששני האנזימים פעילים בצורה אופטימלית באותה טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס). שנית, הבחירה של שיבוטים רקומביננטיים לאחר טרנספורמציה E. coli צריך להתבצע ב 30 ° C, כמו פלסמידים pLEXSY יציבים יותר בטמפרטורה זו E. coli28,29. בנוסף, שיעורי הצמיחה של L. panamensis ו L. donavani יכול להיות שונה לגמרי. במהלך ביצוע הניסויים המתוארים במאמר זה, L. panamensis בדרך כלל לקח זמן רב יותר להגיע לשלב נייח. שיעורי הגדילה יכולים גם להשתנות מזן לזן במעבדות שונות; לכן, יש צורך לאפיין את קצבי הגדילה של זני המעבדה לצורך הערכת הזמן הדרוש כדי להגיע לריכוז הטפיל הדרוש להתחשמלות. שימוש במאגר שדווח על ידי Bolhassani et al.27 עבור אלקטרופורציה הוא שינוי חשוב המגדיל באופן משמעותי את הישרדותם של הטפילים המתחשמלים בהשוואה לאלקטרופורציה ישירה במדיום תרבית, כפי שהוצע על ידי פרוטוקול Jena Bioscience המקורי. במהלך הברירה הרב-שבטית חשוב מאוד לא לתת לתרביות המתחשמלות לגדול יתר על המידה לפני הוספת האנטיביוטיקה הסלקטיבית; אחרת, טפילים שאינם רקומביננטיים יגדלו יותר מהטפילים הרקומביננטיים27. זה ייקח מעבר אחד או שניים רצופים (1:10 inoculum) לתוך תווך טרי עם אנטיביוטיקה מתאימה כדי לקבל תרבית עכורה של טפילים רקומביננטיים עמידים לאנטיביוטיקה ושליטה שלילית ברורה. מעברים צריכים להיעשות תוך 5 ימים מהתוספת האנטיביוטית הראשונה. לבסוף, ישנם הבדלים בולטים ביעילות הטרנספקציה והאינטגרציה של קלטת הביטוי pLEXSY בין L. panamensis ו- L. donovani24,37. בעוד שב- L. donovani כמעט 98% מכלל האוכלוסייה שנותחה באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר ברירה רב-שבטית מראה פלואורסצנטיות, ב- L. panamesis, אחוז הטפילים הפלואורסצנטיים הוא סביב 80%. מסיבה זו, השלב האופציונלי של שיבוט על ידי הגבלת דילול הוא שינוי הנדרש בעיקר כדי להשיג אוכלוסיית L. panamensis שבה יותר מ -95% מהטפילים המנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה הם פלואורסצנטיים. השימוש בפלסמידים pLEXSY מוגבל לשינוי גנומי של מיני לישמניה, מכיוון שהם תוכננו במקור לשימוש ב- L. tarentolae כפלטפורמות לייצור חלבונים28. למרות שהוכח כי pLEXSY עובד במספר מיני לישמניה שונים מ- L. tarentolae21,24,27, חשוב לוודא את שימור רצף ה- ssu כאשר עובדים עם מין לישמניה חדש כדי לוודא שאתרי רקומבינציה בפלסמיד pLEXSY יעבדו.
השיטה המתוארת במאמר זה מאפשרת ייצור טפילי לישמניה רקומביננטיים עם ביטוי מכונן ויציב של eGFP או כל כתב עניין אחר. בטפילים אלה, פלואורסצנטיות היא הומוגנית, והיא נשמרת בצורות תוך תאיות. לכן, זנים הנוצרים בתהליך זה יכולים לשמש לסטנדרטיזציה של בדיקות סינון תרופות בתפוקה גבוהה כדי להעריך את הפעילות הפוטנציאלית נגד לישמניה של מולקולות ממקור טבעי וסינתטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, מספר מענק NI-177-2016, ו- Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, מספרי מענקים SNI-169-2018, SNI-008-2022 ו- SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
