Summary
Her beskriver vi den metode, der anvendes til at generere L. panamensis - og L. donovani-stammer , der udtrykker genet for eGFP som et stabilt integreret transgen ved hjælp af pLEXSY-systemet. Transfekterede parasitter blev klonet ved at begrænse fortynding, og kloner med den højeste fluorescensintensitet i begge arter blev udvalgt til videre brug i lægemiddelscreeningsanalyser.
Abstract
Protozoiske parasitter af slægten Leishmania forårsager leishmaniasis , en sygdom med variable kliniske manifestationer, der rammer millioner af mennesker over hele verden. Infektion med L. donovani kan resultere i dødelig visceral sygdom. I Panama, Colombia og Costa Rica er L. panamensis ansvarlig for de fleste af de rapporterede tilfælde af kutan og mucokutan leishmaniasis. At studere et stort antal lægemiddelkandidater med de metoder, der er tilgængelige til dato, er ret vanskeligt, da de er meget besværlige til evaluering af forbindelsernes aktivitet mod intracellulære former af parasitten eller til udførelse af in vivo-assays . I dette arbejde beskriver vi dannelsen af L. panamensis - og L. donovani-stammer med konstitutiv ekspression af genet, der koder for et forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) integreret i locus, der koder for 18S rRNA (ssu). Genet, der koder for eGFP, blev opnået fra en kommerciel vektor og amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) for at berige det og tilføje restriktionssteder for BglII- og KpnI-enzymerne. eGFP-amplikonen blev isoleret ved agarosegelrensning, fordøjet med enzymerne BglII og KpnI og ligeret i Leishmania-ekspressionsvektoren pLEXSY-sat2.1, der tidligere var fordøjet med det samme sæt enzymer. Ekspressionsvektoren med det klonede gen blev formeret i E. coli, renset, og tilstedeværelsen af indsatsen blev verificeret ved koloni PCR. Det rensede plasmid blev lineæriseret og brugt til at transfektere L. donovani og L . panamensis parasitter. Integrationen af genet blev verificeret ved PCR. Ekspressionen af eGFP-genet blev evalueret ved flowcytometri. Fluorescerende parasitter blev klonet ved at begrænse fortynding, og kloner med den højeste fluorescensintensitet blev valgt ved anvendelse af flowcytometri.
Introduction
Protozoiske parasitter af slægten Leishmania forårsager leishmaniasis, en sygdom med en bred vifte af kliniske manifestationer. Denne sygdom er udbredt i 98 lande, og dens årlige forekomst anslås til 0,9 til 1,6 millioner tilfælde1. Leishmania-arter, der er patogene for mennesker, er opdelt i to underslægter, nemlig L. (Leishmania) og L. (Viannia). Infektion med nogle arter, der tilhører L. (Leishmania) underslægt, såsom L. donovani og L. infantum, kan resultere i visceral leishmaniasis (VL), som er dødelig, hvis den ikke behandles2. Arter tilhørende L. (Viannia) subgenus er forbundet med de fleste tilfælde af kutan leishmaniasis (CL) og mucokutan leishmaniasis (MCL) i Central- og Sydamerika, især i Panama, Colombia og Costa Rica, hvor L. panamensis er det vigtigste ætiologiske middel til disse kliniske præsentationer 3,4.
Eksisterende anti-leishmania kemoterapi, der omfatter lægemidler som pentavalente antimonials, miltefosin og amphotericin B er meget giftig og dyr. Desuden er øget lægemiddelresistens i de seneste årtier blevet føjet til de faktorer, der forstyrrer effektiv behandling af patienter over hele verden5. Der er påvist betydelige forskelle på tværs af arter af slægten Leishmania i forhold til lægemiddelfølsomhed, især mellem New og Old World arter 6,7. Af disse grunde er det nødvendigt at rette indsatsen mod identifikation og udvikling af nye lægemidler mod leishmani, idet der lægges særlig vægt på artsspecifikke tilgange. Det er ret vanskeligt at studere store biblioteker af lægemiddelkandidater med traditionelle metoder, da disse metoder er meget besværlige til evaluering af forbindelsernes aktivitet mod intracellulære amastigoter eller til udførelse af in vivo-eksperimenter 8; Derfor har det været nødvendigt at udvikle nye teknikker, der reducerer disse ulemper, herunder implementering af reportergener og udvikling af fænotypiske screeningsassays med højt indhold9.
Brugen af reportergener har vist potentialet til at øge effektiviteten af lægemiddelscreeningsprocessen, da det letter udviklingen af high-throughput og in vivo-assays. Rekombinante Leishmania-parasitter, der udtrykker flere reportergener, er blevet genereret af forskellige forskergrupper. Reportergener, såsom β-galactosidase, β-lactamase og luciferase, er blevet introduceret i flere Leishmania-arter ved hjælp af episomale vektorer, hvilket viser begrænset anvendelighed til lægemiddelscreening i ekstra- og intracellulære former af parasitten 10,11,12,13,14,15. Disse tilgange har begrænsningen ved at kræve et stærkt selektivt tryk i kultur for at undgå eliminering af den episomale konstruktion samt brugen af yderligere reagenser til at afsløre aktiviteten af reportergenet. Omvendt er det grønne fluorescerende protein (GFP) og dets variant, det forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP), blevet anvendt til generering af et stort antal transgene Leishmania-stammer til in vitro-lægemiddelscreeningsassays på grund af deres fleksibilitet og følsomhed samt muligheden for at automatisere screeningsprocessen ved hjælp af flowcytometri eller fluorometri15, 16,17,18,19. På trods af lovende resultater var kulturer af disse transgene stammer meget heterogene i deres fluorescensniveauer, da antallet af kopier af GFP-genet ikke var det samme i alle parasitterne. Desuden krævede opretholdelse af fluorescens konstant selektivt tryk på parasitterne i kultur, da GFP-genet blev introduceret i en episomal konstruktion.
Af de grunde, der er nævnt ovenfor, har mange bestræbelser fokuseret på at udvikle nye metoder til fremstilling af stabile rekombinante stammer. Disse bestræbelser har for det meste været afhængige af integrationen af reportergener i ribosomale loci og udnyttet de højere transkriptionshastigheder for ribosomale gener20. Stammer af L. infantum og L. amazonensis er blevet genereret efter at have integreret generne, der koder for β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 og tdTomato23, og de er blevet evalueret for deres anvendelighed i lægemiddelscreeningsassays. Forskellige grupper har udviklet L. donovani-stammer, der udtrykker GFP konstitutivt ved at integrere dets kodende gen i 18S ribosomalt RNA-locus (ssu locus) gennem homolog rekombination24,25; de viste stabil og homogen GFP-ekspression i den transfekterede population, herunder intracellulære amastigoter 24,25, og de blev med succes implementeret i lægemiddelscreeningsassays24,25,26. Bolhassani et al.27 udviklede stammer af L. major og L. infantum, der udtrykker GFP som et integreret transgen. De brugte integrationsvektoren pLEXSY, oprindeligt designet til transgen ekspression af proteiner i et system med L. tarentolae som vært28. pLEXSY-GFP-vektoren har vist sig at være meget effektiv til generering af forskellige Leishmania-stammer, der konstitutivt udtrykker GFP 24,25,27,29,30. I disse parasitter er fluorescens homogen og opretholdes i de intracellulære former, idet den kan påvises i fodpudelæsioner af inficerede mus27.
I dette arbejde beskriver vi den metode, der anvendes til generering af L. panamensis - og L. donovani-stammer , der udtrykker genet, der koder for eGFP, som et integreret transgen ved hjælp af pLEXSY-systemet. De stammer, der genereres gennem denne proces, bruges i vores laboratorium til at udføre lægemiddelscreeningsassays, der evaluerer den potentielle anti-leishmania-aktivitet af molekyler af naturlig og syntetisk oprindelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For at holde prøverne sterile skal alle trin, der involverer parasitkultur, udføres inde i en hætte til biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) eller i henhold til lokale sundheds- og sikkerhedsbestemmelser. Et grafisk resumé af denne protokol findes i figur 1.
Figur 1: Resumé af protokollen til generering af eGFP-ekspressive L. panamensis- og L. donovani-parasitter ved anvendelse af vektorfamilien pLEXSY-2.1. Alle seks hovedafsnit beskrevet i artiklen er afbildet her. 1) Amplifikation og indsættelse af eGFP-genet i pLEXSY-2.1-vektoren: målgenet amplificeres og tilføjer genkendelsesstederne for enzymerne KpnI og BglII, og både eGFP-amplikon og pLEXSY-plasmid fordøjes sekventielt med begge enzymer til efterfølgende ligering med T4-ligase. 2) Linearisering af pLEXSY-ekspressionsplasmidet: pLEXSY + eGFP-konstruktionen fordøjes med SwaI til linearisering og oprensning af 7-8 kbp-ekspressionskassetten. 3) Transfektion og 4) polyklonal selektion: Leishmania promastigoter transfekteres med ekspressionskassetten ved elektroporation og sættes tilbage i kultur til antibiotikaudvælgelse af rekombinante parasitter. Parasitfluorescens bekræftes gennem flowcytometri. 5) Bekræftelse af genomisk integration og 6) kloning ved at begrænse fortynding: integration af pLEXSY-eGFP-ekspressionskassetten bekræftes ved diagnostisk PCR ved anvendelse af en fremadgående primerhybridisering til ekspressionskassetten og en omvendt primerhybridisering til en kromosomsekvens, der er fraværende i ekspressionskassetten. Transfekterede kulturer kan beriges for fluorescerende parasitter ved kloning ved at begrænse fortynding, og kloner med de højeste gennemsnitlige fluorescerende intensiteter kan udvælges til yderligere anvendelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Amplifikation og indsættelse af eGFP-genet i pLEXSY-2.1-vektoren
- Amplifikation af eGFP-genet
BEMÆRK: Da denne protokol bruger pLEXSY-2.1-vektorfamilien (se materialetabel) til konstitutiv ekspression af målproteiner efter integrationen af ekspressionskassetten i det kromosomale 18S rRNA-locus (ssu) af Leishmania-arter , er det første skridt at introducere i eGFP-genet sekvenserne indeholdende restriktionsstederne, der tillader dets indsættelse i pLEXSY-2.1-vektorer. I dette tilfælde, da eGFP kun skal udtrykkes cytosolisk, blev restriktionsstederne for enzymerne BglII og KpnI tilføjet i henholdsvis 5'- og 3'-enderne af eGFP-genet. Kloning med KpnI resulterer i fusion af målproteinet til et C-terminalt polyhistidinmærke på seks rester efterfulgt af et stopkodon kodet i pLEXSY-2.1-plasmidet til yderligere oprensning af proteinet af interesse. Af denne grund indeholder den omvendte primersekvens ikke et stopkodon.- Afhængigt af plasmidkilden til eGFP analyseres målsekvensen ved hjælp af et restriktionsanalyseværktøj såsom NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 for at sikre, at den ikke indeholder interne steder for restriktionsenzymerne, der anvendes til kloning (BglII og KpnI) eller for SwaI, som er enzymet, der anvendes til vektorlinearisering før transfektion.
- Design fremadgående og omvendte primere til eGFP-forstærkning, der indeholder BglII- og KpnI-restriktionssekvenserne. Som et eksempel var eGFP-kilden til denne protokol pEGFP-N1-1X-plasmidet32, og primersekvenserne var dem, der blev rapporteret af Bolhassani et al.27:
Fremadgående primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII-begrænsningssted med fed skrift).
Omvendt primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI-begrænsningssted med fed skrift). - Målgenet forstærkes ved hjælp af en high-fidelity-polymerase for at sikre bevarelsen af kodningssekvensen. Som et eksempel, for primerne EGFP1 og EGFP2, kør PCR-cykelprotokollen som rapporteret af Bolhassani et al.27. Kør en indledende denaturering på 2 min ved 94 ° C, efterfulgt af 30 cyklusser på 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 57 ° C og 1 min ved 72 ° C. Kør et sidste forlængelsestrin på 10 min ved 72 °C. Tilsæt primerne i en slutkoncentration på 0,2 μM.
- Fragmentet renses ved hjælp af et konventionelt PCR-produktrensningssæt eller standard natriumacetat- og ethanoludfældning som beskrevet andetsteds33.
- Indsættelse af eGFP i pLEXSY-2.1-ekspressionsvektoren
- Trim enderne af eGFP-PCR-produktet ved hjælp af BglII og KpnI ved at følge producentens anvisninger.
- Først indstilles reaktionen for det enzym, der kræver den laveste saltkoncentration (i dette tilfælde KpnI) i henhold til producentens anvisninger, og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Derefter tilsættes 100 mM NaCl og 10 enheder BglII og inkuberes i 15 min. Reaktionen renses som beskrevet i trin 1.1.4.
- pLEXSY-ekspressionsvektoren fordøjes med BglII og KpnI efter den sekventielle nedbrydningsprotokol, der er beskrevet i trin 1.2.1.
- Ligerer pLEXSY-vektoren og eGFP-genet med T4-ligase ved hjælp af et molært forhold på 1:3 (vektor:insert). Der tilsættes kort 100 ng fordøjet pLEXSY og 28 ng fordøjet eGFP-produkt til en 20 μL reaktion indeholdende ligasebuffer ved en slutkoncentration på 1x og 3 enheder T4 DNA-ligase. Der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Transformér kompetente E. coli-celler , såsom XL-10, DH5α eller DH10B, med ligeringsproduktet opnået i trin 1.2.3 ved hjælp af standardtransformationsprotokoller33. De transformerede celler plades i Luira-Bertani (LB)-ampicillinagar og inkuberes i 24 timer ved 30 °C for at vælge rekombinante kloner (pLEXSY-plasmider er mere stabile i E. coli ved 30 °C end ved 37 °C).
- Skærm for tilstedeværelsen af indsatsen i plasmiderne ved koloni PCR.
- Vælg individuelle kolonier, resuspender i 20 μL nukleasefrit vand, opvarm ved 95 ° C i 15 minutter, og tag 1 μL lysat som en DNA-skabelon til koloni-PCR. Brug den fremadrettede primer til eGFP-forstærkning, beskrevet i trin 1.1.2 (i dette eksempel EGFP1), og primeren A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') som omvendt primer29.
- Primeren A264 er designet til at anneal 80 bp efter stopkodonet af indsatsen i pLEXSY-2.1 ekspressionsvektorer. Som et eksempel skal du for primerparret EGFP1 + A264 bruge en PCR-cykelprotokol bestående af en indledende denaturering på 2 min ved 94 °C efterfulgt af 30 cyklusser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 50 °C og 1 min ved 72 °C. Kør et sidste forlængelsestrin på 10 min ved 72 °C. Primere tilsættes ved en slutkoncentration på 0,2 μM.
BEMÆRK: Det forventede produkt ved hjælp af dette primersæt er 859 bp langt. Udglødningsstederne for primerne EGFP1 og A264 er vist i figur 2.
- Forbered det rensede plasmid-DNA fra en positiv klon til efterfølgende transfektion ved anvendelse af et kommercielt plasmidisoleringssæt eller standard alkalisk udfældning33. Der anvendes 50 ml kultur natten over ved 30 °C til isolering af mindst 10 μg plasmid/positiv klon.
- Trim enderne af eGFP-PCR-produktet ved hjælp af BglII og KpnI ved at følge producentens anvisninger.
2. Linearisering af pLEXSY-ekspressionsplasmidet
- Der anvendes mindst 10 μg af det rensede pLEXSY-eGFP-plasmid til fordøjelse med SwaI (genkendelsessted: 5'-ATTTAAAT-3'). Fordøjes i 3-4 timer ved 25 °C og varmeinaktiveres ved 65 °C i 20 minutter.
- Kør fordøjelsesproduktet i agarosegelelektroforese for at adskille de resulterende fragmenter. Denne fordøjelse vil generere to fragmenter, et 2,9 kbp fragment, der repræsenterer de elementer, der er nødvendige for replikation og udvælgelse i E. coli, og et 7-8 kbp fragment, der repræsenterer den lineariserede ekspressionskassette.
- Rens ekspressionskassetten ved hjælp af et kommercielt agarosegelekstraktionssæt.
3. Transfektion af L. panamensis og L. donovani ved elektroporation
BEMÆRK: Leishmania-kulturen udføres som beskrevet andetsteds34. I dette eksempel blev L. panamensis og L. donovani promastigotes dyrket i Schneiders insektmedium, suppleret med 20% (v/v) føtalt bovint serum (FBS) og 50 μg/ml gentamicin og inkuberet ved 26 °C.
- Dyrk parasitkulturerne, indtil der er nok logfase eller tidlige stationære fase promastigoter til at bruge ca. 4 x 107 parasitter pr. Transfektion. Den maksimale celletæthed pr. dyrkningskolbe, inden den stationære fase nås, kan variere afhængigt af Leishmania-arten , og hvor godt stammerne er tilpasset laboratorieforholdene. Saml indholdet af flere kulturkolber, hvis det er nødvendigt.
- Centrifuger parasitkulturen ved 2.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Resuspender pellet i elektroporationsbuffer ved 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mMNa2HPO4 og 6 mM glucose; pH 7,5)27 for at opnå en koncentration på 1 x 108 parasitter/ml. Sæt på is i 10 min.
BEMÆRK: Elektroporationsbufferen skal steriliseres ved filtrering før brug. - Parallelt hermed konstrueres forkølerør med 2-10 μg lineær pLEXSY-eGFP i et maksimalt volumen på 50 μL vand eller 10 mM trisbuffer (pH 8,0) og elektroporationskuvetter på d = 2 mm.
- Tilsæt 350 μL forkølede parasitter til røret med det lineariserede plasmid og overfør hele 400 μL til elektroporationskuvetten på is. Parallelt elektroporerer parasitcellerne uden plasmid-DNA som en negativ kontrol.
- Elektroporat ved hjælp af en af disse to protokoller:
Eksponentielt henfald: 450 V, 450 μF, en puls.
Tidskonstant: 450 V, T = 3,5 ms, en puls.
BEMÆRK: Disse protokoller blev kørt ved hjælp af en kommerciel genpulser (materialetabel) med PC- og CE-moduler. - Sæt kuvetten tilbage på is i 10 minutter og overfør de elektroporerede parasitter til 5 ml af det passende dyrkningsmedium. Dette eksempel brugte Schneiders insektmedium suppleret med 20% (v/v) FBS. Der inkuberes ved 26 °C i 20 timer.
4. Polyklonal udvælgelse i kultur
- Ca. 20 timer efter elektroporation observeres kulturerne under et mikroskop. Mindst halvdelen af parasitpopulationen skal udvise visuelt god morfologi og motilitet (dråbelignende promastigoter med oscillerende flagellum, der bevæger sig gennem medierne og/eller danner aktive parasitaggregater). Tilsæt det passende selektive antibiotikum afhængigt af det anvendte pLEXSY-plasmid. I dette eksempel anvendes pLEXSY-sat2.1, som indeholder streptothricinacetyltransferase som selektionsmarkør. Brug derfor nourseothricin som et selektivt antibiotikum ved en koncentration på 0,1 mg / ml.
- Følg kulturerne mikroskopisk, indtil der ses en klar forskel mellem parasitterne elektroporeret med og uden plasmid-DNA.
- Kontroller parasitfluorescensen gennem flowcytometri.
- Der centrifugeres 1 ml stationærfasekultur ved 2.000 x g i 3 minutter ved RT. Der vaskes to gange i PBS, og den endelige pellet opslæmmes igen i 1 ml PBS.
BEMÆRK: Fluorescensen af eGFP kan detekteres i FL1-kanalen i de fleste kommercielle cytometre. Gain indstillinger for fremad og side scatter, og FL1-kanalen kan variere mellem cytometre. I dette eksempel blev der anvendt et CyFlow-rumcytometer (Sysmex). - Kør prøverne, saml 20.000 hændelser med en hastighed på 0,5 μL/s, og indstil forstærkningsværdierne for kanalerne fremadrettet spredning (FSC), sidespredning (SSC) og fluorescens 1 (FL-1) som henholdsvis 225,0, 200,0 og 520,0. Kør en kontrolprøve med ikke-fluorescerende parasitter for at bestemme parasitpopulationen i et FSC versus SSC dot-plot.
- Opret en port (G1), der indeholder parasitpopulationen, og filtrer FL-1-kanalen gennem denne port til bestemmelse af promastigoters autofluorescens og indstilling af en rækkeviddeport (G2) til FL-1-kanalen.
- Kør de transfekterede parasitter for at kontrollere, om der er fluorescens. Registrer procentdelen af parasitter i G1, der er fluorescerende, og gennemsnittet af fluorescensintensiteten i G2.
- Der centrifugeres 1 ml stationærfasekultur ved 2.000 x g i 3 minutter ved RT. Der vaskes to gange i PBS, og den endelige pellet opslæmmes igen i 1 ml PBS.
5. Bekræftelse af genomisk integration
BEMÆRK: Integration af pLEXSY-eGFP-ekspressionskassetten kan bekræftes ved diagnostisk PCR ved hjælp af en fremadgående primerhybridisering til ekspressionskassetten (varierer afhængigt af den anvendte pLEXSY-2.1-vektor) og den omvendte primer F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') hybridisering til en kromosomal ssu-flankerende sekvens, der er fraværende i ekspressionskassetten. I dette eksempel bruges F2999 forward primer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3'), da den hybridiserer i pLEXSY-sat2.1-ekspressionskassetten. Figur 2 viser en skematisk gengivelse af de integrerede ekspressionskassette- og grundglødningssteder til diagnostisk PCR.
- Det genomiske DNA renses fra 2-5 ml af en stationær fase parasitkultur ved konventionel phenol/chloroformekstraktion35 eller med et kommercielt kit.
- Diagnostisk PCR udføres for pLEXSY-sat2.1 ved hjælp af en cykelprotokol bestående af en indledende denaturering på 2 min ved 94 °C, efterfulgt af 30 cyklusser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 53 °C og 1 min ved 72 °C. Kør et sidste forlængelsestrin på 10 min ved 72 °C. Primere tilsættes ved en slutkoncentration på 0,2 μM.
Figur 2: Skematisk gengivelse af kassetten med integrerede udtryk. Kasser mærket som Chr-S (grå) repræsenterer de tilstødende kromosomale sekvenser af 18S rRNA-locus (ssu), hvori ekspressionskassetten er integreret. Den integrerede ekspressionskassette består af 5' og 3' sekvenser (blå) til homolog rekombination i ssu-locus , en yderligere Leishmania ribosomal promotor (rød) til forbedret proteinproduktion, eGFP-genet (grøn), et selektionsmarkørgen (gul) og tre uoversatte regioner (lysegrå), nemlig utr1, 2 og 3, som tilvejebringer splejsningssignalerne til posttranskriptionel mRNA-behandling til optimeret ekspression af eGFP og selektionsmarkøren i Leishmania-parasitter . Udglødningssteder for fremadgående og omvendte primere, der anvendes til verifikation af inserttilstedeværelsen ved koloni-PCR (trin 1.2.5), er markeret med de sorte pile mærket som henholdsvis cpcr-fwd (EGFP1-primer) og cpcr-rev (A264-primer), som afgrænser et 859 bp-produkt. Udglødningsstederne for fremadgående og omvendte primere, der anvendes til verifikation af genomisk integration ved diagnostisk PCR (trin 5), er markeret med de sorte pile mærket som henholdsvis sat-fwd (F2999 primer) og ssu-rev (F3002 primer), som afgrænser et 2,271 bp produkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Kloning ved begrænsning af fortynding (valgfrit)
- Efter bekræftelse af fluorescens gennem flowcytometri fremstilles en fortynding af rekombinante parasitter i en koncentration på fem promastigoter/ml36.
- Der tilsættes 100 μL af denne fortynding i hvert hul på en plade med 96 huller. På denne måde podes pladerne med en gennemsnitlig tæthed på 0,5 promastigoter / brønd, hvilket sikrer, at nogle brønde modtager en enkelt parasit, samtidig med at sandsynligheden for at have mere end en parasit pr. Brønd36 minimeres.
- Pladen forbliver uforstyrret i mindst 12 timer. Pladen følges mikroskopisk ved en forstørrelse på mindst 100x, indtil brønde med parasitvækst detekteres.
- Når en pladebrønd er fuld af parasitter, skal du bruge indholdet til at inokulere en 5 ml kultur. Dette tager 1-2 uger.
- Når klonfrøede kulturer når den stationære fase, kontrolleres fluorescens ved hjælp af flowcytometri som beskrevet i trin 4.3. Vælg de kloner, der skal anvendes til yderligere in vitro - og in vivo-assays , baseret på procentdelen af fluorescerende parasitter og den gennemsnitlige fluorescensintensitet målt i FL-1-kanalen. Sigt efter kloner med 98% -99% fluorescerende parasitter og vælg dem med den højeste gennemsnitlige fluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter opbygning af pLEXSY-eGFP-konstruktionen og transformering af kompetente E. coli-celler vil kolonier, der indeholder konstruktionen med eGFP-indsatsen, generere et produkt på ca. 859 bp efter kørsel af koloni-PCR beskrevet i afsnit 1.2 (figur 3A). Total fordøjelse af det rensede plasmid fra positive kolonier ved anvendelse af SwaI bør give to karakteristiske fragmenter i gelelektroforese, et 2,9 kbp fragment, der er den del af PLEXSY-vektoren, der indeholder alle de nødvendige elementer til replikation og udvælgelse i E. coli, og et 7-8 kpb fragment, der repræsenterer den lineære ekspressionskassette, der anvendes til transfektion (figur 3B).
Efter transfektion foretages den polyklonale udvælgelse for det meste kvalitativt. Status for parasitkulturerne under udvælgelse med antibiotika overvåges mikroskopisk, hvilket giver særlig opmærksomhed på parasitmorfologi og motilitet. Efter vellykket genopretning af en kultur af transfekterede parasitter skal de, der effektivt udtrykker eGFP, detekteres i FL-1-kanalen i et flowcytometer (figur 4A); transfektionseffektivitet kan variere mellem forskellige Leishmania-arter . I dette arbejde, efter polyklonal udvælgelse, var 98,44% af L. donovani-parasitter analyseret ved flowcytometri fluorescerende sammenlignet med 82,00% af L. panamensis (figur 4B). Hvis pLEXSY-eGFP-ekspressionskassetten er blevet integreret i ssu-locus , skal der observeres et 2,3 kbp-produkt efter kørsel af den diagnostiske PCR, der er beskrevet i afsnit 5 (figur 4C). Disse resultater sikrer, at der opnås rekombinante parasitter, der konstitutivt udtrykker eGFP som et integreret transgen og forbliver stabile i efterfølgende passager af parasitkulturen.
Kloning ved at begrænse fortynding muliggør berigelse af den fluorescerende parasitpopulation med lavere transfektionseffektivitet, såsom L. panamensis, samt udvælgelse af kloner med de højeste fluorescensintensiteter. Fire kloner blev opnået for hver af de Leishmania-arter , der blev brugt i dette arbejde (tabel 1), nemlig Lpan-A7, F11, F12 og H2 for L. panamensis og Ldon-C1, G4, F2 og H1 for L. donovani. Kloner med den højeste procentdel af fluorescerende parasitter (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16%) og gennemsnitlig fluorescensintensitet (Lpan-F11 = 35,63 relative fluorescerende enheder [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) blev udvalgt til yderligere brug i lægemiddelscreeningsassays.
Figur 3: Repræsentative resultater af forberedelse af pLEXSY-eGFP-konstruktionen til transfektion . (A) Repræsentative resultater af kolonien PCR. Bane 1: 1 kb stige (enheder i basispar); bane 2, 10 og 12: negative prøver for tilstedeværelsen af eGFP-indsatsen bane 3-9 og 13-14: positive prøver for tilstedeværelsen af eGFP-indsatsen. (B) Resultater af lineariseringen med SwaI. Bane 1: 1 kb stige (enheder i basispar); bane 2-4: fordøjelsesreaktioner af plasmider renset fra tre forskellige kolonier, der er positive for tilstedeværelsen af eGFP-indsatsen. Et 2,9 kbp fragment, der repræsenterer de elementer, der er nødvendige for replikation og selektion i E. coli, og et 7-8 kpb fragment, der repræsenterer den lineariserede ekspressionskassette, observeres. Begge geler blev fremstillet ved en agarosekoncentration på 1%. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af bekræftelse af eGFP-ekspression og kromosomindsættelse af ekspressionskassetten . (A) Flowcytometrihistogram i FL-1-kanalen. Rød: vildtypeceller uden eGFP; Blå: transfekterede L. panamensis-parasitter med 82,00% af befolkningen, der udtrykker eGFP. (B) Sammenligning af transfektionsresultater mellem L. panamensis (Lpan-1) og L. donovani (Ldon-1). En højere transfektionseffektivitet blev observeret hos L. donovani (98,44%) end L. panamensis (82,00%) efter polyklonal selektion. C) Resultater af PCR til bekræftelse af genomisk integration. L: 100 bp stige (enheder i basepar); bane 1-4: prøver fra fire forskellige kloner af L. panamensis , der viser et karakteristisk 2,3 kbp-produkt til pLEXSY-sat2.1-integration i ssu-locus . Klik her for at se en større version af denne figur.
| Art | Klon kode | Procentdel af fluorescerende parasitter | Gennemsnitlig fluorescensintensitet* |
| L. panamensis | LPAN-A7 | 90.00 | 24.70 |
| LPAN-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| LPAN-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| Lpan-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. donovani | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabel 1: Kloner opnået ved at begrænse fortynding. Fire kloner blev opnået ved at begrænse fortynding for hver af de Leishmania-arter , der blev anvendt i dette arbejde. Procentdel af fluorescerende parasitter og gennemsnitlig fluorescensintensitet rapporteres for hver klon. *Fluorescens udtrykkes i relative fluorescensenheder (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordele og ulemper ved forskellige reportergener er blevet undersøgt i flere protozoiske parasitter. Blandt dem er GFP og eGFP iboende fluorescerende og muliggør let kvantificering og billeddannelse. Den fluorescerende aktivitet af disse proteiner kan detekteres med minimal manipulation ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, fluorimetri eller flowcytometri. Der er kun udført få undersøgelser for at generere GFP-ekspressiv L. (Viannia) stammer, på trods af den påviste robusthed af GFP og deres derivater som reportergener i Old World Leishmania arter15,16,18,24. Varela et al.37 udviklede L. panamensis-stammer, der udtrykker GFP som et episomalt transgen. Flowcytometrianalyse af både axeniske promastigoter og intracellulære amastigoter viste nytten af disse parasitter til lægemiddelscreeningsassays. Imidlertid var fluorescensen meget heterogen, og antallet af fluorescerende parasitter i den transfekterede population var afhængig af konstant selektivt tryk med antibiotika tunicamycin. Disse fakta begrænser brugen af disse parasitter som intracellulære amastigoter til lægemiddelscreeningsassays, da tunicamycin ikke kan tilsættes til inficerede makrofager38, hvilket efterlader parasitter med lav fluorescens til stede i populationen af intracellulære amastigoter, der kan skævvride kvantificeringen af inficerede makrofager.
Anvendelsen af vektorer såsom pLEXSY udgør et kraftfuldt og pålideligt værktøj til stabil modifikation af Leishmania-artens parasitter gennem integration af transgener ved hjælp af homolog rekombination28. pLEXSY-kassetten er integreret i 18S rRNA locus (ssu), hvis transkription er under kontrol af RNA polymerase I stærk promotor, hvilket fører til højere transkriptionshastigheder20. Anvendelsen af dette system har vist sig at muliggøre stabil og homogen ekspression af målproteinet27. Disse egenskaber favoriserer ekspressionen af eGFP og dets anvendelse i intracellulære assays med homogene niveauer af fluorescens i inficerede celler såvel som dets anvendelse til eksperimentelle infektioner i murine modeller. pLEXSY-2.1-vektorfamilien, der anvendes i denne protokol, er designet med en ekstra Leishmania ribosomal promotor foran ekspressionskassetten, hvilket øger proteinproduktionen 29,30.
I denne protokol er der flere kritiske trin for at opnå optimale resultater. For det første bør kloning af målgenet udføres ved hjælp af en high-fidelity-polymerase33, og fordøjelsen af mål-DNA'et og ekspressionsvektoren bør udføres ved hjælp af en sekventiel fordøjelsesprotokol, når BglII/KpnI-kombinationen anvendes til kloning. Sidstnævnte skyldes, at der ikke er nogen buffer, hvor både BglII og KpnI udviser optimal aktivitet, selvom begge enzymer er optimalt aktive ved samme temperatur (37 °C). For det andet bør udvælgelsen af rekombinante kloner efter transformation i E. coli foretages ved 30 °C, da pLEXSY-plasmider er mere stabile ved denne temperatur i E. coli28,29. Derudover kan vækstraterne for L. panamensis og L. donavani være helt forskellige. Under udførelsen af eksperimenterne beskrevet i denne artikel tog L. panamensis normalt længere tid at nå den stationære fase. Vækstrater kan også variere fra stamme til stamme i forskellige laboratorier; Derfor er det nødvendigt at karakterisere væksthastighederne for laboratoriestammerne til estimering af den tid, der kræves for at nå den parasitkoncentration, der kræves til elektroporation. Brug af bufferen rapporteret af Bolhassani et al.27 til elektroporation er en vigtig ændring, der signifikant øger overlevelsen af de elektroporerede parasitter sammenlignet med direkte elektroporation i et dyrkningsmedium, som foreslået af den oprindelige Jena Bioscience-protokol. Under polyklonal udvælgelse er det ekstremt vigtigt ikke at lade de elektroporerede kulturer vokse, før det selektive antibiotikum tilsættes; Ellers vil ikke-rekombinante parasitter vokse ud af de rekombinante27. Det vil tage en eller to på hinanden følgende passager (1:10 inokulum) i frisk medium med det passende antibiotikum for at få en uklar kultur af antibiotikaresistente rekombinante parasitter og en klar negativ kontrol. Passager skal udføres inden for 5 dage efter den første tilsætning af antibiotika. Endelig er der især forskelle i effektiviteten af transfektion og integration af pLEXSY-ekspressionskassetten mellem L. panamensis og L. donovani24,37. Mens i L. donovani næsten 98% af den samlede befolkning analyseret gennem flowcytometri efter polyklonal selektion viser fluorescens, i L. panamesis, procentdelen af fluorescerende parasitter er omkring 80%. Af denne grund er det valgfrie trin med kloning ved at begrænse fortynding en ændring, der hovedsagelig kræves for at opnå en L. panamensis-population, hvor mere end 95% af parasitterne analyseret gennem flowcytometri er fluorescerende. Anvendelsen af pLEXSY-plasmider er begrænset til genomisk modifikation af Leishmania-arter, da de oprindeligt blev designet til at bruge L. tarentolae som proteinproduktionsplatforme28. Selvom pLEXSY har vist sig at virke i flere Leishmania-arter, der adskiller sig fra L. tarentolae21,24,27, er det vigtigt at verificere bevarelsen af ssu-sekvensen, når man arbejder med en ny Leishmania-art for at sikre, at rekombinationssteder i pLEXSY-plasmidet fungerer.
Metoden beskrevet i denne artikel tillader produktion af rekombinante Leishmania-parasitter med et konstitutivt og stabilt udtryk for eGFP eller enhver anden reporter af interesse. I disse parasitter er fluorescens homogen, og den opretholdes i intracellulære former. Derfor kan stammer, der genereres gennem denne proces, anvendes til standardisering af lægemiddelscreeningsassays med høj kapacitet for at evaluere den potentielle anti-leishmania-aktivitet af molekyler af naturlig og syntetisk oprindelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, bevillingsnummer NI-177-2016, og Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, tilskudsnumre SNI-169-2018, SNI-008-2022 og SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
