Summary
여기에서는 pLEXSY 시스템을 사용하여 안정적인 통합 이식 유전자로서 eGFP에 대한 유전자를 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 형질주입된 기생충은 희석을 제한하여 클로닝하고, 두 종 모두에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다.
Abstract
리슈만편모충 속의 원생동물 기생충은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 다양한 임상 증상을 보이는 질병인 리슈만편모충증을 유발합니다. L. donovani에 감염되면 치명적인 내장 질환이 발생할 수 있습니다. 파나마, 콜롬비아 및 코스타리카에서 L. panamensis는 보고된 피부 및 피부 점막 리슈만편모충증 사례의 대부분을 담당합니다. 현재까지 이용 가능한 방법론으로 많은 수의 약물 후보를 연구하는 것은 세포 내 형태의 기생충에 대한 화합물의 활성을 평가하거나 생체 내 분석을 수행하는 데 매우 힘들다는 점을 감안할 때 매우 어렵습니다. 이 연구에서 우리는 18S rRNA(ssu)를 암호화하는 유전자좌에 통합된 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 암호화하는 유전자의 구성적 발현을 가진 L. panamensis 및 L. donovani 균주의 생성을 설명합니다. eGFP를 코딩하는 유전자는 상용 벡터에서 얻었고 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되어 이를 풍부하게 하고 BglII 및 KpnI 효소에 대한 제한 부위를 추가했습니다. eGFP 앰플리콘을 아가로스 겔 정제에 의해 분리하고, 효소 BglII 및 KpnI로 분해하고, 이전에 동일한 효소 세트로 소화된 리슈만편모충 발현 벡터 pLEXSY-sat2.1에 결찰했습니다. 클로닝된 유전자를 가진 발현 벡터를 대장균에 증식시키고, 정제하고, 삽입물의 존재 여부를 콜로니 PCR로 검증하였다. 정제된 플라스미드를 선형화하고, L. donovani 및 L. panamensis 기생충을 형질감염시키는데 사용하였다. 유전자의 통합은 PCR에 의해 검증되었다. eGFP 유전자의 발현을 유세포 분석기로 평가하였다. 형광 기생충은 제한 희석에 의해 클로닝되었고, 형광 강도가 가장 높은 클론은 유세포 분석을 사용하여 선택되었습니다.
Introduction
리슈만편모충 속의 원생동물 기생충은 광범위한 임상 증상을 보이는 질병인 리슈만편모충증을 유발합니다. 이 질병은 98개국에서 유행하고 있으며, 연간 발병률은 0.9-160만 명으로 추산된다1. 인간에게 병원성인 리슈만편모충 종은 두 개의 아속, 즉 L로 나뉩니다. (리슈만편모충)과 L. (비아니아). L에 속하는 일부 종의 감염. L. donovani와 L. infantum과 같은 (리슈만편모충증) 아속은 내장 리슈만편모충증(VL)을 유발할 수 있으며, 이는 치료하지 않고 방치하면 치명적이다2. L에 속하는 종. (Viannia) 아속은 중남미, 특히 파나마, 콜롬비아 및 코스타리카에서 피부 리슈만편모충증(CL) 및 피부 점막만편모충증(MCL)의 대부분의 사례와 관련이 있으며, L. panamensis는 이러한 임상 증상의 주요 병인이다 3,4.
5가 항몬제, 밀테포신 및 암포테리신 B와 같은 약물을 포함하는 기존의 항리슈만편모충 화학요법은 독성이 강하고 비용이 많이 듭니다. 또한, 최근 수십 년 동안 증가된 약물 내성이 전 세계적으로 환자의 효과적인 치료를 방해하는 요인에 추가되었다5. 약물 감수성과 관련하여 Leishmania 속의 종들, 특히 신세계 종과 구세계 종 6,7 사이에 상당한 차이가 입증되었습니다. 이러한 이유로 종별 접근법에 특별한주의를 기울여 새로운 항 리슈 마니아 약물의 식별 및 개발에 노력을 기울일 필요가 있습니다. 전통적인 방법론으로 약물 후보의 대규모 라이브러리를 연구하는 것은 매우 어려운데, 이러한 방법론은 세포 내 무염증에 대한 화합물의 활성을 평가하거나 생체 내 실험을 수행하는 데 매우 힘들다8. 따라서 리포터 유전자의 구현 및 고함량 표현형 스크리닝 분석법의 개발을 포함하여 이러한 단점을 줄이는 새로운 기술을 개발할 필요가 있었습니다9.
리포터 유전자의 사용은 고처리량 및 생체 내 분석의 개발을 용이하게 하므로 약물 스크리닝 프로세스의 효율성을 높일 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 여러 리포터 유전자를 발현하는 재조합 리슈만편모충 기생충이 다양한 연구 그룹에 의해 생성되었습니다. β-갈락토시다아제, β-락타마제, 루시페라제와 같은 리포터 유전자는 에피솜 벡터를 사용하여 여러 리슈만편모충 종에 도입되었으며, 기생충10,11,12,13,14,15의 세포외 및 세포내 형태에서 약물 스크리닝에 제한적인 유용성을 보여줍니다 . 이러한 접근법은 에피솜 구조의 제거를 피하기 위해 배양에서 강력한 선택 압력을 요구하고 리포터 유전자의 활성을 밝히기 위해 추가 시약을 사용해야 한다는 한계가 있습니다. 반대로, 녹색 형광 단백질(GFP)과 그 변이체인 강화 녹색 형광 단백질(eGFP)은 유연성과 민감성뿐만 아니라 유세포 분석 또는 형광 측정법을 사용하여 스크리닝 프로세스를 자동화할 수 있는 가능성으로 인해 시험관 내 약물 스크리닝 분석을 위한 많은 형질전환 리슈만편모충 균주의 생성에 사용되었습니다15. 16,17,18,19. 유망한 결과에도 불구하고, 이러한 형질전환 균주의 배양은 GFP 유전자의 사본 수가 모든 기생충에서 동일하지 않았기 때문에 형광 수준에서 매우 이질적이었습니다. 또한, 형광을 유지하려면 GFP 유전자가 에피솜 구조에 도입되었기 때문에 배양 중인 기생충에 대한 지속적인 선택 압력이 필요했습니다.
앞서 언급한 이유로 인해 안정적인 재조합 균주를 생산하기 위한 새로운 방법론을 개발하는 데 많은 노력이 집중되어 왔습니다. 이러한 노력은 리보솜 유전자의 더 높은 전사율을 이용하여 리보솜 유전자좌에 리포터 유전자를 통합하는 데 주로 의존해 왔다20. L. infantum 및 L. amazonensis의 균주는 β-갈락토시다아제 21, IFP 1.4, iRFP 22 및 tdTomato23을 암호화하는 유전자를 통합하여 생성되었으며 약물 스크리닝 분석에서 유용성에 대해 평가되었습니다. 다양한 그룹이 상동 재조합을 통해 코딩 유전자를 18S 리보솜 RNA 유전자좌(ssu locus)에 통합하여 GFP를 구성적으로 발현하는 L. donovani 균주를 개발했습니다24,25; 그들은 세포내 amastigotes 24,25를 포함하여 형질감염된 집단에서 안정적이고 균질한 GFP 발현을 보였으며 약물 스크리닝 분석에서 성공적으로 구현되었습니다24,25,26. Bolhassani et al.27은 GFP를 통합 이식 유전자로 발현하는 L. major 및 L. infantum의 균주를 개발했습니다. 연구진은 원래 L. tarentolae를 숙주로 사용하는 시스템에서 단백질의 형질전환 발현을 위해 설계된 통합 벡터 pLEXSY를 사용했다28. pLEXSY-GFP 벡터는 GFP 24,25,27,29,30을 구성적으로 발현하는 다양한 리슈만편모충 균주의 생성에 매우 효율적인 것으로 나타났습니다. 이들 기생충에서, 형광은 균질하고 세포내 형태로 유지되며, 감염된 생쥐의 발바닥 병변에서 검출될 수 있다27.
이 연구에서 우리는 pLEXSY 시스템을 사용하여 eGFP를 암호화하는 유전자를 통합 이식 유전자로 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 이 과정을 통해 생성된 균주는 천연 및 합성 기원 분자의 잠재적인 항리슈만편모충 활성을 평가하는 약물 스크리닝 분석을 수행하기 위해 실험실에서 사용됩니다.
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Protocol
샘플을 멸균 상태로 유지하려면 기생충 배양과 관련된 모든 단계를 생물 안전 레벨 2(BSL-2) 후드 내부 또는 현지 보건 및 안전 규정에 따라 수행해야 합니다. 이 프로토콜의 그래픽 요약은 그림 1에서 찾을 수 있습니다.
그림 1: pLEXSY-2.1 벡터 패밀리를 사용하여 eGFP 발현 L. panamensis 및 L. donovani 기생충을 생성하기 위한 프로토콜의 요약 계획. 이 기사에 설명 된 6 개의 주요 섹션이 모두 여기에 설명되어 있습니다. 1) pLEXSY-2.1 벡터에 eGFP 유전자의 증폭 및 삽입: 표적 유전자를 증폭하여 효소 KpnI 및 BglII에 대한 인식 부위를 추가하고 eGFP 앰플리콘과 pLEXSY 플라스미드를 모두 T4 리가아제에 의한 후속 결찰을 위해 두 효소로 순차적으로 소화합니다. 2) pLEXSY 발현 플라스미드의 선형화: pLEXSY + eGFP 구조체는 7-8kbp 발현 카세트의 선형화 및 정제를 위해 SwaI로 절단됩니다. 3) 형질주입 및 4) 다클론 선택: 리슈만편모충 프로마스티고트를 전기천공에 의해 발현 카세트로 형질감염시키고 재조합 기생충의 항생제 선택을 위해 배양물에 다시 넣습니다. 기생충 형광은 유세포 분석을 통해 확인됩니다. 5) 게놈 통합 확인 및 6) 희석 제한에 의한 클로닝: pLEXSY-eGFP 발현 카세트의 통합은 발현 카세트에 없는 염색체 서열에 혼성화하는 정방향 프라이머 및 발현 카세트에 없는 염색체 서열에 혼성화하는 역방향 프라이머를 사용하여 진단 PCR로 확인한다. 형질주입된 배양물은 희석을 제한하여 클로닝을 통해 형광 기생충에 대해 농축될 수 있으며, 평균 형광 강도가 가장 높은 클론은 추가 적용을 위해 선택될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. pLEXSY-2.1 벡터에 eGFP 유전자의 증폭 및 삽입
- eGFP 유전자의 증폭
참고: 이 프로토콜은 리슈만편모충 종의 염색체 18S rRNA 유전자좌(ssu)에 발현 카세트를 통합한 후 표적 단백질의 구성적 발현을 위해 pLEXSY-2.1 벡터 패밀리(재료 표 참조)를 사용하므로, 첫 번째 단계는 pLEXSY-2.1 벡터에 삽입할 수 있는 제한 부위를 포함하는 서열을 eGFP 유전자에 도입하는 것입니다. 이 경우 eGFP는 세포질적으로만 발현되어야 하므로 효소 BglII 및 KpnI에 대한 제한 부위를 각각 eGFP 유전자의 5' 및 3' 말단에 추가했습니다. KpnI로 클로닝하면 표적 단백질을 6개의 잔기로 구성된 C-말단 폴리히스티딘 태그에 융합한 다음, 관심 단백질의 추가 정제를 위해 pLEXSY-2.1 플라스미드에 코딩된 정지 코돈이 생성됩니다. 이러한 이유로, 역방향 프라이머 서열은 정지 코돈을 함유하지 않는다.- eGFP의 플라스미드 공급원에 따라 NEBcutter(http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 과 같은 제한 분석 도구를 사용하여 표적 서열을 분석하여 클로닝에 사용되는 제한 효소(BglII 및 KpnI) 또는 형질감염 전 벡터 선형화에 사용되는 효소인 SwaI에 대한 내부 부위가 포함되어 있지 않은지 확인합니다.
- BglII 및 KpnI 제한 서열을 포함하는 eGFP 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다. 예를 들어, 이 프로토콜의 eGFP 소스는 pEGFP-N1-1X 플라스미드32이고 프라이머 서열은 Bolhassani et al.27에 의해 보고된 것입니다.
정방향 프라이머(EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (굵은 글씨로 BglII 제한효소 부위).
역방향 프라이머(EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (굵은 글씨로 KpnI 제한 부위). - 코딩 서열의 보존을 보장하기 위해 고충실도 중합효소를 사용하여 표적 유전자를 증폭합니다. 예를 들어, 프라이머 EGFP1 및 EGFP2의 경우 Bolhassani et al.27에 의해 보고된 대로 PCR 사이클링 프로토콜을 실행합니다. 94°C에서 2분의 초기 변성을 실행한 후 94°C에서 30초, 57°C에서 30초, 72°C에서 1분의 30사이클을 실행합니다. 72°C에서 10분의 최종 연장 단계를 실행합니다. 프라이머를 0.2 μM의 최종 농도로 첨가한다.
- 단편을 통상적인 PCR 산물 정제 키트, 또는 표준 소듐 아세테이트 및 에탄올 침전을 사용하여 정제한다(33).
- pLEXSY-2.1 발현벡터에 eGFP의 삽입
- 제조업체의 지침에 따라 BglII 및 KpnI을 사용하여 eGFP-PCR 산물의 끝을 자릅니다.
- 먼저, 가장 낮은 염 농도(이 경우 KpnI)를 필요로 하는 효소에 대한 반응을 제조업체의 지침에 따라 설정하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 그런 다음 100mM NaCl과 10단위의 BglII를 추가하고 15분 동안 배양합니다. 단계 1.1.4에 설명된 대로 반응을 정제합니다.
- 단계 1.2.1에 기술된 순차적 소화 프로토콜에 따라, bglII 및 KpnI로 pLEXSY 발현 벡터를 분해한다.
- pLEXSY 벡터와 eGFP 유전자를 1:3의 몰비(벡터:삽입)를 사용하여 T4 리가아제로 라이게이션합니다. 100ng의 소화된 pLEXSY와 28ng의 소화된 eGFP 생성물을 1x 및 3단위의 T4 DNA 리가아제의 최종 농도로 리가제 완충액을 포함하는 20μL 반응에 간단히 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 표준 형질전환 프로토콜33을 사용하여 단계 1.2.3에서 수득된 결찰 산물로 적격한 대장균 세포, 예컨대 XL-10, DH5α, 또는 DH10B를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 Luira-Bertani(LB)-ampicillin 한천에 플레이트하고 30°C에서 24시간 동안 배양하여 재조합 클론을 선택합니다(pLEXSY 플라스미드는 37°C에서보다 30°C에서 대장균에서 더 안정적임).
- 플라스미드 내 삽입물의 존재를 콜로니 PCR로 스크리닝합니다.
- 개별 콜로니를 선택하고 뉴클레아제가 없는 물 20μL에 재현탁하고 95°C에서 15분 동안 가열한 다음 용해물 1μL를 콜로니 PCR을 위한 DNA 템플릿으로 사용합니다. 단계 1.1.2에 기술된 eGFP 증폭을 위한 정방향 프라이머(이 예에서는 EGFP1)를 사용하고, 역방향 프라이머로서 프라이머 A264(5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3')를29로 사용한다.
- 프라이머 A264는 pLEXSY-2.1 발현 벡터에 삽입된 코돈의 정지 후 80 bp를 어닐링하도록 설계된다. 예를 들어, 프라이머 쌍 EGFP1 + A264의 경우, 94°C에서 2분의 초기 변성, 이어서 94°C에서 30초, 50°C에서 30초, 72°C에서 1분의 30주기로 구성된 PCR 사이클링 프로토콜을 사용합니다. 72°C에서 10분의 최종 연장 단계를 실행합니다. 프라이머는 0.2 μM의 최종 농도로 첨가됩니다.
참고: 이 프라이머 세트를 사용할 것으로 예상되는 제품의 길이는 859bp입니다. 프라이머 EGFP1 및 A264의 어닐링 부위는 그림 2에 나와 있습니다.
- 시판되는 플라스미드 단리 키트 또는 표준 알칼리성 침전을 사용하여 후속 형질감염을 위해 양성 클론으로부터 정제된 플라스미드 DNA를 준비한다33. 최소 10μg의 플라스미드/양성 클론을 분리하기 위해 30°C에서 하룻밤 동안 50mL를 사용합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 BglII 및 KpnI을 사용하여 eGFP-PCR 산물의 끝을 자릅니다.
2. pLEXSY 발현 플라스미드의 선형화
- SwaI(인식 부위: 5'-ATTTAAAT-3')로 분해하기 위해 정제된 pLEXSY-eGFP 플라스미드 최소 10μg을 사용합니다. 25 °C에서 3-4 시간 동안 소화하고 65 °C에서 20 분 동안 열 비활성화합니다.
- 분해 생성물을 아가로스 겔 전기영동에서 실행하여 생성된 단편을 분리합니다. 이 소화는 대장균에서 복제 및 선택에 필요한 요소를 나타내는 2.9kbp 단편과 선형화된 발현 카세트를 나타내는 7-8kbp 단편의 두 단편을 생성합니다.
- 발현 카세트를 시판되는 아가로스 겔 추출 키트를 사용하여 정제한다.
3. 전기천공법에 의한 L. panamensis 및 L. donovani 의 형질감염
참고: 리슈만편모충 문화는 다른 곳에서 설명한 대로 수행됩니다34. 이 예에서 L. panamensis 및 L . donovani promastigotes를 Schneider의 곤충 배지에서 배양하고 20%(v/v) 소 태아 혈청(FBS) 및 50μg/mL 겐타마이신을 보충하고 26°C에서 배양했습니다.
- 형질감염당 약 4 x 107 개의 기생충을 사용하기에 충분한 로그상 또는 초기 고정상 프로마스티고트가 있을 때까지 기생충 배양을 성장시킵니다. 정지기에 도달하기 전의 배양 플라스크당 최대 세포 밀도는 리슈만편모충 종과 균주가 실험실 조건에 얼마나 잘 적응하는지에 따라 달라질 수 있습니다. 필요한 경우 여러 배양 플라스크의 내용물을 풀링합니다.
- 기생충 배양액을 실온(RT)에서 2,000 x g 에서 3분 동안 원심분리한다.
- 펠릿을 4°C(21mM HEPES, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mMNa2HPO4및 6mM 포도당, pH 7.5)에서 전기천공 완충액에 재현탁하여 1 x 108 기생충/mL의 농도를 얻습니다. 10 분 동안 얼음에 올려 놓으십시오.
알림: electroporation 버퍼는 사용하기 전에 여과하여 멸균해야 합니다. - 병렬로, 최대 부피 50μL의 물 또는 10mM 트리스 완충액(pH 8.0)과 d = 2mm의 전기천공 큐벳에 2-10μg의 선형화된 pLEXSY-eGFP 구조가 있는 사전 냉각 튜브.
- 선형화된 플라스미드가 있는 튜브에 미리 냉각된 기생충 350μL를 추가하고 전체 400μL를 얼음 위의 전기천공 큐벳으로 옮깁니다. 동시에, 플라스미드 DNA가 없는 기생충 세포를 음성 대조군으로 전기천공합니다.
- 다음 두 가지 프로토콜 중 하나를 사용하여 전기를 충전합니다.
지수 감쇠: 450 V, 450 μF, 1 펄스.
시간 상수: 450V, T = 3.5ms, 1펄스.
참고: 이 프로토콜은 PC 및 CE 모듈과 함께 상용 유전자 펄서(재료 표)를 사용하여 실행되었습니다. - 큐벳을 다시 얼음 위에 10분 동안 놓고 전기천공된 기생충을 적절한 배양 배지 5mL에 옮깁니다. 이 예에서는 20%(v/v) FBS가 보충된 Schneider의 곤충 배지를 사용했습니다. 26°C에서 20시간 동안 배양합니다.
4. 배양에서의 다클론 선택
- 전기천공 후 약 20시간 후에 현미경으로 배양물을 관찰합니다. 기생충 개체군의 절반 이상이 시각적으로 좋은 형태와 운동성을 보여야 합니다(진동하는 편모가 매체를 통해 이동하거나 활성 기생충 응집체를 형성하는 물방울 모양의 프로마스티고트). 사용된 pLEXSY 플라스미드에 따라 적절한 선택적 항생제를 추가합니다. 이 예에서는 pLEXSY-sat2.1이 사용되며, 이는 스트렙토 트리신 아세틸 트랜스퍼 라제를 선택 마커로 포함합니다. 따라서 누르세오트리신을 0.1mg/mL 농도의 선택적 항생제로 사용하십시오.
- 플라스미드 DNA가 있는 기생충과 없는 기생충 사이에 명확한 차이가 보일 때까지 배양을 현미경으로 추적합니다.
- 유세포 분석을 통해 기생충 형광을 확인합니다.
- 고정상 배양액 1 mL를 2,000 x g 에서 RT에서 3분 동안 원심분리하여 PBS에서 2회 세척하고 최종 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다.
참고: eGFP의 형광은 대부분의 상용 세포분석기의 FL1 채널에서 검출할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란에 대한 이득 설정과 FL1 채널은 세포분석기마다 다를 수 있습니다. 이 예에서는 CyFlow 공간(Sysmex) 세포분석기를 사용했습니다. - 샘플을 실행하여 0.5μL/s의 속도로 20,000개의 이벤트를 수집하고 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 및 형광 1(FL-1) 채널의 이득 값을 각각 225.0, 200.0 및 520.0으로 설정합니다. 비형광 기생충이 있는 대조군 샘플을 실행하여 FSC 대 SSC dot-plot에서 기생충 개체군을 결정합니다.
- 기생충 개체군을 포함하는 게이트(G1)를 만들고 프로마스티고트의 자가형광을 측정하고 FL-1 채널에 대한 범위 게이트(G2)를 설정하기 위해 해당 게이트를 통해 FL-1 채널을 필터링합니다.
- transfection 된 기생충을 실행하여 형광이 있는지 확인하십시오. G1에서 형광 기생충의 백분율과 G2의 형광 강도 평균을 기록합니다.
- 고정상 배양액 1 mL를 2,000 x g 에서 RT에서 3분 동안 원심분리하여 PBS에서 2회 세척하고 최종 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다.
5. 게놈 통합 확인
참고: pLEXSY-eGFP 발현 카세트의 통합은 발현 카세트(사용된 pLEXSY-2.1 벡터에 따라 다름)에 혼성화하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 F3002(5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3')를 사용하여 진단 PCR로 확인할 수 있습니다. 이 예에서 F2999 정방향 프라이머(5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3')는 pLEXSY-sat2.1 발현 카세트에서 하이브리드화되는 대로 사용됩니다. 진단 PCR을 위한 통합 발현 카세트 및 프라이머 어닐링 부위의 개략도가 그림 2에 나와 있습니다.
- 고정상 기생충 배양액 2-5 mL에서 기존의 페놀/클로로포름 추출35 또는 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 정제합니다.
- 94°C에서 2분의 초기 변성, 94°C에서 30초, 53°C에서 30초, 72°C에서 1분의 30주기로 구성된 사이클링 프로토콜을 사용하여 pLEXSY-sat2.1에 대한 진단 PCR을 수행합니다. 72°C에서 10분의 최종 연장 단계를 실행합니다. 프라이머는 0.2 μM의 최종 농도로 첨가됩니다.
그림 2: 통합 발현 카세트의 개략도. Chr-S(회색)로 표지된 상자는 발현 카세트가 통합된 18S rRNA 유전자좌(ssu)의 인접한 염색체 서열을 나타냅니다. 통합 발현 카세트는 ssu 유전자좌로의 상동 재조합을 위한 5' 및 3' 서열(파란색), 단백질 생산 향상을 위한 추가 리슈만편모충 리보솜 프로모터(빨간색), eGFP 유전자(녹색), 선택 마커 유전자(노란색) 및 3개의 비번역 영역(밝은 회색)), 즉 utr1, 2 및 3은 리슈만편모충 기생충에서 eGFP 및 선택 마커의 최적화된 발현을 위한 전사 후 mRNA 처리를 위한 스플라이싱 신호를 제공합니다. 콜로니 PCR(단계 1.2.5)에 의한 삽입물 존재의 검증에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머를 위한 어닐링 부위는 각각 cpcr-fwd (EGFP1 프라이머) 및 cpcr-rev (A264 프라이머)로 표지된 검은색 화살표로 표시되며, 이는 859 bp 생성물을 구분한다. 진단 PCR(단계 5)에 의한 게놈 통합 검증에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머의 어닐링 부위는 각각 sat-fwd(F2999 프라이머) 및 ssu-rev(F3002 프라이머)로 표시된 검은색 화살표로 표시되며, 이는 2,271bp 산물을 구분합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 희석 제한에 의한 복제(선택 사항)
- 유세포 분석을 통해 형광을 확인한 후 5개의 promastigotes/mL36 농도로 재조합 기생충의 희석액을 준비합니다.
- 이 희석액 100μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이러한 방식으로, 플레이트는 0.5 promastigotes/well의 평균 밀도로 시딩되며, 이는 일부 웰이 웰 당 하나 이상의 기생충을 가질 확률을 최소화하면서 단일 기생충을 수용하도록 보장한다(36).
- 플레이트를 최소 12시간 동안 그대로 두십시오. 기생충 성장이 감지될 때까지 최소 100배의 배율로 플레이트를 현미경으로 추적합니다.
- 플레이트 웰에 기생충이 가득 차면 내용물을 사용하여 5mL 배양액을 접종합니다. 이것은 1-2 주가 걸립니다.
- 클론 시드 배양이 정지 단계에 도달하면 4.3단계에 설명된 대로 유세포 분석을 사용하여 형광을 확인합니다. 형광 기생충의 백분율 및 FL-1 채널에서 측정된 평균 형광 강도에 기초하여 추가의 시험관내 및 생체 내 분석에 사용될 클론을 선택한다. 98%-99%의 형광 기생충을 가진 클론을 목표로 하고 평균 형광 강도가 가장 높은 클론을 선택하십시오.
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Representative Results
pLEXSY-eGFP 구축물을 구축하고 적격한 대장균 세포를 형질전환한 후, eGFP 삽입물이 있는 구축물을 포함하는 콜로니는 섹션 1.2에 설명된 콜로니 PCR을 실행한 후 약 859bp 산물을 생성합니다(그림 3A). SwaI을 사용하여 양성 콜로니에서 정제된 플라스미드의 전체 소화는 겔 전기영동에서 두 가지 특징적인 단편, 즉 대장균에서 복제 및 선택에 필요한 모든 요소를 포함하는 PLEXSY 벡터의 일부인 2.9kbp 단편과 형질감염에 사용되는 선형화된 발현 카세트를 나타내는 7-8kpb 단편을 제공해야 합니다(그림 3B).
형질감염 후, 다클론 선택은 대부분 정성적으로 이루어진다. 항생제로 선택하는 동안 기생충 배양의 상태는 현미경으로 모니터링되어 기생충 형태와 운동성에 특별한주의를 기울입니다. 형질주입된 기생충 배양을 성공적으로 회복한 후 eGFP를 효과적으로 발현하는 기생충을 유세포 분석기의 FL-1 채널에서 검출해야 합니다(그림 4A). 형질감염 효율은 상이한 리슈만편모충 종에 따라 다를 수 있다. 이 연구에서, 다클론 선택 후, 유세포 분석에 의해 분석된 L. donovani 기생충의 98.44%는 L. panamensis의 82.00 %와 비교하여 형광을 띠었습니다(그림 4B). pLEXSY-eGFP 발현 카세트가 ssu 유전자좌에 성공적으로 통합된 경우 섹션 5에 설명된 진단 PCR을 실행한 후 2.3kbp 제품을 관찰해야 합니다(그림 4C). 이러한 결과는 통합 이식유전자로서 구성적으로 eGFP를 발현하는 재조합 기생충이 얻어지고 기생충 배양의 후속 계대에서 안정적으로 유지되도록 합니다.
희석을 제한하여 클로닝하면 L. panamensis와 같이 형질주입 효율이 낮은 형광 기생충 개체군을 농축할 수 있을 뿐만 아니라 형광 강도가 가장 높은 클론을 선택할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 리슈만편모충 종 각각에 대해 4개의 클론, 즉 L. panamensis의 경우 Lpan-A7, F11, F12 및 H2, L. donovani의 경우 Ldon-C1, G4, F2 및 H1이 얻어졌습니다. 형광 기생충 비율이 가장 높은 클론(Lpan-F11 = 95.74%; Ldon-C1 = 99.16%) 및 평균 형광 강도(Lpan-F11 = 35.63 상대 형광 단위[RFU]; Ldon-C1 = 14.12 RFU)를 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택하였다.
그림 3: 형질감염을 위한 pLEXSY-eGFP 구조체 제조 의 대표적인 결과. (A) 콜로니 PCR의 대표적인 결과. 레인 1: 1kb 사다리(기본 쌍의 단위); 레인 2, 10 및 12: 음성 샘플ampeGFP 삽입물의 존재에 대해; 레인 3-9 및 13-14: 양성ampeGFP 삽입물의 존재에 대한 파일. (B) SwaI. Lane 1을 사용한 선형화 결과: 1kb 래더(염기쌍의 단위); 레인 2-4: eGFP 삽입물의 존재에 대해 양성인 3개의 상이한 콜로니로부터 정제된 플라스미드의 소화 반응. 대장균에서 복제 및 선택에 필요한 요소를 나타내는 2.9kbp 단편과 선형화된 발현 카세트를 나타내는 7-8kpb 단편이 관찰됩니다. 두 겔 모두 1%의 아가로스 농도에서 제조되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 발현 카세트의 eGFP 발현 및 염색체 삽입 확인의 대표적인 결과. (A) FL-1 채널의 유세포 분석 히스토그램. 빨간색: eGFP가 없는 야생형 세포; 파란색: eGFP를 발현하는 인구의 82.00%를 가진 L. panamensis 기생충을 형질감염시켰습니다. (B) L. panamensis (Lpan-1)와 L. donovani (Ldon-1) 사이의 형질 주입 결과 비교. 다클론 선별 후 L. donovani(98.44%)에서 L. panamensis(82.00%)보다 더 높은 형질주입 효율이 관찰되었습니다. (C) 게놈 통합 확인을 위한 PCR 결과. L: 100bp 사다리(염기쌍 단위); 레인 1-4: ssu 유전자좌 내로의 pLEXSY-sat2.1 통합에 대한 특징적인 2.3 kbp 생성물을 보여주는 L. panamensis의 4개의 상이한 클론으로부터의 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 종 | 코드 복제 | 형광 기생충의 비율 | 평균 형광 강도* |
| L. 파나멘시스 | LPAN-A7 시리즈 | 90.00 | 24.70 |
| LPAN-F11 시리즈 | 95.74 | 35.63 | |
| LPAN-F12 시리즈 | 92.85 | 34.44 | |
| LPAN-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. 도노바니 | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
표 1: 제한 희석에 의해 얻어진 클론. 이 작업에 사용된 각 리슈만편모충 종에 대한 희석을 제한하여 4개의 클론을 얻었습니다. 형광 기생충의 백분율 및 평균 형광 강도가 각 클론에 대해 보고됩니다. *형광은 상대 형광 단위(RFU)로 표시됩니다.
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Discussion
다양한 리포터 유전자의 장점과 단점은 여러 원생동물 기생충에서 연구되었습니다. 그 중 GFP와 eGFP는 본질적으로 형광성이며 정량화 및 이미징이 용이합니다. 이러한 단백질의 형광 활성은 형광 현미경, 형광 측정 또는 유세포 분석을 사용하여 최소한의 조작으로 검출할 수 있습니다. GFP 발현 L을 생성하기 위한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. (Viannia) 균주는, GFP 및 그 유도체의 견고성이 구세계 리슈만편모충 종15,16,18,24에서 리포터 유전자로 입증되었음에도 불구하고. Varela et al.37은 GFP를 에피솜 이식유전자로 발현하는 L. panamensis 균주를 개발했습니다. axenic promastigotes 및 intracellular amastigotes 모두의 유세포 분석 분석은 약물 스크리닝 분석에 대한 이러한 기생충의 유용성을 보여주었습니다. 그러나, 형광은 매우 이질적이었고, 형질주입된 집단에서 형광 기생충의 수는 항생제 튜니카마이신을 사용한 일정한 선택 압력에 의존하였다. 이러한 사실은 튜니카마이신이 감염된 대식세포에 첨가될 수 없다는 점을 감안할 때 약물 스크리닝 분석을 위한 세포내 무염기로 이러한 기생충을 사용하는 것을 제한합니다38, 감염된 대식세포의 정량화를 편향시킬 수 있는 세포내 무식세포 집단에 낮은 형광을 가진 기생충이 존재합니다.
pLEXSY와 같은 벡터의 사용은 상동 재조합에 의한 이식유전자의 통합을 통해 리슈만편모충 종 기생충의 안정적인 변형을 위한 강력하고 신뢰할 수 있는 도구가 된다28. pLEXSY 카세트는 18S rRNA 유전자좌(ssu)에 통합되며, 그 전사는 RNA 중합효소 I 강력한 프로모터의 제어 하에 있어 더 높은 전사율(20)을 유도한다. 이 시스템의 사용은 표적 단백질27의 안정하고 균질한 발현을 허용하는 것으로 입증되었다. 이러한 특성은 eGFP의 발현과 감염된 세포에서 균일한 수준의 형광을 갖는 세포내 분석에서의 사용뿐만 아니라 쥐 모델에서의 실험적 감염에 대한 사용에 유리합니다. 이 프로토콜에 사용된 pLEXSY-2.1 벡터 패밀리는 발현 카세트 앞에 추가적인 리슈만편모충 리보솜 프로모터를 사용하여 단백질 생산을 향상시키도록 설계되었습니다29,30.
이 프로토콜에는 최적의 결과를 얻기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 표적 유전자의 클로닝은 고충실도 중합효소(33)를 사용하여 수행되어야 하며, 클로닝을 위해 BglII/KpnI 조합을 사용할 때 표적 DNA 및 발현 벡터의 분해는 순차적 분해 프로토콜을 사용하여 수행되어야 합니다. 후자는 Bgl II와 Kpn I 모두 동일한 온도(37°C)에서 최적으로 활성이지만 BglII와 KpnI 모두 최적의 활성을 나타내는 완충액이 없기 때문입니다. 둘째, pLEXSY 플라스미드가 대장균 28,29에서 이 온도에서 더 안정하기 때문에 대장균에서 형질전환 후 재조합 클론의 선택은 30°C에서 수행되어야 합니다. 또한 L. panamensis와 L. donavani의 성장률은 상당히 다를 수 있습니다. 이 기사에서 설명한 실험을 수행하는 동안 L. panamensis는 일반적으로 정지 단계에 도달하는 데 더 오래 걸렸습니다. 성장률은 또한 다른 실험실에서 균주마다 다를 수 있습니다. 따라서 전기천공에 필요한 기생충 농도에 도달하는 데 필요한 시간을 추정하기 위해 실험실 균주의 성장률을 특성화할 필요가 있습니다. 전기천공을 위해 Bolhassani et al.27에 의해 보고된 완충액을 사용하는 것은 원래 Jena Bioscience 프로토콜에서 제안한 바와 같이 배양 배지에서 직접 전기천공과 비교하여 전기천공된 기생충의 생존을 크게 증가시키는 중요한 변형입니다. 다클론 선별 과정에서 선택적 항생제를 첨가하기 전에 전기 천공 배양 물이 과도하게 자라지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면, 비-재조합 기생충이 재조합 기생충을 능가할 것이다27. 항생제 내성 재조합 기생충의 탁한 배양과 명확한 음성 대조군을 얻기 위해 적절한 항생제와 함께 신선한 배지에 한두 번의 연속 계대(1:10 접종물)가 필요합니다. 통과는 첫 번째 항생제 첨가 후 5 일 이내에 이루어져야합니다. 마지막으로, L. panamensis와 L. donovani 사이에 pLEXSY 발현 카세트의 형질주입 및 통합의 효율성에 현저한 차이가 있습니다 24,37. L. donovani에서는 다클론 선택 후 유세포 분석을 통해 분석된 전체 인구의 거의 98%가 형광을 나타내는 반면, L. panamesis에서는 형광 기생충의 비율이 약 80%입니다. 이러한 이유로, 희석을 제한하여 클로닝하는 선택적 단계는 유세포 분석을 통해 분석된 기생충의 95% 이상이 형광인 L. panamensis 개체군을 얻는 데 주로 필요한 변형입니다. pLEXSY 플라스미드는 원래 L. tarentolae를 단백질 생산 플랫폼으로 사용하기 위해 설계되었기 때문에 리슈만편모충 종의 게놈 변형으로 사용이 제한된다28. pLEXSY는 L. tarentolae21,24,27과 다른 여러 리슈만편모충 종에서 효과가 있는 것으로 입증되었지만, 새로운 리슈만편모충 종으로 작업할 때 pLEXSY 플라스미드의 재조합 부위가 효과가 있는지 확인하기 위해 ssu 서열의 보존을 확인하는 것이 중요합니다.
이 기사에 설명된 방법은 eGFP 또는 관심 있는 다른 리포터의 구성적이고 안정적인 발현을 가진 재조합 리슈만편모 충 기생충의 생산을 허용합니다. 이 기생충에서 형광은 균질하며 세포 내 형태로 유지됩니다. 따라서 이 과정을 통해 생성된 균주는 천연 및 합성 기원 분자의 잠재적인 항리슈만편모충 활성을 평가하기 위해 고처리량 약물 스크리닝 분석을 표준화하는 데 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, 보조금 번호 NI-177-2016 및 Sistema Nacional de Investigación (SNI), 파나마, 보조금 번호 SNI-169-2018, SNI-008-2022 및 SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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