ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza
Summary
Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.
Abstract
Il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è una tecnica robusta che consente la profilazione dell’accessibilità della cromatina a livello di genoma. Questa tecnica è stata utile per comprendere i meccanismi regolatori dell’espressione genica in una serie di processi biologici. Sebbene ATAC-seq sia stato modificato per diversi tipi di campioni, non ci sono state modifiche efficaci dei metodi ATAC-seq per i tessuti adiposi. Le sfide con i tessuti adiposi includono la complessa eterogeneità cellulare, il grande contenuto lipidico e l’elevata contaminazione mitocondriale. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente l’ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando la selezione del nucleo attivata dalla fluorescenza con tessuti adiposi dal topo transgenico reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Questo protocollo produce dati di alta qualità con letture di sequenziamento minime sprecate, riducendo al contempo la quantità di input del nucleo e reagenti. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate passo-passo per il metodo ATAC-seq convalidato per l’uso di nuclei di adipociti isolati da tessuti adiposi di topo. Questo protocollo aiuterà nello studio della dinamica della cromatina negli adipociti su diverse stimolazioni biologiche, che consentiranno nuove intuizioni biologiche.
Introduction
Il tessuto adiposo, specializzato per immagazzinare l’energia in eccesso sotto forma di molecole lipidiche, è un organo chiave per la regolazione metabolica. Lo stretto controllo della formazione e del mantenimento degli adipociti è vitale per la funzione del tessuto adiposo e l’omeostasi energetica di tutto il corpo1. Molti regolatori trascrizionali svolgono un ruolo critico nel controllo della differenziazione, della plasticità e della funzione degli adipociti; Alcuni di questi regolatori sono implicati nei disordini metabolici nell’uomo 2,3. I recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento ad alto rendimento per l’espressione genica e l’analisi epigenomica hanno ulteriormente facilitato la scoperta dei regolatori molecolari della biologia degli adipociti4. Gli studi di profilazione molecolare che utilizzano tessuti adiposi sono difficili da condurre a causa dell’eterogeneità di questi tessuti. Il tessuto adiposo è costituito principalmente da adipociti, che sono responsabili dell’accumulo di grasso, ma contiene anche vari altri tipi di cellule, come fibroblasti, cellule endoteliali e cellule immunitarie5. Inoltre, la composizione cellulare del tessuto adiposo è drasticamente alterata in risposta a cambiamenti fisiopatologici come la temperatura e lo stato nutrizionale6. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un topo reporter transgenico, chiamato Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), che produce ribosomi con GFP e nuclei biotinilati marcati con mCherry in modo dipendente dalla ricombinasi Cre7. Il sistema di doppia marcatura consente di eseguire analisi trascrittomiche ed epigenomiche specifiche per tipo cellulare con i tessuti. Utilizzando topi NuTRAP incrociati con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-NuTRAP), abbiamo precedentemente caratterizzato i profili di espressione genica e gli stati di cromatina da popolazioni di adipociti puri in vivo e determinato come sono alterati durante l’obesità 7,8. In precedenza, topi NuTRAP incrociati con linee Ucp1-Cre specifiche per adipociti marroni e beige (Ucp1-NuTRAP) ci hanno permesso di caratterizzare il rimodellamento epigenomico della rara popolazione di adipociti termogenici, gli adipociti beige, in risposta ai cambiamenti di temperatura9.
ATAC-seq è un metodo analitico ampiamente utilizzato per valutare l’accessibilità della cromatina a livello di genoma. La trasposasi Tn5 iper-reattiva utilizzata in ATAC-seq consente l’identificazione di regioni aperte della cromatina marcando adattatori di sequenziamento nella regione accessibile alla cromatina dei nuclei10. ATAC-seq è un metodo semplice, ma fornisce risultati robusti ed è altamente efficiente anche con campioni a basso input. È diventato, quindi, uno dei metodi di profilazione epigenomica più popolari e ha contribuito alla comprensione dei meccanismi regolatori dell’espressione genica all’interno di diversi contesti biologici. Da quando è stato creato il protocollo ATAC-seq originale, varie tecniche derivate da ATAC-seq sono state ulteriormente sviluppate per modificare e ottimizzare il protocollo per vari tipi di campioni. Ad esempio, Fast-ATAC è progettato per analizzare campioni di cellule del sangue11, Omni-ATAC è un protocollo ottimizzato per campioni di tessuto congelato 12 e MiniATAC-seq è efficace per l’analisi embrionale in fase iniziale13. Tuttavia, l’applicazione del metodo ATAC-seq agli adipociti, in particolare da campioni di tessuto, è ancora impegnativa. Oltre all’eterogeneità del tessuto adiposo, il suo elevato contenuto lipidico può interferire con efficaci reazioni di ricombinazione da parte della trasposasi Tn5 anche dopo l’isolamento del nucleo. Inoltre, l’elevato contenuto mitocondriale negli adipociti, in particolare negli adipociti marroni e beige, causa un’elevata contaminazione del DNA mitocondriale e letture di sequenziamento sprecate. Questo documento descrive un protocollo per ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando topi Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Sfruttando la selezione dei nuclei marcati con fluorescenza, questo protocollo consente la raccolta di popolazioni pure di nuclei di adipociti lontano da altri tipi di cellule confondenti e l’efficiente rimozione di lipidi, mitocondri e detriti tissutali. Quindi, questo protocollo può generare dati di alta qualità specifici del tipo di cellula e ridurre al minimo gli sprechi dalle letture mitocondriali utilizzando una quantità ridotta di input e reagenti rispetto al protocollo standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo ATAC-seq ottimizzato per valutare l’accessibilità della cromatina adipocita-specifica in vivo. Questo protocollo ATAC-seq che utilizza il mouse Adipoq-NuTRAP ha generato con successo profili di accessibilità della cromatina adipociti-specifici. Il fattore più critico per esperimenti ATAC-seq di successo e riproducibili è la qualità del nucleo. È fondamentale congelare immediatamente i tessuti adiposi sezionati in azoto liquido e conservarli in modo sicur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dallo IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), un centro IUSM per il diabete e le malattie metaboliche Pilot and Feasibility grant (a H.C.R.), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 a H.C.R.), e l’American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 a H.C.R.).
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
References
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