Floresan Aktif Çekirdek Ayıklama Kullanarak Yağ Dokuları ile Adiposit-Spesifik ATAC-Seq
Summary
Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.
Abstract
Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için test, genom çapında kromatin erişilebilirlik profillemesini sağlayan sağlam bir tekniktir. Bu teknik, bir dizi biyolojik süreçte gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarını anlamak için yararlı olmuştur. ATAC-seq farklı numune tipleri için modifiye edilmiş olmasına rağmen, yağ dokuları için ATAC-seq yöntemlerinin etkili modifikasyonları olmamıştır. Yağ dokuları ile ilgili zorluklar arasında karmaşık hücresel heterojenite, büyük lipit içeriği ve yüksek mitokondriyal kontaminasyon sayılabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, transgenik muhabir Nuclear etiketleme ve Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) faresinden yağ dokuları ile floresan aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanarak adiposit spesifik ATAC-seq sağlayan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, çekirdek girişi ve reaktiflerin miktarını azaltırken minimum boşa harcanan sıralama okumalarıyla yüksek kaliteli veriler üretir. Bu yazıda, fare yağ dokularından izole edilen adiposit çekirdeklerinin kullanımı için doğrulanmış ATAC-seq yöntemi için ayrıntılı adım adım talimatlar verilmektedir. Bu protokol, adipositlerdeki kromatin dinamiklerinin çeşitli biyolojik stimülasyonlar üzerinde araştırılmasına yardımcı olacak ve bu da yeni biyolojik anlayışlara izin verecektir.
Introduction
Fazla enerjiyi lipit molekülleri şeklinde depolamak için uzmanlaşmış olan yağ dokusu, metabolik düzenleme için kilit bir organdır. Adiposit oluşumunun ve bakımının sıkı kontrolü, yağ dokusu fonksiyonu ve tüm vücut enerji homeostazı için hayati öneme sahiptir1. Birçok transkripsiyonel düzenleyici, adiposit farklılaşmasının, plastisitesinin ve fonksiyonunun kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; Bu düzenleyicilerin bazıları insanlarda metabolik bozukluklarla ilişkilidir 2,3. Gen ekspresyonu ve epigenomik analiz için yüksek verimli dizileme tekniklerindeki son gelişmeler, adiposit biyolojisinin moleküler düzenleyicilerinin keşfini daha da kolaylaştırmıştır4. Yağ dokularını kullanan moleküler profilleme çalışmaları, bu dokuların heterojenliği nedeniyle zordur. Yağ dokusu öncelikle yağ depolamadan sorumlu olan adipositlerden oluşur, ancak aynı zamanda fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi çeşitli diğer hücre tiplerini de içerir5. Ek olarak, yağ dokusunun hücresel bileşimi, sıcaklık ve beslenme durumu6 gibi patofizyolojik değişikliklere yanıt olarak dramatik bir şekilde değişir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, daha önce GFP etiketli ribozomlar ve mCherry etiketli biyotinile çekirdekleri Cre rekombinazına bağımlı bir şekilde üreten Nükleer Etiketleme ve Çevirme Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) adlı transgenik bir muhabir fare geliştirdik7. Çift etiketleme sistemi, dokularla hücre tipine özgü transkriptomik ve epigenomik analizlerin yapılmasını sağlar. Adiposit-spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-NuTRAP) ile çaprazlanan NuTRAP farelerini kullanarak, daha önce in vivo saf adiposit popülasyonlarından gen ekspresyon profillerini ve kromatin durumlarını karakterize ettik ve obezite sırasında nasıl değiştiklerini belirledik 7,8. Daha önce, NuTRAP fareleri kahverengi ve bej adiposit spesifik Ucp1-Cre çizgileri (Ucp1-NuTRAP) ile geçti, sıcaklık değişimlerine yanıt olarak nadir termojenik adiposit popülasyonunun, bej adipositlerin epigenomik yeniden şekillenmesini karakterize etmemize izin verdi9.
ATAC-seq, genom çapında kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan analitik bir yöntemdir. ATAC-seq’te kullanılan hiper-reaktif Tn5 transpozaz, çekirdeklerin kromatinden erişilebilir bölgesindeki dizileme adaptörlerini etiketleyerek açık kromatin bölgelerinin tanımlanmasına izin verir10. ATAC-seq basit bir yöntemdir, ancak sağlam sonuçlar sağlar ve düşük girişli numunelerde bile oldukça verimlidir. Bu nedenle, en popüler epigenomik profilleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir ve çeşitli biyolojik bağlamlarda gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Orijinal ATAC-seq protokolü oluşturulduğundan beri, protokolü çeşitli numune türleri için değiştirmek ve optimize etmek için çeşitli ATAC-seq türevi teknikler daha da geliştirilmiştir. Örneğin, Fast-ATAC kan hücresi örneklerini analiz etmek için tasarlanmıştır11, Omni-ATAC dondurulmuş doku örnekleri12 için optimize edilmiş bir protokoldür ve MiniATAC-seq erken evre embriyo analizi13 için etkilidir. Bununla birlikte, ATAC-seq yönteminin adipositlere, özellikle doku örneklerinden uygulanması hala zordur. Yağ dokusunun heterojenliğine ek olarak, yüksek lipid içeriği, çekirdek izolasyonundan sonra bile Tn5 transpozaz tarafından etkili rekombinasyon reaksiyonlarına müdahale edebilir. Ayrıca, adipositlerdeki, özellikle kahverengi ve bej adipositlerdeki yüksek mitokondriyal içerik, yüksek mitokondriyal DNA kontaminasyonuna ve boşa harcanan dizileme okumalarına neden olur. Bu yazıda Adipoq-NuTRAP fareleri kullanılarak adiposit-spesifik ATAC-seq için bir protokol açıklanmaktadır (Şekil 1). Floresan etiketli çekirdek sıralamadan yararlanarak, bu protokol adiposit çekirdeğinin saf popülasyonlarının diğer kafa karıştırıcı hücre tiplerinden uzakta toplanmasına ve lipitlerin, mitokondrilerin ve doku kalıntılarının etkili bir şekilde uzaklaştırılmasına izin verir. Bu nedenle, bu protokol hücre tipine özgü yüksek kaliteli veriler üretebilir ve standart protokole kıyasla daha az miktarda girdi ve reaktif kullanırken mitokondriyal okumalardan kaynaklanan israfı en aza indirebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, adiposit spesifik kromatin erişilebilirliğini in vivo olarak değerlendirmek için optimize edilmiş bir ATAC-seq protokolü sunduk. Adipoq-NuTRAP fareyi kullanan bu ATAC-seq protokolü, adiposite özgü kromatin erişilebilirlik profillerini başarıyla oluşturdu. Başarılı ve tekrarlanabilir ATAC-seq deneyleri için en kritik faktör çekirdek kalitesidir. Disseke edilmiş yağ dokularının sıvı azot içinde derhal yapışıp dondurulması ve kullanıma kadar çözülmeden -80 ° C’de güve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, IUSM Showalter Araştırma Güven Fonu (H.C.R.’ye), bir IUSM Diyabet ve Metabolik Hastalıklar Merkezi Pilot ve Fizibilite hibesi (HCR’ye), Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK129289’dan H.C.R.’ye) ve Amerikan Diyabet Derneği Genç Fakülte Ödülü (7-21-JDF-056’dan H.C.R.’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin’s hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
