ATAC-Seq específico de adipocitos con tejidos adiposos mediante clasificación de núcleos activados por fluorescencia
Summary
Presentamos un protocolo para el ensayo de cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) específicamente en adipocitos utilizando clasificación de núcleos con tejidos adiposos aislados de ratones reporteros transgénicos con marcado de fluorescencia nuclear.
Abstract
El ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es una técnica robusta que permite la elaboración de perfiles de accesibilidad de cromatina en todo el genoma. Esta técnica ha sido útil para comprender los mecanismos reguladores de la expresión génica en una variedad de procesos biológicos. Aunque ATAC-seq se ha modificado para diferentes tipos de muestras, no ha habido modificaciones efectivas de los métodos ATAC-seq para tejidos adiposos. Los desafíos con los tejidos adiposos incluyen la compleja heterogeneidad celular, el gran contenido de lípidos y la alta contaminación mitocondrial. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite ATAC-seq específico de adipocitos mediante el empleo de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia con tejidos adiposos del ratón transgénico reportero Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produce datos de alta calidad con lecturas de secuenciación desperdiciadas mínimas al tiempo que reduce la cantidad de entrada de núcleo y reactivos. Este documento proporciona instrucciones detalladas paso a paso para el método ATAC-seq validado para el uso de núcleos de adipocitos aislados de tejidos adiposos de ratón. Este protocolo ayudará en la investigación de la dinámica de la cromatina en adipocitos sobre diversas estimulaciones biológicas, lo que permitirá nuevos conocimientos biológicos.
Introduction
El tejido adiposo, que está especializado para almacenar el exceso de energía en forma de moléculas lipídicas, es un órgano clave para la regulación metabólica. El control estricto de la formación y mantenimiento de los adipocitos es vital para la función del tejido adiposo y la homeostasis energética de todo el cuerpo1. Muchos reguladores transcripcionales desempeñan un papel crítico en el control de la diferenciación, plasticidad y función de los adipocitos; Algunos de estos reguladores están implicados en trastornos metabólicos en humanos 2,3. Los avances recientes en técnicas de secuenciación de alto rendimiento para la expresión génica y el análisis epigenómico han facilitado aún más el descubrimiento de los reguladores moleculares de la biología de los adipocitos4. Los estudios de perfiles moleculares que utilizan tejidos adiposos son difíciles de realizar debido a la heterogeneidad de estos tejidos. El tejido adiposo consiste principalmente en adipocitos, que son responsables del almacenamiento de grasa, pero también contiene varios otros tipos de células, como fibroblastos, células endoteliales y células inmunes5. Además, la composición celular del tejido adiposo se altera dramáticamente en respuesta a cambios fisiopatológicos como la temperatura y el estado nutricional6. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un ratón reportero transgénico, llamado Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), que produce ribosomas marcados con GFP y núcleos biotinilados marcados con mCherry de una manera dependiente de la recombinasa Cre7. El sistema de doble etiquetado permite realizar análisis transcriptómicos y epigenómicos específicos del tipo de célula con tejidos. Utilizando ratones NuTRAP cruzados con líneas adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-NuTRAP), previamente caracterizamos perfiles de expresión génica y estados de cromatina de poblaciones de adipocitos puros in vivo y determinamos cómo se alteran durante la obesidad 7,8. Anteriormente, los ratones NuTRAP cruzados con líneas Ucp1-Cre específicas de adipocitos marrones y beige (Ucp1-NuTRAP) nos permitieron caracterizar la remodelación epigenómica de la rara población de adipocitos termogénicos, los adipocitos beige, en respuesta a los cambios de temperatura9.
ATAC-seq es un método analítico ampliamente utilizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. La transposasa Tn5 hiperreactiva utilizada en ATAC-seq permite la identificación de regiones de cromatina abiertas mediante el etiquetado de adaptadores de secuenciación en la región accesible a la cromatina de los núcleos10. ATAC-seq es un método simple, pero proporciona resultados robustos y es altamente eficiente incluso con muestras de baja entrada. Por lo tanto, se ha convertido en uno de los métodos de perfil epigenómico más populares y ha contribuido a la comprensión de los mecanismos reguladores de la expresión génica en diversos contextos biológicos. Desde que se creó el protocolo ATAC-seq original, se han desarrollado varias técnicas derivadas de ATAC-seq para modificar y optimizar el protocolo para varios tipos de muestras. Por ejemplo, Fast-ATAC está diseñado para analizar muestras de células sanguíneas11, Omni-ATAC es un protocolo optimizado para muestras de tejido congelado 12 y MiniATAC-seq es eficaz para el análisis de embriones en etapa temprana13. Sin embargo, la aplicación del método ATAC-seq a los adipocitos, especialmente de muestras de tejido, sigue siendo un desafío. Además de la heterogeneidad del tejido adiposo, su alto contenido de lípidos puede interferir con reacciones de recombinación eficientes por la transposasa Tn5 incluso después del aislamiento del núcleo. Además, el alto contenido mitocondrial en los adipocitos, particularmente en los adipocitos marrones y beige, causa una alta contaminación del ADN mitocondrial y lecturas de secuenciación desperdiciadas. Este artículo describe un protocolo para ATAC-seq específico de adipocitos utilizando ratones Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Al aprovechar la clasificación de núcleos marcados con fluorescencia, este protocolo permite la recolección de poblaciones puras de núcleos de adipocitos lejos de otros tipos de células de confusión y la eliminación eficiente de lípidos, mitocondrias y restos de tejidos. Por lo tanto, este protocolo puede generar datos de alta calidad específicos del tipo de célula y minimizar el desperdicio de las lecturas mitocondriales mientras se utiliza una cantidad reducida de entrada y reactivos en comparación con el protocolo estándar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, hemos presentado un protocolo ATAC-seq optimizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina específica de adipocitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq que utiliza el ratón Adipoq-NuTRAP generó con éxito perfiles de accesibilidad de cromatina específicos de adipocitos. El factor más crítico para los experimentos ATAC-seq exitosos y reproducibles es la calidad del núcleo. Es fundamental congelar inmediatamente los tejidos adiposos disecados en nitrógeno líquido y almacenarlos de forma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), una subvención piloto y de viabilidad del Centro IUSM para la diabetes y las enfermedades metabólicas (a H.C.R.), el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (R01DK129289 a H.C.R.), y el Premio de la Facultad Junior de la Asociación Americana de Diabetes (7-21-JDF-056 a H.C.R.).
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
References
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