ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Summary

Apresentamos um protocolo para ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) especificamente em adipócitos usando classificação nuclear com tecidos adiposos isolados de camundongos repórteres transgênicos com marcação de fluorescência nuclear.

Abstract

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é uma técnica robusta que permite o perfil de acessibilidade da cromatina em todo o genoma. Esta técnica tem sido útil para a compreensão dos mecanismos regulatórios da expressão gênica em uma variedade de processos biológicos. Embora o ATAC-seq tenha sido modificado para diferentes tipos de amostras, não houve modificações efetivas dos métodos ATAC-seq para o tecido adiposo. Os desafios com o tecido adiposo incluem a complexa heterogeneidade celular, grande conteúdo lipídico e alta contaminação mitocondrial. Para superar esses problemas, desenvolvemos um protocolo que permite ATAC-seq específico de adipócitos empregando a classificação de núcleo ativado por fluorescência com tecidos adiposos do camundongo transgênico Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produz dados de alta qualidade com leituras de sequenciamento desperdiçadas mínimas, reduzindo a quantidade de entrada de núcleo e reagentes. Este artigo fornece instruções detalhadas passo a passo para o método ATAC-seq validado para o uso de núcleos de adipócitos isolados de tecidos adiposos de camundongos. Este protocolo auxiliará na investigação da dinâmica da cromatina em adipócitos após diversos estímulos biológicos, o que permitirá novos insights biológicos.

Introduction

O tecido adiposo, que é especializado para armazenar o excesso de energia na forma de moléculas lipídicas, é um órgão chave para a regulação metabólica. O controle rigoroso da formação e manutenção dos adipócitos é vital para a função do tecido adiposo e para a homeostase energética de todo o corpo¹. Muitos reguladores transcricionais desempenham um papel crítico no controle da diferenciação, plasticidade e função dos adipócitos; Alguns desses reguladores estão implicados em distúrbios metabólicos em humanos ^2,3. Avanços recentes em técnicas de sequenciamento de alto rendimento para expressão gênica e análise epigenômica têm facilitado ainda mais a descoberta dos reguladores moleculares da biologia dos adipócitos⁴. Estudos de perfis moleculares utilizando tecidos adiposos são desafiadores devido à heterogeneidade desses tecidos. O tecido adiposo é constituído principalmente por adipócitos, responsáveis pelo armazenamento de gordura, mas também contém vários outros tipos celulares, como fibroblastos, células endoteliais e células imunes⁵. Além disso, a composição celular do tecido adiposo é drasticamente alterada em resposta a mudanças fisiopatológicas, como temperatura^{e estado} nutricional6. Para superar esses problemas, desenvolvemos previamente um camundongo repórter transgênico, denominado Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), que produz ribossomos marcados com GFP e núcleos biotinilados marcados com mCherry de maneira dependente de Cre recombinase⁷. O sistema de marcação dupla permite realizar análises transcriptômicas e epigenômicas específicas do tipo celular com tecidos. Usando camundongos NuTRAP cruzados com linhagens adiponectina-Cre específicas de adipócitos (Adipoq-NuTRAP), caracterizamos previamente perfis de expressão gênica e estados de cromatina de populações de adipócitos puros in vivo e determinamos como eles são alterados durante a obesidade ^7,8. Anteriormente, camundongos NuTRAP cruzados com linhagens Ucp1-Cre específicas de adipócitos marrom e bege (Ucp1-NuTRAP) permitiram caracterizar o remodelamento epigenômico da rara população termogênica de adipócitos, adipócitos bege, em resposta a mudanças de temperatura⁹.

ATAC-seq é um método analítico amplamente utilizado para avaliar a acessibilidade da cromatina em todo o genoma. A transposase hiper-reativa Tn5 utilizada no ATAC-seq permite a identificação de regiões abertas da cromatina por meio da marcação de adaptadores de sequenciamento na região acessível à cromatina dos núcleos¹⁰. ATAC-seq é um método simples, mas fornece resultados robustos e é altamente eficiente mesmo com amostras de baixa entrada. Tornou-se, assim, um dos métodos de perfil epigenômico mais populares e tem contribuído para o entendimento dos mecanismos regulatórios da expressão gênica em diversos contextos biológicos. Desde que o protocolo ATAC-seq original foi criado, várias técnicas derivadas do ATAC-seq foram desenvolvidas para modificar e otimizar o protocolo para vários tipos de amostras. Por exemplo, o Fast-ATAC é projetado para analisar amostras de células sanguíneas¹¹, o Omni-ATAC é um protocolo otimizado para amostras de tecido congelado 12 e o MiniATAC-seq é eficaz para análise embrionária em estágio inicial¹³. Entretanto, a aplicação do método ATAC-seq aos adipócitos, especialmente a partir de amostras de tecido, ainda é um desafio. Além da heterogeneidade do tecido adiposo, seu alto conteúdo lipídico pode interferir em reações eficientes de recombinação pela transposase Tn5 mesmo após o isolamento do núcleo. Além disso, o alto conteúdo mitocondrial em adipócitos, particularmente em adipócitos marrons e bege, causa alta contaminação do DNA mitocondrial e leituras de sequenciamento desperdiçadas. Este trabalho descreve um protocolo para ATAC-seq específico para adipócitos usando camundongos Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Aproveitando a classificação de núcleos marcados com fluorescência, este protocolo permite a coleta de populações puras de núcleos de adipócitos longe de outros tipos de células de confusão e a remoção eficiente de lipídios, mitocôndrias e debris teciduais. Assim, este protocolo pode gerar dados de alta qualidade específicos do tipo celular e minimizar o desperdício de leituras mitocondriais enquanto usa uma quantidade reduzida de entrada e reagentes em comparação com o protocolo padrão.

Protocol

Os cuidados e experimentação com animais foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana. 1. Preparações antes do início da experiência Preparo de tecidosPara a marcação do núcleo do adipócito, cruze camundongos NuTRAP com linhagens de adiponectina-Cre específicas de adipócitos (Adipoq-Cre) para gerar camundongos Adipoq-NuTRAP, que s?…

Representative Results

Para analisar o tecido adiposo usando este protocolo ATAC-seq, geramos camundongos Adipoq-NuTRAP que foram alimentados com dietas de ração; em seguida, foram isolados núcleos de adipócitos do tecido adiposo branco epididimal (eWAT), tecido adiposo branco inguinal (TABi) e tecido adiposo marrom (BAT) por citometria de fluxo. Os núcleos isolados foram utilizados para marcação, seguida de purificação do DNA, amplificação por PCR, etapas de verificação de qualidade, sequenciamento e análise dos dados, conforme …

Discussion

Neste artigo, apresentamos um protocolo ATAC-seq otimizado para avaliar a acessibilidade da cromatina específica para adipócitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq usando o camundongo Adipoq-NuTRAP gerou com sucesso perfis de acessibilidade à cromatina específica para adipócitos. O fator mais crítico para experimentos ATAC-seq bem-sucedidos e reprodutíveis é a qualidade do núcleo. É fundamental congelar imediatamente os tecidos adiposos dissecados em nitrogênio líquido e armazená-los com segurança a …

Materials

Animals
Adiponectin-Cre mouse	The Jackson Laboratory	28020
NuTRAP mouse	The Jackson Laboratory	29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes	Eppendorf	86-923
100 µm cell strainer	Falcon	352-360
15 mL tubes	VWR	525-1071
2x TD buffer	Illumina	15027866
384-well PCR plate	Applied biosystem	4483285
40 µm cell strainer	Falcon	352-340
50 mL tubes	VWR	525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads)	Beckman Coulter	A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626
Clear adhesive film	Applied biosystem	4306311
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977015
Dounce tissue grinder	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 side skirted magnet	Thermo Fishers	12027
FACS tubes	Falcon	28719128
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl (2 M)	Boston BioProducts	MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips	EpiCypher	10-0008
MgCl2 (1 M)	Boston BioProducts	MT-200
MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix	BioLabs	M0541S
NP40	Thermo Fishers	28324
PCR 8-tube strip	USA scientific	1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x)	Thermo Fishers	78439
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32851
Sucrose	Sigma	S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x)	Invitrogen	S7563
TDE I enzyme	Illumina	15027865
Instruments
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria Fusion
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226
Real-Time PCR system	Thermo Fishers	QuantStudio 5