Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
De pro-aritmische hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie. Het muizenhart is een wijdverbreide soort voor het modelleren van erfelijke hartritmestoornissen, waaronder CPVT. Het gelijktijdig optisch in kaart brengen van transmembraanpotentiaal (Vm) en calciumtransiënten (CaT) van met Langendorff geperfuseerde muizenharten heeft het potentieel om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan aritmogenese. Vergeleken met het onderzoek op cellulair niveau kan de optische mappingtechniek enkele elektrofysiologische parameters testen, zoals de bepaling van activering, geleidingssnelheid, actiepotentiaalduur en CaT-duur. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput optische mapping van CaT en Vm in muizen wildtype en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en tijdens de isoproterenol-provocatie. Deze aanpak heeft een haalbare en betrouwbare methode aangetoond voor het mechanistisch bestuderen van CPVT-ziekte in een ex vivo muizenhartpreparaat.
Erfelijke hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie (PVT) na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie 1,2,3,4 . Recent bewijs na de eerste melding als klinisch syndroom in 1995 impliceerde mutaties in zeven genen, die allemaal betrokken zijn bij de afgifte van Ca 2+ in sarcoplasmatisch reticulair (SR) in deze toestand: de meest frequent gerapporteerde RYR2 die codeert voor ryanodinereceptor 2 (RyR2) van Ca2+ afgiftekanalen5,6, FKBP12.67, CASQ2 codeert voor cardiale calsequestrine8, TRDN codeert voor het junctionele SR-eiwit triadine 9, en CALM19, CALM2 10 en CALM3 codeert identiek voor calmoduline11,12. Deze genotypische patronen schrijven de aritmische gebeurtenissen toe aan de ongereguleerde pathologische afgifte van SR-opslag Ca2+12.
Spontane Ca 2+ afgifte van SR kan worden gedetecteerd als Ca 2+ vonken of Ca 2+ golven, die de Na+/Ca 2+ wisselaar (NCX) activeert. De wisselaar van één Ca2+ voor drie Na+ genereert een inwaartse stroom, die de diastolische depolarisatie versnelt en de membraanspanning naar de actiepotentiaaldrempel (AP) drijft. Bij RyR2 knock-in muizen leidt de verhoogde activiteit van RyR2R4496C in de sinusknoop (SAN) tot een onverwachte afname van de SAN-automaticiteit door Ca 2+-afhankelijke afname van I Ca,L en SRCa 2+ depletie tijdens diastole, waarbij subcellulaire pathofysiologische veranderingen worden geïdentificeerd die bijdragen aan de SAN-disfunctie bij CPVT-patiënten13,14. Het optreden van de verwante cardiomyocyt cytosolischeCa 2+ golven is waarschijnlijker na verhogingen van het cytosolische [Ca2+] op de achtergrond na RyR-sensibilisatie door catecholamine, waaronder isoproterenol (ISO), provocatie.
Gedetailleerde kinetische veranderingen in Ca 2+-signalering na RyR2-gemedieerde Ca2+-afgifte als reactie op activering van actiepotentiaal (AP) die de oorzaak kunnen zijn van de waargenomen ventriculaire aritmieën in intacte cardiale CPVT-modellen moeten nog worden bepaald voor het volledige bereik van gerapporteerde RyR2-genotypen12. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput mapping van Ca2+ signalen en transmembraanpotentialen (Vm) in muizen wild-type (WT) en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en na isoproterenol provocatie. Dit protocol biedt een methode voor de mechanistische studie van CPVT-ziekte in geïsoleerde muizenharten.
Op basis van onze ervaring zijn de sleutels tot een succesvolle dual-dye optische mapping van een muishart een goed voorbereide oplossing en hart, het laden van kleurstoffen, het bereiken van de beste signaal-ruisverhouding en het verminderen van het bewegingsartefact.
Bereiding van de oplossing
De oplossing van Krebs is essentieel voor een succesvol hartexperiment. MgCl 2- en CaCl2-voorraadoplossingen (1 mol/L) worden van tevoren bereid rekening houde…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81700308 tot XO en 31871181 tot ML, en 82270334 tot XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 tot XO, 23ZYZYTS0433 en 2022YFS0607 tot XT, en 2022NSFSC1602 tot TC) en State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 tot XO), MRC (G10031871181 tot ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE bij Oxford (ML) beurzen.
0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |