カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University, 2Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology,University of Oxford
Summary
このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca2+ トランジェントの電気生理学的測定を含む、カテコールアミン作動性多形心室頻拍の影響を受けた野生型およびノックイン動物から得られるマウス心臓の二重染料光学マッピングを導入します。
Abstract
不整脈誘発性心疾患であるカテコールアミン作動性多形性心室頻拍(CPVT)は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンチャレンジ後の多形性心室頻拍エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります。マウスの心臓は、CPVTを含む遺伝性不整脈疾患のモデル化に広く用いられている種です。ランゲンドルフ灌流マウス心臓の膜貫通電位(Vm)とカルシウム過渡現象(CaT)の同時光学マッピングは、不整脈発生のメカニズムを解明する可能性を秘めています。細胞レベルの調査と比較して、光学マッピング技術は、活性化、伝導速度、活動電位持続時間、CaT持続時間の決定など、いくつかの電気生理学的パラメータをテストできます。この論文では、マウス野生型およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCaTおよびVmのハイスループット光学マッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前および最中にプログラムされた電気ペーシングと組み合わせて紹介します。このアプローチは、ex vivoマウスの心臓調製物におけるCPVT疾患を機構的に研究するための実行可能で信頼性の高い方法を実証しました。
Introduction
遺伝性心疾患カテコールアミン作動性多形性心室頻拍 (CPVT) は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンの挑戦に続く多形性心室頻拍 (PVT) エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります 1,2,3,4 .1995年に臨床症候群として最初に報告された最近の証拠は、この状態での筋小胞体(SR)ストアCa2+放出に関与する7つの遺伝子の変異に関与しています:最も頻繁に報告されているCa 2+放出チャネル5,6、FKBP12.67、心臓カルセクエトリン8をコードするCASQ2、TRDNのリアノジン受容体2(RyR2)をコードするRYR2接合部SRタンパク質トリアジン9をコードし、CALM1 9、CALM2 10、およびCALM3をコードするカルモジュリン11,12をコードする。 これらの遺伝子型パターンは、不整脈事象をSR貯蔵Ca2+12の無秩序な病理学的放出に起因させる。
SRからの自発的なCa2+放出は、Ca2+スパークまたはCa2+波として検出され、Na+/Ca2+交換体(NCX)を活性化します。1つのCa2+を3つのNa+に交換すると、内向きの電流が発生し、拡張期の脱分極が加速し、膜電圧が活動電位(AP)の閾値まで上昇します。RyR2ノックインマウスでは、洞房リンパ節(SAN)におけるRyR2R4496Cの活性の増加により、拡張期のCa、LおよびSR Ca2+の枯渇のCa2+依存性の減少によるSANの自動性の予期せぬ低下が起こり、CPVT患者のSAN機能障害に寄与する細胞内病態生理学的変化が特定されました13,14。関連する心筋細胞細胞質Ca2+波の発生は、イソプロテレノール(ISO)を含むカテコールアミンによるRyR感作後のバックグラウンド細胞質[Ca2+]の増加に続いてより可能性が高くなります。
無傷の心臓CPVTモデルで観察された心室性不整脈の原因である可能性のある活動電位(AP)活性化に応答したRyR2を介したCa2+放出後のCa2+シグナル伝達の詳細な動態変化は、報告されたRyR2遺伝子型の全範囲について決定されるべきです12。この論文では、マウス野生型(WT)およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCa2+シグナルと膜貫通電位(Vm)のハイスループットマッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前後のプログラムされた電気的ペーシングと組み合わせて紹介します。このプロトコルは隔離されたマウス中心のCPVTの病気のメカニズムの調査に方法を提供する。
Protocol
実験には、体重20〜25gの10〜14週齢の雄の野生型マウスまたはRyR2-R2474S/+マウス(C57BL/6バックグラウンド)を使用します。すべての手順は、中国四川省の西南医科大学の動物管理および使用委員会(承認番号:20160930)によって承認されており、機関が運営する国のガイドラインに準拠しています。 1. 事前準備 ストックソリューションブレビスタ?…
Representative Results
光学マッピングは、過去10年間、複雑な不整脈を研究する上で一般的なアプローチでした。光学マッピングのセットアップはEMCCDカメラで構成されており、各ピクセルで最大1,000Hzのサンプリングレートと74 x 74 μmの空間分解能を提供します。これにより、信号サンプリング時にかなり高い信号対雑音比が可能になります(図1)。ランゲンドルフ灌流された心臓が安定した状…
Discussion
私たちの経験から、マウスの心臓の二重色素光学マッピングを成功させるための鍵は、十分に準備された溶液と心臓、色素のローディング、最高のS/N比の達成、およびモーションアーチファクトの低減です。
溶液の調製
クレブス溶液は、心臓実験を成功させるために不可欠です。MgCl 2 と CaCl2 の原液 (1 mol/L) は、Mg 2+ と Ca2+ が CO3<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(81700308からXOに、31871181からML、82270334からXTに)、四川省科学技術支援プログラム(CN)(2021YJ0206からXO、23ZYZYTS0433、2022YFS0607からXT、2022NSFSC1602からTC)、広西師範大学薬用資源化学分子工学国家重点実験室(CMEMR2017-B08からXO)、 MRC(G10031871181からML02647、G1002082、ML)、BHF(PG/14/80/31106、PG/16/67/32340、PG/12/21/29473、PG/11/59/29004 ML)、BHF CRE at Oxford(ML)助成金。
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
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Cite This Article
Li, Y., Yang, J., Zhang, R., Chen, T., Zhang, S., Zheng, Y., Wen, Q., Li, T., Tan, X., Lei, M., Ou, X. Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia. J. Vis. Exp. (202), e65082, doi:10.3791/65082 (2023).