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Biology

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

Published: December 22, 2023
doi:
10.3791/65082
, , , , , , , , , ,
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University, 2Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology,University of Oxford

Summary

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Abstract

부정맥성 심장 질환인 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실 세동으로 악화될 수 있습니다. 마우스 심장은 CPVT를 포함한 유전성 심장 부정맥 질환을 모델링하는 데 널리 사용되는 종입니다. Langendorff 관류된 쥐 심장의 막관통 전위(Vm)와 칼슘 과도성(CaT)의 동시 광학 매핑은 부정맥 발생의 기전을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포 수준 조사와 비교하여 광학 매핑 기술은 활성화, 전도 속도, 활동 전위 지속 시간 및 CaT 지속 시간 결정과 같은 일부 전기 생리학적 매개변수를 테스트할 수 있습니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전과 도중에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 CaT 및 Vm의 고처리량 광학 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 접근법은 생체 외 마우스 심장 제제에서 CPVT 질환을 기계적으로 연구하기 위한 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 입증했습니다.

Introduction

유전성 심장 질환 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥(PVT) 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실세동으로 악화될 수 있습니다 1,2,3,4 . 1995년 임상 증후군으로 처음 보고된 이후 최근의 증거는 7개의 유전자에 돌연변이가 있음을 시사했으며, 모두 이 상태에서 근질 망상(SR) 저장 Ca 2+ 방출에 관여했습니다: 가장 빈번하게 보고된 RYR2 인코딩 리아노딘 수용체 2(RyR2)의 Ca2+ 방출 채널5,6, FKBP12.67, CASQ2 인코딩 심장 calsequestrin8, TRDN 접합 SR 단백질 트리아딘9 및 CALM1 9, CALM2 10 및 CALM3 칼모듈린11,12를 동일하게 인코딩하는 인코딩. 이러한 유전형 패턴은 부정맥 사건을 SR 저장소 Ca2+12의 조절되지 않은 병리학적 방출에 기인합니다.

SR로부터의 자발적인 Ca 2+ 방출은 Ca 2+ 스파크 또는 Ca 2+ 파동으로 감지될 수 있으며, 이는 Na+/Ca 2+ 교환기(NCX)를 활성화합니다. 3 Na+에 대한 1 Ca의교환기 2 +는 내부 전류를 생성하여 이완기 탈분극을 가속화하고 멤브레인 전압을 활동 전위 (AP)의 임계 값으로 구동합니다. RyR2 knock-in 마우스에서, 동방 결절(SAN)에서 RyR2R4496C의 증가된 활성은 이완기 동안 I, Ca, L 및 SR Ca 2+ 고갈의 Ca2+ 의존적 감소에 의해 SAN 자동성의 예상치 못한 감소를 초래하여, CPVT 환자에서 SAN 기능 장애에 기여하는 세포 내 병태생리학적 변화를 확인한다13,14. 관련 심근세포 세포질 Ca 2+ 파의 발생은 이소프로테레놀(ISO)을 포함한 카테콜아민에 의한 RyR 감작 후 배경 세포질[Ca2+]의 증가에 따라 발생할 가능성이 더 높습니다.

온전한 심장 CPVT 모델에서 관찰된 심실 부정맥의 원인이 될 수 있는 활동 전위(AP) 활성화에 대한 반응으로 RyR2 매개 Ca 2+ 방출에 따른 Ca2+ 신호의 자세한 역학적 변화는 보고된 RyR2 유전자형12의 전체 범위에 대해 결정되어야 합니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전후에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형(WT) 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 Ca2+ 신호 및 막관통 전위(V, m)의 고처리량 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 분리된 마우스 심장에서 CPVT 질병의 기계론적 연구를 위한 방법을 제공합니다.

Protocol

실험에는 10주 내지 14주령의 수컷 야생형 마우스 또는 무게가 20-25g인 RyR2-R2474S/+ 마우스(C57BL/6 배경)가 사용되었다. 모든 절차는 기관이 운영되는 국가 지침에 따라 중국 쓰촨성 사우스웨스트 의과대학의 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호:20160930)의 승인을 받았습니다. 1. 준비 스톡 솔루션블레비스타틴 원액: 100% 디메틸설폭사이드(DMSO) 1mL를 (…

Representative Results

광학 매핑은 지난 10년 동안 복잡한 심장 부정맥을 연구하는 데 널리 사용되는 접근 방식이었습니다. 광학 매핑 설정은 EMCCD 카메라로 구성되며 각 픽셀에 대해 최대 1,000Hz의 샘플링 속도와 74 x 74μm의 공간 분해능을 제공합니다. 이를 통해 신호 샘플링 중에 다소 높은 신호 잡음비를 구현할 수 있습니다(그림 1). 랑겐도르프 관류된 심장이 안정된 상태에 도달하고 염료 로딩이 …

Discussion

우리의 경험에 비추어 볼 때, 쥐 심장의 성공적인 이중 염료 광학 매핑의 핵심은 잘 준비된 솔루션과 심장, 염료 로딩, 최상의 신호 대 잡음비 달성 및 모션 아티팩트 감소입니다.

용액의 준비
크렙스 용액은 성공적인 심장 실험에 필수적입니다. MgCl 2및 CaCl 2 원액 (1 mol / L)은 수분 흡수를 고려하여 미리 준비되고 다른 모?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81700308에서 XO로, 31871181에서 ML로, 82270334에서 XT로), 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램 (CN) (2021YJ0206 – XO, 23ZYZYTS0433 및 2022YFS0607 – XT, 2022NSFSC1602 – TC) 및 의약 자원의 화학 및 분자 공학을 위한 국가 핵심 연구소 (광시 사범 대학) (CMEMR2017-B08 – XO)의 지원을 받습니다. MRC(G10031871181 to ML02647, G1002082, ML), BHF(PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford(ML) 보조금.

Materials

0.2 μm syringe filter Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China N/A To filter solution
15 mL centrifuge tube Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China CFT011150
1 mL Pasteur pipette Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China 00900026
1 mL Syringe B. Braun Medical Inc. YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tube Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China F611541-0010 Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tube Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China CFT011500 Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filter Chroma Technology N/A Filter for calcium signal
630 nm long-pass filter Chroma Technology G15604AJ Filter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom T48402-100G To minimize suffering and pain reflex
Blebbistatin Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States SLBV5564 Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBK1794V For Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bath MappingLab, United Kingdom TBC-2.1 To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (RNBT7442) Solvent for dyes
Dumont forceps Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China YAF030
ElectroMap software University of Birmingham N/A Quantification of electrical parameters
EMCCD camera Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States A18G150001 Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filter Chroma Technology 319106 Excitation filter
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBT4811V For Tyrode's solution
Heparin Sodium Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China (H51021209) To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forceps Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China YAA010
Isoproterenol MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States HY-B0468/CS-2582
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBS5003 For Tyrode's solution
MacroLED Cairn Research, Faversham, United Kingdom 7355/7356 The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light source Cairn Research, Faversham, United Kingdom 7352 Control the LEDs
Mayo scissors Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China YBC010
MetaMorph Molecular Devices N/A Optical signals sampling
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States BCBS6841V For Tyrode's solution
MICRO3-1401 Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom M5337 Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulator Ion Optix Co, Milton, MA, United States S006152 Electric stimulator
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBS2340V For Tyrode's solution
NaH2PO4  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States BCBW9042 For Tyrode's solution
NaHCO3 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBX3605 For Tyrode's solution
NeuroLog System Digitimer NL905-229 For ECG amplifier
OmapScope5 MappingLab, United Kingdom N/A Calcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissors Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China T4-3904
OptoSplit Cairn Research, Faversham, United Kingdom 6970 Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pump Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, BT100-2J To pump the solution
Petri dish BIOFIL TCD010060
Pluronic F127 Invitrogen, Carlsbad, CA, United States 1899021 To enhance the loading with Rhod2AM
RH237 Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States 1971387 Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AM Invitrogen, Carlsbad, CA, United States 1890519 Calcium indicator
Silica gel tube Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, 96402-16 Connect with the peristaltic pump
Silk suture Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China 20172650032 To fix the aorta
Spike2 Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom N/A To record and analyze ECG data
Stimulation electrode MappingLab, United Kingdom SE1600-35-2020
T510lpxr Chroma Technology 312461 For light source
T565lpxr Chroma Technology 321343 For light source
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References

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Keywords: Optical MappingRyR2R2474S Knock-in MiceCatecholaminergic Polymorphic Ventricular TachycardiaMembrane PotentialIntracellular CalciumLangendorff PerfusionExcitation-contraction UncouplingRhod-2 AMRH 237ElectrocardiogramCardiac Arrhythmia
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