RyR2R2474S नॉक-इन चूहों से दिलों की डुअल-डाई ऑप्टिकल मैपिंग कैटेकोलामिनर्जिक पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया
Summary
यह प्रोटोकॉल जंगली प्रकार से प्राप्त माउस दिलों की दोहरी डाई ऑप्टिकल मैपिंग का परिचय देता है और उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ transmembrane वोल्टेज और intracellular सीए2 + यात्रियों के electrophysiological माप सहित, catecholaminergic बहुरूपी वेंट्रिकुलर tachycardia से प्रभावित जानवरों में खट्टी.
Abstract
प्रो-एरिथमिक कार्डियक डिसऑर्डर कैटेकोलामिनर्जिक पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (सीपीवीटी) शारीरिक गतिविधि, तनाव या कैटेकोलामाइन चुनौती के बाद पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया एपिसोड के रूप में प्रकट होता है, जो संभावित घातक वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन में बिगड़ सकता है। माउस दिल सीपीवीटी सहित विरासत में मिली हृदय अतालता संबंधी बीमारियों के मॉडलिंग के लिए एक व्यापक प्रजाति है। लैंगेंडोर्फ-छिद्रित माउस दिलों से ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता (वीएम) और कैल्शियम ट्रांजिस्टर (सीएटी) के एक साथ ऑप्टिकल मैपिंग में अतालता के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने की क्षमता है। सेलुलर स्तर की जांच की तुलना में, ऑप्टिकल मैपिंग तकनीक कुछ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों का परीक्षण कर सकती है, जैसे सक्रियण का निर्धारण, चालन वेग, कार्रवाई संभावित अवधि और सीएटी अवधि। यह पेपर म्यूरिन वाइल्ड-टाइप और विषमयुग्मजी RyR2-R2474S/+ दिलों में CaT और V m के उच्च-थ्रूपुट ऑप्टिकल मैपिंग के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जो आइसोप्रोटेरेनॉल चुनौती से पहले और उसके दौरान प्रोग्राम किए गए विद्युत पेसिंग के साथ संयुक्त है। इस दृष्टिकोण ने पूर्व विवो माउस दिल की तैयारी में यंत्रवत रूप से सीपीवीटी रोग का अध्ययन करने के लिए एक व्यवहार्य और विश्वसनीय विधि का प्रदर्शन किया है।
Introduction
इनहेरिटेड कार्डियक डिसऑर्डर कैटेकोलामिनर्जिक पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (सीपीवीटी) शारीरिक गतिविधि, तनाव या कैटेकोलामाइन चुनौती के बाद पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (पीवीटी) एपिसोड के रूप में प्रकट होता है, जो संभावित घातक वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन 1,2,3,4 में बिगड़ सकता है . 1995 में क्लिनिकल सिंड्रोम के रूप में अपनी पहली रिपोर्ट के बाद हाल के सबूतों ने सात जीनों में उत्परिवर्तन को फंसाया, सभी इस स्थिति में सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलर (एसआर) स्टोर सीए 2+ रिलीज में शामिल हैं: सीए2+ रिलीज चैनल 2,6, एफकेबीपी12.67, CASQ2 एन्कोडिंग कार्डियक कैल्सेक्वेस्ट्रिन8, TRDN के सबसे अधिक बार रिपोर्ट किए गए RYR2 एन्कोडिंग रायनोडाइन रिसेप्टर2 (RyR2) जंक्शनल एसआर प्रोटीन ट्रायडिन 9, और CALM1 9, CALM2 10, और CALM3 को समान रूप से एन्कोडिंग कैलमोडुलिन11,12 एन्कोडिंग करता है। ये जीनोटाइपिक पैटर्न एसआर स्टोर सीए2 + 12 के अनियमित रोग संबंधी रिलीज के लिए अतालता घटनाओं का श्रेय देते हैं।
SR से सहज Ca 2+ रिलीज़ को Ca 2+ स्पार्क्स या Ca 2+ तरंगों के रूप में पहचाना जा सकता है, जो Na+/Ca 2+ एक्सचेंजर (NCX) को सक्रिय करता है। तीन Na+ के लिए एक Ca2+ का एक्सचेंजर एक आवक करंट उत्पन्न करता है, जो डायस्टोलिक विध्रुवण को गति देता है और झिल्ली वोल्टेज को एक्शन पोटेंशिअल (AP) की दहलीज तक ले जाता है। RyR2 नॉक-इन चूहों में, सिनोट्रियल नोड (सैन) में RyR2R4496C की बढ़ी हुई गतिविधि से डायस्टोल के दौरान Ca 2+-निर्भर I Ca, L और SR Ca2+ की कमी से सैन ऑटोमैटिसिटी में अप्रत्याशित कमी होती है, CPVT रोगियों में सैन डिसफंक्शन में योगदान देने वाले उपकोशिकीय पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों की पहचान13,14। संबंधित कार्डियोमायोसाइट साइटोसोलिक सीए 2+ तरंगों की घटना पृष्ठभूमि साइटोसोलिक [सीए2+] में वृद्धि के बाद अधिक संभावना है, कैटेकोलामाइन द्वारा आरवाईआर संवेदीकरण के बाद, आइसोप्रोटेरेनॉल (आईएसओ), चुनौती सहित।
एक्शन पोटेंशियल (एपी) सक्रियण के जवाब में RyR2-मध्यस्थता सीए 2+ रिलीज के बाद सीए2+ सिग्नलिंग में विस्तृत गतिज परिवर्तन जो बरकरार कार्डियक सीपीवीटी मॉडल में मनाया वेंट्रिकुलर अतालता का कारण हो सकता है, रिपोर्ट किए गए RyR2 जीनोटाइप12 की पूरी श्रृंखला के लिए निर्धारित किया जाना बाकी है। यह पेपर म्यूरिन वाइल्ड-टाइप (WT) और विषमयुग्मजी RyR2-R2474S/+ दिलों में Ca2+ सिग्नल और ट्रांसमेम्ब्रेन पोटेंशियल (V m) के उच्च-थ्रूपुट मैपिंग के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जो isoproterenol चुनौती से पहले और बाद में प्रोग्राम किए गए विद्युत पेसिंग के साथ संयुक्त है। यह प्रोटोकॉल पृथक माउस दिलों में सीपीवीटी रोग के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक विधि प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे अनुभव के आधार पर, एक माउस दिल की एक सफल दोहरी डाई ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए कुंजी एक अच्छी तरह से तैयार समाधान और दिल, डाई लोड हो रहा है, सबसे अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्राप्त करने, और गति वि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81700308 से XO और 31871181 से ML, और 82270334 से XT), सिचुआन प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (CN) (2021YJ0206 से XO, 23ZYZYTS0433, और 2022YFS0607 से XT, और 2022NSFSC1602 से TC) और औषधीय संसाधनों के रसायन विज्ञान और आणविक इंजीनियरिंग के लिए राज्य कुंजी प्रयोगशाला (गुआंग्शी सामान्य विश्वविद्यालय) (CMEMR2017-B08 से XO), एमआरसी (G10031871181 से ML02647, G1002082, एमएल), बीएचएफ (पीजी/14/80/31106, पीजी/16/67/32340, पीजी/12/21/29473, पीजी/11/59/29004 एमएल), ऑक्सफोर्ड (एमएल) अनुदान में बीएचएफ सीआरई।
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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