Detta protokoll introducerar optisk kartläggning av mushjärtan med dubbla färgämnen erhållna från vildtyps- och knock-in-djur som drabbats av katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi, inklusive elektrofysiologiska mätningar av transmembranspänning och intracellulära Ca2+ -transienter med hög tidsmässig och rumslig upplösning.
Den proarytmiska hjärtsjukdomen katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi (CPVT) manifesterar sig som polymorfa ventrikulära takykardiepisoder efter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminprovokation, som kan försämras till potentiellt dödligt ventrikelflimmer. Mushjärtat är en utbredd art för modellering av ärftliga hjärtarytmisjukdomar, inklusive CPVT. Samtidig optisk kartläggning av transmembranpotential (Vm) och kalciumtransienter (CaT) från Langendorff-perfunderade mushjärtan har potential att belysa mekanismer som ligger till grund för arytmogenes. Jämfört med undersökningen på cellnivå kan den optiska kartläggningstekniken testa vissa elektrofysiologiska parametrar, såsom bestämning av aktivering, ledningshastighet, aktionspotentialvaraktighet och CaT-varaktighet. Denna artikel presenterar instrumenteringsuppställningen och den experimentella proceduren för optisk kartläggning av CaT och Vm med hög genomströmning i murina vildtyps- och heterozygota RyR2-R2474S/+-hjärtan, kombinerat med programmerad elektrisk stimulering före och under isoprotereno-provokationen. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara en genomförbar och tillförlitlig metod för mekanistisk studie av CPVT-sjukdom i ett ex vivo-hjärtpreparat för mus.
Ärftlig hjärtsjukdom katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi (CPVT) yttrar sig som polymorf ventrikulär takykardi (PVT) efter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminprovokation, som kan försämras till potentiellt dödligt ventrikelflimmer 1,2,3,4 . Nya bevis efter den första rapporten som ett kliniskt syndrom 1995 implicerade mutationer i sju gener, alla involverade i sarkoplasmatisk retikulär (SR) lagrar Ca 2+-frisättning i detta tillstånd: den mest frekvent rapporterade RYR2-kodande ryanodinreceptorn 2 (RyR2) i Ca2+ frisättningskanalerna5,6, FKBP12.67, CASQ2 som kodar för hjärtkalsekvestrin8, TRDN som kodar för det korsande SR-proteinet triadin 9 och CALM1 9, CALM2 10 och CALM3 kodar identiskt för kalmodulin11,12. Dessa genotypiska mönster tillskriver de arytmiska händelserna till den oreglerade patologiska frisättningen av SR store Ca2 + 12.
Spontan Ca 2+-frisättning från SR kan detekteras som Ca 2+-gnistor eller Ca 2+-vågor, vilket aktiverar Na+/Ca 2+–växlaren (NCX). Växlaren av en Ca2+ för tre Na+ genererar en inåtgående ström, vilket påskyndar den diastoliska depolarisationen och driver membranspänningen till tröskeln för aktionspotential (AP). I RyR2 knock-in-möss leder den ökade aktiviteten av RyR2R4496C i sinusknutan (SAN) till en oväntad minskning av SAN-automaticiteten genom Ca 2+-beroende minskning av ICa,L och SR Ca2+ utarmning under diastole, vilket identifierar subcellulära patofysiologiska förändringar som bidrar till SAN-dysfunktionen hos CPVT-patienter13,14. Förekomst av de besläktade kardiomyocytcytosoliska Ca 2+-vågorna är mer sannolik efter ökningar av cytosoliska bakgrundsvågor [Ca2+] efter RyR-sensibilisering med katekolamin, inklusive isoproterenol (ISO), provokation.
Detaljerade kinetiska förändringar i Ca 2+-signalering efter RyR2-medierad Ca2+-frisättning som svar på aktivering av aktionspotential (AP) som kan vara orsaken till de observerade ventrikulära arytmierna i intakta hjärt-CPVT-modeller återstår att bestämma för hela skalan av rapporterade RyR2-genotyper12. Denna artikel presenterar instrumenteringsuppställningen och den experimentella proceduren för kartläggning av Ca2+-signaler och transmembranpotentialer (Vm) i murina vildtyps- (WT) och heterozygota RyR2-R2474S/+-hjärtan, kombinerat med programmerad elektrisk stimulering före och efter isoproterenolackprovokation. Detta protokoll tillhandahåller en metod för mekanistisk studie av CPVT-sjukdom i isolerade mushjärtan.
Baserat på vår erfarenhet inkluderar nycklarna till en framgångsrik optisk kartläggning av ett mushjärta med dubbla färgämnen en väl förberedd lösning och hjärta, färgladdning, att uppnå det bästa signal-brusförhållandet och att minska rörelseartefakten.
Beredning av lösning
Krebs lösning är avgörande för ett lyckat hjärtexperiment. MgCl 2 och CaCl 2 stamlösningar (1 mol/L) bereds i förväg med tanke på deras vattenabsorption och tillsä…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöds av National Natural Science Foundation of China (81700308 till XO och 31871181 till ML, och 82270334 till XT), Sichuan-provinsens vetenskaps- och teknikstödprogram (CN) (2021YJ0206 till XO, 23ZYZYTS0433 och 2022YFS0607 till XT och 2022NSFSC1602 till TC) och State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 till XO), MRC (G10031871181 till ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE i Oxford (ML) bidrag.
0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |