Summary
Здесь мы описываем методы индуцирования аллергического контактного дерматита в ушах мышей 1-фтор-2,4-динитробензолом (DNFB) и способы оценки тяжести аллергического контактного дерматита.
Abstract
Кожа является первой линией защиты человеческого организма и одним из органов, наиболее подверженных воздействию химических веществ окружающей среды. Аллергический контактный дерматит (АКД) является распространенным кожным заболеванием, которое проявляется в виде местной сыпи, покраснения и поражений кожи. На возникновение и развитие АКД влияют как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Хотя в последние годы многие ученые построили серию моделей АКД, экспериментальные протоколы всех этих моделей различны, что затрудняет читателям их установление. Поэтому стабильная и эффективная животная модель имеет большое значение для дальнейшего изучения патогенеза атопического дерматита. В этом исследовании мы подробно описываем метод моделирования с использованием 1-фтор-2,4-динитробензола (DNFB) для индуцирования ACD-подобных симптомов в ушах мышей и описываем несколько методов оценки тяжести дерматита во время моделирования. Этот экспериментальный протокол был успешно применен в некоторых экспериментах и играет определенную рекламную роль в области исследований ACD.
Introduction
Аллергический контактный дерматит (АКД) является распространенным кожным заболеванием, которое характеризуется экземоподобными симптомами в месте контакта, отеком и эритемой в умеренных случаях, а также папулами, эрозиями, экссудацией или даже массивными рубцами в тяжелых случаях1. Он поражает до 20% населения и может поражать людей любого возраста2. ACD часто возникает у людей, которые неоднократно подвергались воздействию аллергенов, и может быть вызван иммунным ответом человека на один или несколько аллергенов в их доме или на рабочем месте3. Отсроченная гиперчувствительность IV типа считается основным типом иммунного ответа при ACD4. На участках кожи, которые неоднократно подвергались воздействию аллергенов, циркулирующие Т-клетки памяти накапливаются в большом количестве и вызывают иммунные и воспалительные реакции 3,5,6. Целью данной работы является предложение надежной лабораторной методики для дальнейшего исследования иммунологических и воспалительных реакций при развитии АКД.
Начало АКД обычно связано с контактной гиперчувствительностью, вызванной повторным воздействием химических веществ. В течение последних нескольких десятилетий многочисленные исследователи разработали различные модели животных ACD у домашних мышей7,8, морских свинок 9,10 и других животных, чтобы имитировать начало заболевания. Большинство экспериментальных методов состоят из двух этапов: абдоминальная сенсибилизация (индукция) и обеспечение стимулов на спине или мочке уха (стимуляция). Обычно используемые химические вещества в основном включают 1-фтор-2,4-динитробензол (DNFB) / 1-хлор-2,4-динитробензол (DNCB) 8,9,11, оксазолон 12, урушиол 13 и т. Д. Среди них наиболее широко используются DNFB и DNCB, о которых впервые сообщалось в октябре 1958 года10. Также часто используются модельсенсибилизации никеля 14 и фотоаллергический контактный дерматит модели15.
Представлен экспериментальный метод построения модели ACD. Этот метод обобщен и оптимизирован на основе предыдущих исследований и после сравнения с несколькими экспериментами. По сравнению с другими моделями ACD эта модель имеет некоторые преимущества, такие как небольшие индивидуальные различия, короткие периоды эксперимента, небольшое количество химической стимуляции и т. д. Кроме того, это исследование применимо к мышам, которые не только экономичны, но и имеют больше возможностей для нокаута генов или подготовки трансгенных мышей16. Мы также описываем различные методы, используемые для мониторинга прогресса ACD в эксперименте, такие как измерение толщины уха, использование синего красителя Эванса для измерения воспалительной экссудации и т. д. Эта модель может не только анализировать мышиные уши, кровь, селезенку и другие образцы лабораторными средствами для изучения патогенеза АКД, но также применима для доклинической оценки новых терапевтических методов, что имеет определенное рекламное значение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Весь уход и лечение мышей осуществлялись в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу, и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в соответствии с лицензией проекта SYXK (SU) 2022-0044. В этом исследовании использовались самцы и самки мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель. Каждая группа состояла из шести мышей (см. Таблицу материалов). Клетки были помещены в камеру с регулируемой температурой (22 ± 2 °C, 12-часовой цикл свет/темнота) со свободным доступом к пище и воде. Экспериментальная блок-схема показана на рисунке 1.
1. Подготовка животных
- Приступайте к моделированию после 1 недели акклиматизации к окружающей среде.
- Используйте ультрафиолетовую лампу и дезинфицирующее средство с 75% спиртом для очистки и дезинфекции окружающей среды и столешниц перед манипуляциями с мышами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание влияния внешних факторов маркировка мышей для идентификации не может быть выполнена на ухе мыши; В качестве альтернативы можно использовать окрашивание на спине или на хвосте. - С помощью небольшого ватного тампона нанесите мыльную воду на брюшко мышей (размером примерно 1-2 см2 дюйма). Побрейте область по направлению роста волос лезвием или бритвой (см. Таблицу материалов) в начале моделирования (0-й день; Рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование прямого бритвенного лезвия для удаления волос требует квалифицированного оператора. При неправильном выполнении это может вызвать раздражение кожи. Рассмотрите возможность использования крема для депиляции, машинок для стрижки или безопасной бритвы для удаления волос. - Взвесьте мышь и сравните изменения веса в каждой группе.
2. Стимуляция абдоминальной сенсибилизации
- Обеспечьте полное восстановление любых незначительных повреждений кожи живота, вызванных бритьем. Применяют сенсибилизацию живота через 2 дня после бритья (2-й день).
- Приготовьте 0,5% раствор DNFB: разбавьте DNFB смесью ацетона: оливкового масла в соотношении 4:1 (например, 400 мкл ацетона, смешанного со 100 мкл оливкового масла; см. Таблицу материалов). С помощью пипетки выдуйте и перемешайте 20 раз, чтобы тщательно перемешать раствор DNFB. Перед каждым введением раствора ДНФБ в мышь продувают и перемешивают его три-пять раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор перед использованием и заверните его в алюминиевую фольгу, чтобы защитить его от прямых солнечных лучей. - Нанесите 25 мкл 0,5% раствора ДНФБ на кожу бритого участка на животе мышей с помощью пипетки (рис. 2Б).
- Нанесите раствор DNFB на середину области бритья живота и слегка распределите гладкой стороной наконечника пипетки, чтобы равномерно рассеять его.
- Через 30 секунд после стимуляции DNFB поместите мышей в пустые клетки без подстилки, чтобы они не вытирали раствор DNFB. Когда раствор DNFB полностью высохнет (около 2 минут), верните мышей в исходную клетку.
- При работе с раствором DNFB надевайте перчатки, так как он сильно раздражает кожу человека.
3. Стимуляция сенсибилизации уха
- Приготовьте 0,2% раствор DNFB, как указано выше, раствор транспортного средства (смесь ацетона и оливкового масла 4:1) и чистую воду.
- Ориентируйте тело мыши и сделайте внешнюю границу ушной раковины обращенной вниз в течение всей операции, чтобы предотвратить попадание раствора в слуховой проход во время стимуляции DNFB.
- На 4, 6, 8 и 10-й дни с помощью пипетки медленно и равномерно наносите 20 мкл 0,2% раствора ДНФБ или раствора носителя на внутреннюю поверхность левых ушных раковин мышей. Чтобы избежать попадания раствора DNFB в ушной канал, используйте гладкую сторону наконечника пипетки, чтобы аккуратно распределить раствор DNFB во время введения. Оставьте правое ухо без лечения (рис. 2C).
- Подождите, пока раствор DNFB высохнет, и поместите мышей обратно в клетку (около 30 с).
- Надевайте перчатки при работе с раствором DNFB.
4. Запись веса мыши и симптомов ACD
- Взвешивайте мышь каждый день, начинайте с 1-го дня и сравнивайте с соответствующим весом в 0-й день; оценить влияние ACD на массу тела мышей по мере изменения веса (g) ± стандартной ошибки среднего значения (SEM).
- Делайте фотографии ушей мыши с высоким разрешением, чтобы записывать клинические симптомы ACD каждые 2 дня, начиная с 1-го дня.
5. Измерение толщины ушной раковины
- Измеряйте толщину ушной раковины каждые 2 дня, начиная с 1-го дня. Измерьте и запишите оба уха в деталях.
- Используйте штангенциркуль (см. Таблицу материалов) для измерения толщины ушной раковины в одно и то же время каждый день для получения точных результатов (рис. 3A). Остановите штангенциркуль от продолжения зажима внутрь при небольшой закупорке, чтобы предотвратить повреждение тканей уха мыши. Сохраняйте фиксированное положение и записывайте данные.
- Соберите толщину из трех разных мест на каждой ушной раковине (рис. 3B). Запишите среднее значение трех данных в качестве допустимого значения. Оцените отек уха в микрометрах (мкм) ± стандартную ошибку среднего значения (SEM).
6. Оценка степени воспалительного отека
- Приготовьте 0,5% раствор синего красителя Эванса (см. Таблицу материалов): разбавьте краситель синий Эванса фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) на 11-й день. Всегда носите лабораторный халат и перчатки, так как синий краситель Эванса слегка токсичен для человека.
- Обездвижите мышей с помощью фиксатора: откройте крышку фиксатора (см. Таблицу материалов), возьмитесь за хвост мыши, сделайте голову мыши лицом к фиксатору и заставьте мышь инстинктивно залезть в фиксатор. Закройте крышку, сделайте так, чтобы хвост мыши вышел из отверстия на крышке, и отрегулируйте длину фиксатора, чтобы обнажить весь хвост мыши.
- Несколько раз протрите хвост спиртовым ватным тампоном или замочите его в теплой воде на 30 секунд и аккуратно защипните корень хвоста, чтобы заполнить и расширить жилки с обеих сторон. Выполняют инъекцию под облучение холодным источником света.
- Медленно вводите раствор синего красителя Эванса в вену хвоста мыши с помощью инсулиновой иглы диаметром 1 мм. Подождите 15 минут, а затем сфотографируйте уши мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положите мышь на стол и осторожно удерживайте ее, чтобы обнажить область уха для получения изображения. Вскоре после инъекции раствором синего красителя Эванса и соблюдая соответствующие показания, используйте вывих шейки матки для эвтаназии мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При повторной стимуляции DNFB уши мыши в группе DNFB проявляли очевидные клинические симптомы, сравнимые с ACD, с чувствительными областями, демонстрирующими типичные симптомы покраснения, сухости и даже эрозии и экссудации. Однако введение чистой воды в ухо (контрольная группа) или контроль растворителя (группа транспортного средства) не вызывало подобных симптомов (рис. 4).
Между тем, в группе DNFB, по сравнению с необработанным правым ухом, толщина левого уха значительно увеличилась после стимуляции DNFB (рис. 5A), тогда как не было существенной разницы в контрольной группе и группе транспортного средства (рис. 5B). Левое ухо мышей группы DNFB, очевидно, стало темно-синим после инъекции синего красителя Эванса на 11-й день моделирования, которое визуально отличалось от правого уха. Однако левое и правое ухо мышей в контрольной и транспортной группах были примерно одинакового цвета (рис. 5C).
Кроме того, были проанализированы изменения массы тела мышей. Увеличение веса мыши было немного замедлено с помощью DNFB или простой стимуляции транспортного средства (рис. 6A), но не привело к значительной потере веса (рис. 6B). Одновременно селезенка была выделена сразу после того, как мыши были принесены в жертву. Индекс селезенки рассчитывали в соответствии с весом мыши и массой селезенки; Формула расчета была следующей:
Индекс селезенки = масса селезенки (г) / масса тела (г) x 100
Результат показывает, что повторная стимуляция DNFB в ухе мыши приводила к увеличению селезенки (рис. 6C) и увеличению индекса селезенки (рис. 6D), тогда как индекс селезенки мышей в группе носителя существенно не изменился. Было доказано, что при стимуляции ДНФБ функция иммунного ответа мышей в группе ДНФБ была гиперактивной.
Рисунок 1: Принципиальная схема оси времени формования ACD. Стрелки указывают, что было сделано в соответствующее время. Связанные с этим операции включают бритье, сенсибилизацию, измерение ушной раковины, взвешивание, фотосъемку и нанесение синего красителя Эванса. Сокращения: DNFB = 1-фтор-2,4-динитробензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Метод работы по созданию модели ACD . (А) Манипуляции с бритьем живота. (B) Манипуляции с сенсибилизирующей стимуляцией брюшной полости. (C) Манипуляции с сенсибилизирующей стимуляцией уха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Метод оценки отека уха . (A) Манипуляции с измерениями толщины ушей у мышей. (B) Места измерения толщины уха у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативная картина влияния введения DNFB на уши мышей с течением времени . (А) Контрольная группа. В) Группа транспортных средств. (C) Группа DNFB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние введения DNFB на отек уха у мышей. (A) Разница в толщине ушей между левым и правым ухом мышей во время моделирования. (B) Сравнение толщины левого и правого уха мышей в каждой группе в конце моделирования. (C) Влияние введения DNFB на проницаемость сосудов уха у мышей. (n = 6. ***p < 0,001, сравнение между правым и левым ухом; N.S. = не значимо). Все данные были выражены в виде среднего значения ± SEM. Различные анализы лечения среди групп были проанализированы с использованием непарного t-критерия студента или одностороннего дисперсионного анализа с тестом Даннетта. Значения p менее 0,05 считались статистически значимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Влияние введения DNFB на массу тела и индекс селезенки у мышей. (A) Изменения массы тела мышей в каждой группе во время моделирования. (B) Сравнение изменений массы тела у мышей в каждой группе на 11-й день. (C) Сравнение размера селезенки в каждой группе мышей. (D) Сравнение индекса селезенки между группами мышей. (n = 6. *p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; N.S. = Не значимо). Все данные были выражены в виде среднего значения ± SEM. Различные анализы лечения среди групп были проанализированы с использованием непарного t-критерия студента или одностороннего дисперсионного анализа с тестом Даннетта. Значения p менее 0,05 считались статистически значимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол для индуцирования ACD-подобных симптомов в ушах мышей может быть использован для изучения патофизиологии ACD и в качестве инструмента скрининга для разработки новых лекарств.
Существует два ключевых шага для создания модели ACD: начальная сенсибилизация и последующая стимуляция. Живот обычно является местом первоначальной сенсибилизации, но место последующей стимуляции было выбрано несколько иначе. Предыдущие исследования показали, что большинство ученых предпочитают использовать химические сенсибилизаторы, такие как DNFB / DNCB или оксазолон, для создания моделей ACD на спине или шее мышей, и неизбежно использовать лезвия или триммеры для депиляции моделирующей области мышей17,18,19. Однако этот шаг может легко разрушить кожный барьер и повлиять на последующие эксперименты. Кроме того, капельный препарат трудно равномерно распределить и легко впитывается близлежащими волосами из-за большой площади на затылке и влияния окружающих волос.
В этом экспериментальном протоколе мы обнаружили, что выполнение манипуляций для последующей стимуляции внутренней поверхности ушных раковин мыши позволило нам облегчить некоторые из вышеперечисленных проблем, помогая создать стабильную и воспроизводимую модель ACD. В соответствии с нашими повторными экспериментами20 мы также оптимизировали и скорректировали интервал сенсибилизирующего стимула и экспериментальный период. В соответствии с приведенным экспериментальным методом, вполне очевидный эффект моделирования может быть получен на 10-е сутки. Кроме того, поскольку область моделирования находится на относительно независимой внутренней стороне ушной раковины, на которую внешние факторы оказывают меньшее вмешательство, существует меньшая разница в тяжести АКД у мышей в той же экспериментальной группе в этом эксперименте.
Этот экспериментальный протокол также имеет некоторые недостатки. Во-первых, нанесение химических сенсибилизаторов на ухо следует выполнять с осторожностью, чтобы избежать попадания химических веществ в слуховой проход и нанесения вреда мышам. Во-вторых, модели ACD часто используются в качестве средства для изучения хронического зуда у мышей. В модели ACD, установленной на затылке мышей, приступы расчесывания у мышей можно было интуитивно наблюдать, и по этому можно было измерить тяжесть симптома зуда у мышей. Хотя царапающее поведение также наблюдалось у мышей во время нашего эксперимента, у мышей также были спонтанные привычки чистки ушей, что затрудняло различение от патологического поведения при царапании. Это ограничило использование этой модели при наблюдении за поведением царапания, вызванным ACD. Применимость протокола к данному типу исследований подлежит дальнейшей экспериментальной проверке.
Для отслеживания патологического течения АКД использовались различные методы мониторинга, такие как клинические симптомы уха, измерение толщины уха и отражение проницаемости сосудов. Эти патологические показатели более заметны в ухе, чем в коже шеи и спины. При измерении толщины уха мыши ошибки измерения будут возникать из-за проблем мыши и неравномерной толщины уха. Чтобы уменьшить количество ошибок при измерении, измерения следует проводить в трех разных местах на каждом ухе. Вводя краситель Эванса для оценки проницаемости сосудов моделируемой области, можно увидеть тяжесть дерматита, однако это также требует высокого уровня успеха инъекции в хвостовую вену. Если требуется дальнейший сравнительный анализ, можно определить поглощение надосадочной жидкости гомогената ткани уха мыши.
Стоит также упомянуть, что в нашем предыдущем исследовании20 структура ткани уха была хорошо организована и менее подвержена влиянию других неупорядоченных тканевых структур (например, волосяных фолликулов), чем в ткани кожи шеи и спины, что привело к выбору этой области для исследования.
В заключение следует отметить, что модель АКД, описанная в данной статье, является стабильным и эффективным методом моделирования и заслуживает продвижения в последующих исследованиях аллергического контактного дерматита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) для Н.-Н. Ю. (81904212); Научно-технический проект традиционной китайской медицины провинции Цзянсу (YB201995); и Проект специального финансирования для докторантов в Китае (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
- Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
- Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
- Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
- Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J.
- Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
- Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
- Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
- Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
- Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
- Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
- Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
- Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
- Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
- Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
- Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397 (2022).
- Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
- Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
- Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237 (2021).
- Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023 (2023).
