Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs
Summary
يصف هذا العمل بروتوكولا للطباعة الحرة المضمنة 3D للخلايا الجذعية العصبية داخل مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء. يتيح البروتوكول الزخرفة القابلة للبرمجة لتركيبات الأنسجة العصبية البشرية المترابطة بدقة عالية.
Abstract
ظهرت الطباعة 3D المضمنة للخلايا داخل وسيط دعم حبيبي في العقد الماضي كنهج قوي للتصنيع الحيوي الحر لتركيبات الأنسجة الرخوة. ومع ذلك ، فقد اقتصرت تركيبات الجل الحبيبية على عدد محدود من المواد الحيوية التي تسمح بتوليد كميات كبيرة من جزيئات الهيدروجيل الدقيقة بشكل فعال من حيث التكلفة. لذلك ، تفتقر وسائط دعم الهلام الحبيبي بشكل عام إلى الوظائف اللاصقة للخلايا والوظائف الإرشادية للخلايا الموجودة في المصفوفة الأصلية خارج الخلية (ECM).
لمعالجة هذا ، تم تطوير منهجية لتوليد مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE). تتكون مركبات SHAPE من طور حبيبي (هلاميات دقيقة) وطور مستمر (محلول ECM لزج) يسمحان معا بطباعة عالية الدقة قابلة للبرمجة وبيئة خارج الخلية وظيفية حيوية قابلة للتعديل. يصف هذا العمل كيف يمكن استخدام المنهجية المطورة للتصنيع الحيوي الدقيق للبنى العصبية البشرية.
أولا ، يتم تصنيع الجسيمات الدقيقة للجينات ، والتي تعمل كمكون حبيبي في مركبات SHAPE ، ودمجها مع مكون مستمر قائم على الكولاجين. بعد ذلك ، تتم طباعة الخلايا الجذعية العصبية البشرية داخل مادة الدعم ، متبوعة بتلدين الدعم. يمكن الحفاظ على التركيبات المطبوعة لأسابيع للسماح بتمايز الخلايا المطبوعة إلى خلايا عصبية. في الوقت نفسه ، تسمح المرحلة المستمرة للكولاجين بنمو المحور العصبي والترابط بين المناطق. أخيرا ، يوفر هذا العمل معلومات حول كيفية إجراء التصوير الفلوري للخلايا الحية والكيمياء المناعية لتوصيف التركيبات العصبية البشرية المطبوعة 3D.
Introduction
تمثل الطباعة 3D الدقيقة والقابلة للبرمجة لتركيبات الهيدروجيل المحملة بالخلايا التي تحاكي الأنسجة الرخوة في المختبر تحديا كبيرا. على سبيل المثال ، تعد المحاولات القائمة على البثق المباشر للهلاميات المائية اللينة مشكلة بطبيعتها ، حيث أن الخصائص الميكانيكية الضعيفة المطلوبة لتلخيص البيئة الدقيقة في الجسم الحي تؤدي إلى نقص السلامة الهيكلية ، أو تشوهات الميزات المحددة مسبقا ، أو الانهيار الكامل للهياكل المصنعة. يتمثل الحل التقليدي لهذه المشكلة في طباعة سقالة داعمة من مادة متوافقة حيويا أكثر صلابة تسمح للبنية النهائية بالحفاظ على شكلها. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يحد بشكل كبير من إمكانيات التصميم ويتطلب ضبطا ريولوجيا دقيقا للأحبار المجاورة.
للتغلب على قيود الطباعة ثلاثية الأبعاد التقليدية القائمة على البثق طبقة تلو الأخرى ، ظهرت الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة في السنوات الأخيرة كبديل قوي للمواد اللينة وتصنيع الأنسجة1،2،3،4،5،6. بدلا من بثق الحبر في الهواء المحيط أعلى السطح ، يتم ترسيب الحبر مباشرة من خلال إبرة حقنة داخل حمام دعم يشبه الصلابة أثناء الراحة ولكنه يميع بشكل عكسي حول طرف الإبرة المتحرك للسماح بالترسب الدقيق للمواد المحملة بالخلايا الناعمة. يتم الاحتفاظ بالمادة المترسبة في مكانها حيث يتماسك الدعم في أعقاب الإبرة. على هذا النحو ، تسمح الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة بتصنيع الأشكال الحرة عالية الدقة للهياكل المعقدة من المواد الحيوية اللينة مع إمكانيات تصميم موسعة 7,8.
تم استكشاف المواد الهلامية الحبيبية على نطاق واسع كمواد حمام داعمة للطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، حيث يمكن صياغتها لإظهار انتقالات سلسة وموضعية وقابلة للانعكاس من الصلب إلى السائل عند ضغوط منخفضة العائد9،10،11. في حين أنها تظهر خصائص ريولوجية ممتازة للطباعة عالية الدقة ، فقد اقتصرت المواد الهلامية الحبيبية على حفنة من المواد الحيوية12. إن الافتقار إلى التنوع في تركيبات الجل الحبيبي ، والذي يتضح بشكل خاص إذا أخذنا في الاعتبار المجموعة الواسعة من المواد الحيوية المتاحة لتركيبات الهيدروجيل السائبة ، ناتج عن الحاجة إلى توليد فعال من حيث التكلفة لعدد كبير من الهلاميات الدقيقة باستخدام مواد كيميائية بسيطة. نظرا لمحدودية مشهد المواد الحيوية لدعامات الهلام الحبيبي ، فإن ضبط البيئة المكروية خارج الخلية التي يوفرها دعم الطباعة يمثل تحديا في هذا المجال.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج معياري لتوليد دعامات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، والتي يطلق عليها مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE)13. يجمع هذا النهج بين الخصائص الريولوجية المميزة للمواد الهلامية الحبيبية مع التنوع الوظيفي الحيوي لتركيبات الهيدروجيل السائبة. يتكون دعم مركب SHAPE المقدم من جسيمات الجينات الدقيقة المعبأة (المرحلة الحبيبية ، ~ 70٪ جزء حجمي) مع مساحة خلالية متزايدة مملوءة بمحلول pregel ECM اللزج القائم على الكولاجين (المرحلة المستمرة ، ~ 30٪ جزء الحجم). وقد تبين كذلك أن دعم SHAPE يسهل ترسب الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSCs) عالية الدقة والتي ، بعد تلدين حمام الدعم ، يمكن تمييزها إلى خلايا عصبية والحفاظ عليها لأسابيع للوصول إلى النضج الوظيفي. تتغلب الطباعة 3D المضمنة داخل حمام دعم SHAPE على بعض القيود الرئيسية المتعلقة بالتقنيات التقليدية للتصنيع الحيوي للأنسجة العصبية مع توفير منصة متعددة الاستخدامات.
يفصل هذا العمل خطوات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ل hNSCs داخل دعم SHAPE وتمايزها اللاحق إلى خلايا عصبية وظيفية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الجسيمات الدقيقة للجينات عن طريق القص أثناء الهلام الداخلي. يسمح هذا النهج بتوليد كميات كبيرة من الجسيمات الدقيقة بسهولة دون الحاجة إلى معدات متخصصة وكواشف سامة للخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الجينات هي مصدر مواد اقتصادي ومتاح على نطاق واسع لتشكيل ركائز هيدروجيل متوافقة حيويا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. يتم دمج الجسيمات الدقيقة للجينات المتولدة مع محلول الكولاجين لتشكيل مادة دعم مركبة SHAPE. بعد ذلك ، يتم حصاد hNSCs وتحميلها في حقنة كحبر حيوي خلوي للطباعة 3D. يتم استخدام طابعة حيوية 3D للطباعة المضمنة القائمة على البثق ل hNSCs داخل مركب SHAPE. يتم تمييز الخلايا المطبوعة 3D إلى خلايا عصبية لتؤدي إلى بنى عصبية بشرية محددة مكانيا ووظيفية. أخيرا ، يصف البروتوكول كيف يمكن وصف تركيبات الأنسجة المتولدة باستخدام تصوير الخلايا الحية والكيمياء المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نصائح للتحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. والجدير بالذكر أنه يمكن تبادل كل من مكونات المرحلتين الحبيبية والمستمرة مع تركيبات هيدروجيل أخرى لاستيعاب مختلف الأجزاء الوظيفية الحيوية ، والخواص الميكانيكية ، وآليات التشابك ، كما هو مطلوب من قبل أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى خارج التطبيقات العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر نهج المواد المركبة SHAPE طريقا متعدد الاستخدامات لصياغة حمامات الدعم القابلة للصلب والوظيفية الحيوية للطباعة 3D المضمنة للأحبار الخلوية. في حين أن هذا البروتوكول يوفر مثالا على الطباعة 3D للتركيبات العصبية ، يمكن بسهولة تكييف صندوق أدوات SHAPE مع التصنيع الحيوي مع مصادر الخلايا الأخرى لل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل البحث بشكل أساسي من قبل برنامج BrainMatTrain للاتحاد الأوروبي Horizon 2020 (رقم H2020-MSCA-ITN-2015) بموجب شبكة ماري سكودوفسكا – كوري للتدريب الأولي واتفاقية المنحة رقم 676408. يود كل من CR و JUL أن يعربا عن امتنانهما لمؤسسة Lundbeck (R250-2017-1425) وصندوق الأبحاث المستقل الدنماركي (8048-00050) لدعمهما. نحن نقدر بامتنان تمويل مشروع HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
