微凝胶-细胞外基质复合材料支持人类神经结构的嵌入式3D打印
Summary
这项工作描述了在自修复可退火颗粒 – 细胞外基质复合材料中自由形式嵌入神经干细胞的协议。该协议能够以高保真度对互连的人类神经组织结构进行可编程模式化。
Abstract
在过去十年中，颗粒支持介质内细胞的嵌入式3D打印已成为软组织构建体自由形式生物制造的有力方法。然而，颗粒凝胶配方仅限于有限数量的生物材料，这些生物材料允许经济高效地产生大量水凝胶微粒。因此，颗粒凝胶支持培养基通常缺乏天然细胞外基质（ECM）中的细胞粘附和细胞指导功能。
为了解决这个问题，已经开发了一种用于生成自修复可退火颗粒 – 细胞外基质（SHAPE）复合材料的方法。SHAPE复合材料由颗粒相（微凝胶）和连续相（粘性ECM溶液）组成，它们共同允许可编程的高保真打印和可调节的生物功能细胞外环境。这项工作描述了如何利用开发的方法对人类神经结构进行精确的生物制造。
首先，制备作为SHAPE复合材料颗粒组分的藻酸盐微粒，并与基于胶原蛋白的连续组分结合。然后，将人神经干细胞打印在载体材料内部，然后对载体进行退火。打印的构建体可以维持数周，以使打印的细胞分化为神经元。同时，胶原蛋白连续相允许轴突生长和区域互连。最后，这项工作提供了有关如何进行活细胞荧光成像和免疫细胞化学以表征3D打印的人类神经构建体的信息。
Introduction
在 体外 模拟软组织的含有细胞的水凝胶结构的精确和可编程的3D打印提出了重大挑战。例如，基于软水凝胶的直接挤出的尝试本质上是有问题的，因为概括 体内 微环境所需的不良机械性能导致缺乏结构完整性，预定义特征变形或制造结构完全崩溃。此问题的常规解决方法是用更硬的生物相容性材料打印支撑支架，使最终结构保持其形状。然而，这种方法极大地限制了设计的可能性，并且需要对相邻油墨进行仔细的流变微调。
为了克服传统的逐层挤出3D打印的局限性，嵌入式3D打印近年来已成为软材料和组织制造的有力替代方案1，2，3，4，5，6。墨水不是在环境空气中挤出在表面上，而是直接通过支撑槽内的注射器针头沉积，支撑槽在静止时呈固体状，但在移动针尖周围可逆地流化，以允许精确沉积软细胞材料。当支撑物在针尾重新凝固时，沉积的材料保持原位。因此，嵌入式3D打印允许从软生物材料中高分辨率自由形式制造复杂的结构，并具有扩展的设计可能性7，8。
颗粒凝胶已被广泛探索为嵌入式3D打印的支撑浴材料，因为它们可以配制成在低屈服应力下表现出平滑，局部和可逆的固液转变9，10，11。虽然颗粒凝胶在高分辨率印刷中表现出优异的流变特性，但仅限于少数生物材料12。颗粒凝胶配方缺乏多样性，如果考虑到可用于散装水凝胶配方的广泛生物材料，这一点尤其明显，这是由于需要使用简单的化学方法经济高效地生成大量微凝胶造成的。由于颗粒凝胶载体的生物材料前景有限，因此由打印载体提供的细胞外微环境的调整在该领域提出了挑战。
最近，已经开发了一种用于生成嵌入式3D打印载体的模块化方法，称为自修复退火颗粒 – 细胞外基质（SHAPE）复合材料13。这种方法将颗粒凝胶的独特流变特性与块状水凝胶配方的生物功能多功能性相结合。所提出的SHAPE复合载体由填充的藻酸盐微粒（颗粒相，~70%体积分数）组成，增加的间隙空间充满了粘性胶原蛋白基ECM预凝胶溶液（连续相，~30%体积分数）。进一步表明，SHAPE支持物有助于人类神经干细胞（hNSCs）的高分辨率沉积，在支撑浴退火后，可以分化成神经元并保持数周以达到功能成熟。SHAPE支撑槽内的嵌入式3D打印克服了与传统神经组织生物制造技术相关的一些主要限制，同时提供了一个多功能平台。
这项工作详细介绍了在SHAPE支持内嵌入hNSCs的步骤，以及它们随后分化为功能性神经元的步骤（图1）。首先，在内部凝胶化过程中 通过剪切产生 藻酸盐微粒。这种方法可以轻松生成大量微粒，而无需专门的设备和细胞毒性试剂。此外，海藻酸盐是一种广泛可用且经济的材料来源，用于形成适用于各种细胞类型的生物相容性水凝胶底物。生成的藻酸盐微粒与胶原溶液结合，形成SHAPE复合支撑材料。然后，收集hNSCs并作为细胞生物墨水加载到注射器中进行3D打印。3D生物打印机用于基于挤出的嵌入式打印hNSCs在SHAPE复合材料内。3D打印的细胞被分化成神经元，以产生空间定义和功能性的人类神经结构。最后，该协议描述了如何使用活细胞成像和免疫细胞化学表征生成的组织构建体。此外，还提供了有关优化和故障排除的提示。值得注意的是，颗粒相和连续相的组分都可以与其他水凝胶配方交换，以适应不同的生物功能部分、机械性能和交联机制，以满足神经应用以外的其他细胞和组织类型的需求。
Protocol
Representative Results
Discussion
SHAPE复合材料方法为配制用于蜂窝油墨嵌入式3D打印的可退火和生物功能支撑浴提供了一种通用途径。虽然该协议提供了神经构建体3D打印的示例，但SHAPE工具箱可以很容易地适应与其他细胞来源的生物制造，以精确设计一系列目标组织类型。打印方法还将允许对多种细胞类型进行精确图案化，以研究它们的相互作用或设计具有细胞区室（例如神经元和神经胶质细胞）定义空间排列的组织。与传统?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究主要由玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里初始培训网络和第676408号赠款协议下的BrainMatTrain欧盟地平线2020计划（编号H2020-MSCA-ITN-2015）资助。C.R.和J.U.L.感谢灵北基金会（R250-2017-1425）和丹麦独立研究基金（8048-00050）的支持。我们非常感谢OpenMIND 101047177 HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01项目的资金。
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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