Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.
Abstract
Der eingebettete 3D-Druck von Zellen in einem granularen Trägermedium hat sich in den letzten zehn Jahren zu einem leistungsstarken Ansatz für die Freiform-Biofabrikation von Weichteilkonstrukten entwickelt. Granulierte Gelformulierungen sind jedoch auf eine begrenzte Anzahl von Biomaterialien beschränkt, die die kostengünstige Erzeugung großer Mengen von Hydrogel-Mikropartikeln ermöglichen. Daher fehlten granularen Gelträgermedien im Allgemeinen die zelladhäsiven und zellinstruktiven Funktionen, die in der nativen extrazellulären Matrix (EZM) zu finden sind.
Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Methodik zur Erzeugung von selbstheilenden annealbaren Partikel-extrazellulären Matrix-Kompositen (SHAPE) entwickelt. SHAPE-Verbundwerkstoffe bestehen aus einer granularen Phase (Mikrogele) und einer kontinuierlichen Phase (viskose ECM-Lösung), die zusammen sowohl einen programmierbaren High-Fidelity-Druck als auch eine einstellbare biofunktionelle extrazelluläre Umgebung ermöglichen. Diese Arbeit beschreibt, wie die entwickelte Methodik für die präzise Biofabrikation menschlicher neuronaler Konstrukte genutzt werden kann.
Zunächst werden Alginat-Mikropartikel, die als körnige Komponente in den SHAPE-Verbundwerkstoffen dienen, hergestellt und mit einer kollagenbasierten kontinuierlichen Komponente kombiniert. Dann werden menschliche neuronale Stammzellen in das Trägermaterial gedruckt, gefolgt vom Ausglühen des Trägers. Die gedruckten Konstrukte können wochenlang aufrechterhalten werden, um die Differenzierung der gedruckten Zellen zu Neuronen zu ermöglichen. Gleichzeitig ermöglicht die kontinuierliche Phase des Kollagens das axonale Wachstum und die Verbindung von Regionen. Schließlich liefert diese Arbeit Informationen darüber, wie Lebendzell-Fluoreszenzbildgebung und Immunzytochemie durchgeführt werden können, um die 3D-gedruckten menschlichen neuronalen Konstrukte zu charakterisieren.
Introduction
Der präzise und programmierbare 3D-Druck von zellbeladenen Hydrogel-Konstrukten, die Weichgewebe in vitro nachahmen, stellt eine große Herausforderung dar. Zum Beispiel sind Versuche, die auf der direkten Extrusion von weichen Hydrogelen basieren, von Natur aus problematisch, da die schlechten mechanischen Eigenschaften, die erforderlich sind, um die In-vivo-Mikroumgebung zu rekapitulieren, zu einem Mangel an struktureller Integrität, zu Verformungen der vordefinierten Merkmale oder zum vollständigen Kollaps der hergestellten Strukturen führen. Eine konventionelle Problemumgehung für dieses Problem besteht darin, ein Stützgerüst aus einem steiferen biokompatiblen Material zu drucken, das es dem endgültigen Konstrukt ermöglicht, seine Form beizubehalten. Dieser Ansatz schränkt jedoch die Gestaltungsmöglichkeiten stark ein und erfordert eine sorgfältige rheologische Feinabstimmung der angrenzenden Tinten.
Um die Einschränkungen des traditionellen schichtweise extrusionsbasierten 3D-Drucks zu überwinden, hat sich der eingebettete 3D-Druck in den letzten Jahren zu einer leistungsstarken Alternative für die Herstellung von weichem Material und Gewebe entwickelt 1,2,3,4,5,6. Anstatt die Tinte in der Umgebungsluft auf einer Oberfläche zu extrudieren, wird die Tinte direkt durch eine Spritzennadel in einem Stützbad abgeschieden, das im Ruhezustand feststoffartig ist, aber reversibel um die bewegliche Nadelspitze herum fluidisiert, um die präzise Abscheidung von weichem, zellbeladenem Material zu ermöglichen. Das abgeschiedene Material wird an Ort und Stelle gehalten, während sich der Träger im Nachlauf der Nadel wieder verfestigt. So ermöglicht der eingebettete 3D-Druck die hochauflösende Freiformherstellung komplizierter Strukturen aus weichen Biomaterialien mit erweiterten Gestaltungsmöglichkeiten 7,8.
Granulare Gele wurden ausgiebig als Stützbadmaterialien für den eingebetteten 3D-Druck untersucht, da sie so formuliert werden können, dass sie glatte, lokalisierte und reversible Fest-Flüssig-Übergänge bei niedrigen Streckspannungen aufweisen 9,10,11. Während sie hervorragende rheologische Eigenschaften für den hochauflösenden Druck aufweisen, wurden granulare Gele bisher auf eine Handvoll Biomaterialien beschränkt12. Die mangelnde Vielfalt an granulierten Gelformulierungen, die besonders deutlich wird, wenn man die breite Palette von Biomaterialien betrachtet, die für Hydrogel-Bulk-Formulierungen zur Verfügung stehen, wird durch die Notwendigkeit der kostengünstigen Herstellung einer großen Anzahl von Mikrogelen mit einfachen Chemikalien verursacht. Aufgrund der begrenzten Biomateriallandschaft granularer Gelträger stellt die Abstimmung der extrazellulären Mikroumgebung, die durch den Druckträger bereitgestellt wird, eine Herausforderung in diesem Bereich dar.
In jüngster Zeit wurde ein modularer Ansatz für die Erzeugung von eingebetteten 3D-Druckträgern entwickelt, der als selbstheilende annealable particle-extracellular matrix (SHAPE)-Verbundwerkstoffebezeichnet wird 13. Dieser Ansatz kombiniert die unterschiedlichen rheologischen Eigenschaften von granularen Gelen mit der biofunktionellen Vielseitigkeit von Bulk-Hydrogel-Formulierungen. Der vorgestellte SHAPE-Composite-Träger besteht aus gepackten Alginat-Mikropartikeln (granulare Phase, ~70% Volumenanteil) mit einem vergrößerten interstitiellen Raum, der mit einer viskosen kollagenbasierten ECM-Pregellösung (kontinuierliche Phase, ~30% Volumenanteil) gefüllt ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der SHAPE-Träger die hochauflösende Ablagerung von humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) ermöglicht, die nach dem Ausglühen des Trägerbades zu Neuronen differenziert und wochenlang aufrechterhalten werden können, um eine funktionelle Reifung zu erreichen. Der eingebettete 3D-Druck im Inneren des SHAPE-Stützbades überwindet einige der wichtigsten Einschränkungen im Zusammenhang mit herkömmlichen Techniken für die Biofabrikation von Nervengewebe und bietet gleichzeitig eine vielseitige Plattform.
Diese Arbeit beschreibt die Schritte für den eingebetteten 3D-Druck von hNSCs innerhalb des SHAPE-Trägers und ihre anschließende Differenzierung in funktionelle Neuronen (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikropartikel durch Scherung während der internen Gelierung erzeugt. Dieser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung großer Mengen von Mikropartikeln, ohne dass spezielle Geräte und zytotoxische Reagenzien erforderlich sind. Darüber hinaus ist Alginat eine weit verbreitete und kostengünstige Materialquelle für die Bildung biokompatibler Hydrogelsubstrate für eine Vielzahl von Zelltypen. Die erzeugten Alginat-Mikropartikel werden mit einer Kollagenlösung kombiniert, um das SHAPE-Komposit-Trägermaterial zu bilden. Anschließend werden die hNSCs geerntet und als zelluläre Biotinte für den 3D-Druck in eine Spritze geladen. Ein 3D-Biodrucker wird für den extrusionsbasierten eingebetteten Druck von hNSCs im Inneren des SHAPE-Verbundwerkstoffs verwendet. Die 3D-gedruckten Zellen werden zu Neuronen differenziert, so dass räumlich definierte und funktionelle menschliche neuronale Konstrukte entstehen. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie die erzeugten Gewebekonstrukte mittels Lebendzellbildgebung und Immunzytochemie charakterisiert werden können. Zusätzlich werden Tipps zur Optimierung und Fehlerbehebung gegeben. Insbesondere konnten sowohl die Komponenten der granularen als auch der kontinuierlichen Phase mit anderen Hydrogelformulierungen ausgetauscht werden, um unterschiedliche biofunktionelle Einheiten, mechanische Eigenschaften und Vernetzungsmechanismen zu berücksichtigen, wie sie von anderen Zell- und Gewebetypen jenseits neuronaler Anwendungen benötigt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der SHAPE-Verbundwerkstoffansatz bietet einen vielseitigen Weg für die Formulierung von glühbaren und biofunktionalen Trägerbädern für den eingebetteten 3D-Druck von zellulären Tinten. Während dieses Protokoll ein Beispiel für den 3D-Druck neuronaler Konstrukte darstellt, könnte die SHAPE-Toolbox leicht an die Biofabrikation mit anderen Zellquellen angepasst werden, um eine Reihe von Zielgewebetypen präzise zu entwickeln. Der Druckansatz würde auch die präzise Strukturierung mehrerer Zelltypen ermöglichen, u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung wurde hauptsächlich durch das BrainMatTrain Horizon 2020 Programm der Europäischen Union (Nr. H2020-MSCA-ITN-2015) im Rahmen des Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network und der Finanzhilfevereinbarung Nr. 676408 finanziert. C.R. und J.U.L. bedanken sich bei der Lundbeck Foundation (R250-2017-1425) und dem Independent Research Fund Denmark (8048-00050) für ihre Unterstützung. Wir bedanken uns für die Förderung des Projekts HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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