Композитная поддержка микрогеля и внеклеточного матрикса для встроенной 3D-печати нейронных конструкций человека
Summary
В этой работе описывается протокол встроенной 3D-печати произвольной формы нервных стволовых клеток внутри самовосстанавливающихся отожженных композитов частица-внеклеточный матрикс. Протокол позволяет программировать паттерны взаимосвязанных конструкций нервной ткани человека с высокой точностью.
Abstract
Встроенная 3D-печать клеток внутри гранулированной опорной среды появилась в последнее десятилетие как мощный подход к биофабрикации мягких тканей произвольной формы. Однако гранулированные гелевые составы были ограничены ограниченным числом биоматериалов, которые позволяют экономически эффективно генерировать большое количество микрочастиц гидрогеля. Таким образом, гранулированным гелевым носителям, как правило, не хватает клеточно-адгезивных и клеточных инструктивных функций, обнаруженных в нативном внеклеточном матриксе (ECM).
Для решения этой проблемы была разработана методология создания самовосстанавливающихся отожженных композитов частица и внеклеточный матрикс (SHAPE). Композиты SHAPE состоят из гранулированной фазы (микрогели) и непрерывной фазы (вязкий раствор ECM), которые вместе обеспечивают как программируемую печать с высокой точностью, так и регулируемую биофункциональную внеклеточную среду. В этой работе описывается, как разработанная методология может быть использована для точной биофабрикации нейронных конструкций человека.
Во-первых, альгинатные микрочастицы, которые служат гранулированным компонентом в композитах SHAPE, изготавливаются и комбинируются с непрерывным компонентом на основе коллагена. Затем нервные стволовые клетки человека печатаются внутри опорного материала с последующим отжигом опоры. Напечатанные конструкции могут поддерживаться в течение нескольких недель, чтобы обеспечить дифференцировку напечатанных клеток в нейроны. В то же время непрерывная фаза коллагена обеспечивает рост аксонов и взаимосвязь областей. Наконец, эта работа предоставляет информацию о том, как выполнять флуоресцентную визуализацию живых клеток и иммуноцитохимию для характеристики нейронных конструкций человека, напечатанных на 3D-принтере.
Introduction
Точная и программируемая 3D-печать нагруженных клетками гидрогелевых конструкций, имитирующих мягкие ткани in vitro , представляет собой серьезную проблему. Например, попытки, основанные на прямой экструзии мягких гидрогелей, по своей сути проблематичны, поскольку плохие механические свойства, необходимые для повторения микроокружения in vivo , приводят к отсутствию структурной целостности, деформации предопределенных признаков или полному разрушению изготовленных конструкций. Обычным обходным путем для этой проблемы является печать поддерживающих лесов из более жесткого биосовместимого материала, который позволяет окончательной конструкции сохранять свою форму. Однако такой подход сильно ограничивает возможности дизайна и требует тщательной реологической тонкой настройки соседних красок.
Чтобы преодолеть ограничения традиционной послойной экструзионной 3D-печати, в последние годы встроенная 3D-печать стала мощной альтернативой для изготовления мягких материалов и тканей 1,2,3,4,5,6. Вместо того, чтобы экструдировать чернила в окружающем воздухе поверх поверхности, чернила непосредственно осаждаются через иглу шприца внутри опорной ванны, которая в состоянии покоя имеет твердое тело, но обратимо псевдоожижается вокруг движущегося кончика иглы, чтобы обеспечить точное осаждение мягкого материала, содержащего клетки. Осажденный материал удерживается на месте по мере того, как опора затвердевает после нажатия иглы. Таким образом, встроенная 3D-печать позволяет изготавливать сложные структуры произвольной формы с высоким разрешением из мягких биоматериалов с расширенными возможностями проектирования 7,8.
Гранулированные гели были широко исследованы в качестве материалов для опорных ванн для встроенной 3D-печати, поскольку они могут быть разработаны для демонстрации плавных, локализованных и обратимых переходов из твердого тела в жидкость при низких напряжениях текучести 9,10,11. Несмотря на то, что гранулированные гели демонстрируют превосходные реологические свойства для печати с высоким разрешением, они ограничены несколькими биоматериалами12. Отсутствие разнообразия в гранулированных гелевых составах, что особенно очевидно, если учесть широкий спектр биоматериалов, доступных для объемных гидрогелевых составов, вызвано необходимостью экономически эффективного производства большого количества микрогелей с использованием простых химических составов. Из-за ограниченного биоматериального ландшафта гранулированных гелевых носителей настройка внеклеточного микроокружения, обеспечиваемого печатной подложкой, представляет собой проблему в полевых условиях.
Недавно был разработан модульный подход к созданию встроенных опор для 3D-печати, называемых самовосстанавливающимися отожженными частицами-внеклеточными матриксами (SHAPE)13. Этот подход сочетает в себе различные реологические свойства гранулированных гелей с биофункциональной универсальностью объемных гидрогелевых составов. Представленная композитная основа SHAPE состоит из упакованных альгинатных микрочастиц (гранулированная фаза, объемная доля ~70%) с увеличенным межтканевым пространством, заполненным вязким раствором прегеля ECM на основе коллагена (непрерывная фаза, объемная доля ~30%). Кроме того, было показано, что опора SHAPE облегчает осаждение нервных стволовых клеток человека (hNSC) с высоким разрешением, которые после отжига опорной ванны могут быть дифференцированы в нейроны и поддерживаться в течение нескольких недель до достижения функционального созревания. Встроенная 3D-печать внутри опорной ванны SHAPE преодолевает некоторые из основных ограничений, связанных с традиционными методами биофабрикации нервной ткани, обеспечивая при этом универсальную платформу.
В этой работе подробно описаны этапы встроенной 3D-печати hNSC внутри опоры SHAPE и их последующей дифференцировки в функциональные нейроны (рис. 1). Во-первых, альгинатные микрочастицы образуются при сдвиге во время внутреннего гелеобразования. Такой подход позволяет легко генерировать большие объемы микрочастиц без необходимости использования специализированного оборудования и цитотоксических реагентов. Кроме того, альгинат является широко доступным и экономичным источником материала для формирования биосовместимых гидрогелевых субстратов для широкого спектра типов клеток. Полученные альгинатные микрочастицы объединяются с раствором коллагена с образованием композитного опорного материала SHAPE. Затем hNSC собирают и загружают в шприц в виде клеточных биочернил для 3D-печати. 3D-биопринтер используется для экструзионной встроенной печати hNSC внутри композита SHAPE. Клетки, напечатанные на 3D-принтере, дифференцируются в нейроны, чтобы дать начало пространственно определенным и функциональным нейронным конструкциям человека. Наконец, протокол описывает, как генерируемые тканевые конструкции могут быть охарактеризованы с использованием визуализации живых клеток и иммуноцитохимии. Кроме того, предоставляются советы по оптимизации и устранению неполадок. Примечательно, что как компоненты гранулированной, так и непрерывной фаз могут быть заменены с другими гидрогелевыми составами для размещения различных биофункциональных фрагментов, механических свойств и механизмов сшивания, как того требуют другие типы клеток и тканей, помимо нейронных применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подход к композитным материалам SHAPE обеспечивает универсальный путь для создания отжигаемых и биофункциональных опорных ванн для встроенной 3D-печати ячеистых чернил. Хотя этот протокол представляет собой пример 3D-печати нейронных конструкций, набор инструментов SHAPE может быть легко ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование в основном финансировалось программой BrainMatTrain European Union Horizon 2020 (No H2020-MSCA-ITN-2015) в рамках Сети начальной подготовки Марии Склодовской-Кюри и Соглашения о гранте No 676408. C.R. и J.U.L. выражают благодарность Фонду Лундбека (R250-2017-1425) и Независимому исследовательскому фонду Дании (8048-00050) за их поддержку. Мы с благодарностью отмечаем финансирование проекта HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
