نمذجة أورام الدماغ في الجسم الحي باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل توقيعات طفرة المريض
Summary
يعد استخدام نموذج الورم الأصلي المختص بالمناعة والمدفوع بطفرات المريض الشائعة للاختبار قبل السريري أمرا بالغ الأهمية لاختبارات العلاج المناعي. يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد نماذج فأر ورم في المخ باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل طفرات المريض الشائعة ، وبالتالي توفير نموذج فأر دقيق وقابل للتكرار ومتسقة.
Abstract
تعد نماذج الأورام ضرورية للاختبار قبل السريري لأورام الدماغ من حيث استكشاف علاجات جديدة أكثر فعالية. مع الاهتمام الكبير بالعلاج المناعي ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك نموذج فأر متسق ووثيق الصلة سريريا ومختص بالمناعة لفحص الورم ومجموعات الخلايا المناعية في الدماغ واستجابتها للعلاج. في حين أن معظم النماذج قبل السريرية تستخدم زرع تقويم العظام لخطوط الخلايا السرطانية المنشأة ، فإن نظام النمذجة المقدم هنا يسمح بتمثيل “شخصي” لطفرات الورم الخاصة بالمريض في تطور تدريجي ولكنه فعال من تركيبات الحمض النووي التي يتم إدخالها في خلايا السلائف العصبية المنقسمة (NPCs) في الجسم الحي. تتميز تركيبات الحمض النووي بتحليل الفسيفساء باستخدام طريقة تبادل الكاسيت المزدوج بوساطة إعادة التركيب (MADR) ، مما يسمح بطفرات جسدية أحادية النسخة لطفرات المحرك. باستخدام صغار الفئران حديثي الولادة بين الولادة وعمر 3 أيام ، يتم استهداف الشخصيات غير القابلة للعب من خلال الاستفادة من هذه الخلايا المنقسمة التي تبطن البطينين الجانبيين. الحقن المجهري لبلازميدات الحمض النووي (على سبيل المثال ، مشتقة من MADR ، ترانسبوزونات ، sgRNA الموجهة لكريسبر) في البطينين يتبعها التثقيب الكهربائي باستخدام المجاذيف التي تحيط بمنطقة المنقار في الرأس. عند التحفيز الكهربائي ، يتم امتصاص الحمض النووي في الخلايا المنقسمة ، مع إمكانية الاندماج في الجينوم. تم إثبات استخدام هذه الطريقة بنجاح في تطوير كل من أورام الدماغ لدى الأطفال والبالغين ، بما في ذلك ورم الدماغ الخبيث الأكثر شيوعا ، الورم الأرومي الدبقي. تناقش هذه المقالة وتوضح الخطوات المختلفة لتطوير نموذج ورم في المخ باستخدام هذه التقنية ، بما في ذلك إجراء تخدير صغار الفئران ، إلى الحقن المجهري لمزيج البلازميد ، متبوعا بالتثقيب الكهربائي. مع هذا النموذج الأصلي للفأر المناعي ، سيكون لدى الباحثين القدرة على توسيع مناهج النمذجة قبل السريرية ، في محاولة لتحسين وفحص علاج السرطان الفعال.
Introduction
تعد نماذج أورام دماغ الفئران ضرورية لفهم آليات تكوين ورم الدماغ وعلاجه. تتضمن النماذج الحالية عادة عمليات زرع تحت الجلد أو تقويم العظام سريعة الإنتاج لخطوط الخلايا السرطانية شائعة الاستخدام ، بناء على عدد محدود من الطفرات الدافعة أو نماذج xenograft المشتقة من المريض ، باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتي تعيق دراسات العلاج المناعي المناسبة1،2،3،4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه النتائج قبل السريرية إلى إيجابيات كاذبة ، حيث يمكن أن تظهر هذه النماذج تأثيرات علاجية دراماتيكية في كثير من الأحيان استجابة للعلاج ، ولكن هذا لا يترجم إلىالعيادة 2،5،6،7. إن امتلاك القدرة على الإنتاج السريع لنماذج الفئران قبل السريرية المعدلة وراثيا والتي تعكس بشكل أكبر توقيعات طفرات المريض أمر حتمي لتحسين صحة النتائج قبل السريرية.
يسمح التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي (EP) لبلازميدات الحمض النووي للحث على كل من فقدان الوظيفة (LOF) واكتساب الوظيفة (GOF) بتوليد مثل هذه النماذج. لقد طورنا طريقة لتمثيل أكثر دقة لطفرات محرك GOF تسمى تحليل الفسيفساء مع تبادل الكاسيت بوساطة إعادة التركيب المزدوج ، أو MADR8. تسمح هذه الطريقة بالتعبير عن جين (أو جينات) ذات أهمية بطريقة خاضعة للرقابة ومحددة للموضع في الخلايا الجسدية8. بالاقتران مع الأدوات الجزيئية الأخرى ، مثل التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) ، يمكن الجمع بين طفرات المريض المختلفة لتطوير نماذج ورم دماغ الفئران. تم استخدام هذه الطريقة لأورام الدماغ المختلفة لدى الأطفال ، بما في ذلك الأورام الدبقية وأورام البطانةالعصبية 8 ، بالإضافة إلى نماذج أورام الدماغ للبالغين ، مثل الورم الأرومي الدبقي (GBM).
في حين أن طريقة EP لنمذجة الورم ليست شائعة مثل عملية الزرع ، فإن ما يلي يوضح حتى الآن سهولة نظام النمذجة هذا وقابليته العالية للتكرار. تستخدم الفئران mTmG لإدخال الحمض النووي MADR-plasmid 8,9. يسمح هذا النظام بإعادة تركيب مواقع هدف loxP و Flp recombinase (FRT) الموجودة في موضع Rosa26 للإدخال اللاحق لبلازميد الحمض النووي المانح (أي جين GOF محل الاهتمام)8,9. يوضح البروتوكول التالي استقامة هذه الطريقة بعد الممارسة الدؤوبة ، والقدرة على تطوير نماذج أورام دماغ الفئران بطريقة أصلية ومتسقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح توصيل الحمض النووي البلازميد القائم على التثقيب الكهربائي باستخدام البيولوجيا الجزيئية في الجسم الحي ، على غرار تلك المستخدمة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، ولكن مع سرعة وتوطين وكفاءة نقل الفيروس8،13،14. ومع ذلك ، مع هذا الأخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Gi Bum Kim على التلوين المناعي والصور. كما نشكر إميلي هاتاناكا ونعومي كوبريتز وبول لينيش على النصائح المفيدة بشأن البروتوكول.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
