Modellering van hersentumoren in vivo met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA dat de handtekeningen van patiëntmutaties vertegenwoordigt
Summary
Het gebruik van een immunocompetent, autochtoon tumormodel aangedreven door gemeenschappelijke patiëntmutaties voor preklinische tests is van cruciaal belang voor immunotherapeutische tests. Dit protocol beschrijft een methode om muismodellen voor hersentumoren te genereren met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA die veelvoorkomende patiëntmutaties vertegenwoordigen, waardoor een nauwkeurig, reproduceerbaar en consistent muismodel wordt verkregen.
Abstract
Tumormodellen zijn van cruciaal belang voor het preklinisch testen van hersentumoren in termen van het verkennen van nieuwe, effectievere behandelingen. Met een aanzienlijke interesse in immunotherapie is het nog belangrijker om een consistent, klinisch relevant, immunocompetent muismodel te hebben om de tumor- en immuuncelpopulaties in de hersenen en hun reactie op de behandeling te onderzoeken. Hoewel de meeste preklinische modellen gebruik maken van orthotope transplantatie van gevestigde tumorcellijnen, maakt het hier gepresenteerde modelleringssysteem een “gepersonaliseerde” weergave mogelijk van patiëntspecifieke tumormutaties in een geleidelijke, maar effectieve ontwikkeling van DNA-constructen die in vivo in delende neurale voorlopercellen (NPC’s) zijn ingebracht. DNA-constructen bevatten de mozaïekanalyse met de dual-recombinase-gemedieerde cassette-uitwisseling (MADR)-methode, waardoor somatische mutagenese van drivermutaties in één kopie mogelijk is. Met behulp van pasgeboren muizenpups tussen de geboorte en 3 dagen oud, worden NPC’s aangevallen door gebruik te maken van deze delende cellen die de laterale ventrikels bekleden. Micro-injectie van DNA-plasmiden (bijv. MADR-afgeleid, transposons, CRISPR-gericht sgRNA) in de ventrikels wordt gevolgd door elektroporatie met behulp van peddels die het rostrale gebied van het hoofd omringen. Bij elektrische stimulatie wordt het DNA opgenomen in de delende cellen, met het potentieel om te integreren in het genoom. Het gebruik van deze methode is met succes aangetoond bij het ontwikkelen van zowel pediatrische als volwassen hersentumoren, waaronder de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor, glioblastoom. Dit artikel bespreekt en demonstreert de verschillende stappen van het ontwikkelen van een hersentumormodel met behulp van deze techniek, inclusief de procedure van het verdoven van jonge muizenpups, tot micro-injectie van het plasmidemengsel, gevolgd door elektroporatie. Met dit autochtone, immunocompetente muismodel zullen onderzoekers de mogelijkheid hebben om preklinische modelleringsbenaderingen uit te breiden, in een poging om de effectieve behandeling van kanker te verbeteren en te onderzoeken.
Introduction
Hersentumormodellen bij muizen zijn cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen van de vorming en behandeling van hersentumoren. De huidige modellen omvatten doorgaans snel geproduceerde subcutane of orthotope transplantaties van veelgebruikte tumorcellijnen, gebaseerd op een beperkt aantal drivermutaties of van patiënten afgeleide xenotransplantaatmodellen, met behulp van immunodeficiënte muizen die goede immunotherapiestudies belemmeren 1,2,3,4. Bovendien kunnen deze preklinische resultaten leiden tot valse positieven, in die zin dat dergelijke modellen dramatische, vaak curatieve effecten kunnen vertonen als reactie op therapie, maar dit vertaalt zich niet naar de kliniek 2,5,6,7. Het vermogen om snel genetisch gemanipuleerde preklinische muismodellen te produceren die meer een afspiegeling zijn van de handtekeningen van patiëntmutaties is absoluut noodzakelijk voor het verbeteren van de validiteit van preklinische resultaten.
Op elektroporatie (EP) gebaseerde toediening van DNA-plasmiden om zowel mutaties met functieverlies (LOF) als functiewinst (GOF) te induceren, maakt het mogelijk dergelijke modellen te genereren. We ontwikkelden een methode voor een nog preciezere weergave van GOF-drivermutaties, genaamd mozaïekanalyse met dual-recombinase-gemedieerde cassette-uitwisseling, of MADR8. Deze methode maakt het mogelijk om een gen (of genen) van belang op een gecontroleerde, locusspecifieke manier tot expressie te brengen in somatische cellen8. In combinatie met andere moleculaire hulpmiddelen, zoals geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen (CRISPR), kunnen verschillende patiëntmutaties worden gecombineerd om hersentumormodellen van muizen te ontwikkelen. Deze methode is gebruikt voor verschillende pediatrische hersentumoren, waaronder gliomen en ependymomen8, evenals volwassen hersentumormodellen, zoals glioblastoom (GBM).
Hoewel de EP-methode van tumormodellering niet zo gebruikelijk is als een transplantatie, toont het volgende tot nu toe het gemak en de hoge reproduceerbaarheid van dit modelleringssysteem aan. mTmG-muizen worden gebruikt voor het inbrengen van het MADR-plasmide-DNA 8,9. Dit systeem maakt de recombinatie mogelijk van loxP- en Flp-recombinasedoelwitten (FRT)-locaties op de Rosa26-locus voor daaropvolgende insertie van het donor-DNA-plasmide (d.w.z. het GOF-gen van belang)8,9. Het volgende protocol demonstreert de rechtlijnigheid van deze methode na ijverige oefening en het vermogen om hersentumormodellen van muizen op een autochtone, consistente manier te ontwikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA maakt het in vivo gebruik van moleculaire biologie mogelijk, vergelijkbaar met die gebruikt in genetisch gemanipuleerde muismodellen, maar met de snelheid, lokalisatie en efficiëntie van virale transductie 8,13,14. Met dit laatste komen echter zowel veiligheidsproblemen als immuunreacties. We hebben in ons modelleringssysteem met behulp van EP-afgifte van plasmide-D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Gi Bum Kim voor de immunofluorescerende kleuring en afbeeldingen. We danken ook Emily Hatanaka, Naomi Kobritz en Paul Linesch voor nuttig advies over het protocol.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
