Modellierung von Hirntumoren in vivo unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die die Mutationssignaturen von Patienten repräsentiert
Summary
Die Verwendung eines immunkompetenten, autochthonen Tumormodells, das von häufigen Patientenmutationen angetrieben wird, für präklinische Tests ist für immuntherapeutische Tests von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Hirntumor-Mausmodellen unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die häufige Patientenmutationen repräsentieren, und liefert so ein genaues, reproduzierbares und konsistentes Mausmodell.
Abstract
Tumormodelle sind entscheidend für die präklinische Testung von Hirntumoren im Hinblick auf die Erforschung neuer, wirksamerer Behandlungen. Angesichts des großen Interesses an der Immuntherapie ist es umso wichtiger, ein konsistentes, klinisch relevantes, immunkompetentes Mausmodell zu haben, um die Tumor- und Immunzellpopulationen im Gehirn und ihr Ansprechen auf die Behandlung zu untersuchen. Während die meisten präklinischen Modelle die orthotope Transplantation etablierter Tumorzelllinien verwenden, ermöglicht das hier vorgestellte Modellierungssystem eine “personalisierte” Darstellung patientenspezifischer Tumormutationen in einer allmählichen, aber effektiven Entwicklung aus DNA-Konstrukten, die in sich teilende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) in vivo eingefügt werden. DNA-Konstrukte verfügen über die Mosaikanalyse mit der Dual-Recombinase-vermittelten Kassettenaustauschmethode (MADR), die eine somatische Mutagenese von Treibermutationen in Einzelkopie ermöglicht. Bei neugeborenen Mäusewelpen zwischen der Geburt und dem Alter von 3 Tagen werden NPCs gezielt angesprochen, indem sie sich diese sich teilenden Zellen zunutze machen, die die Seitenventrikel auskleiden. Nach der Mikroinjektion von DNA-Plasmiden (z. B. MADR-abgeleitet, Transposons, CRISPR-gerichtete sgRNA) in die Ventrikel folgt die Elektroporation mit Paddeln, die die rostrale Region des Kopfes umgeben. Bei elektrischer Stimulation wird die DNA in die sich teilenden Zellen aufgenommen, mit dem Potenzial, sich in das Genom zu integrieren. Der Einsatz dieser Methode wurde sowohl bei der Entwicklung von pädiatrischen als auch bei erwachsenen Hirntumoren, einschließlich des häufigsten bösartigen Hirntumors, des Glioblastoms, erfolgreich nachgewiesen. Dieser Artikel diskutiert und demonstriert die verschiedenen Schritte der Entwicklung eines Hirntumormodells mit dieser Technik, einschließlich des Verfahrens der Anästhesie junger Mäusejungtiere bis hin zur Mikroinjektion der Plasmidmischung, gefolgt von der Elektroporation. Mit diesem autochthonen, immunkompetenten Mausmodell werden die Forscher in der Lage sein, präklinische Modellierungsansätze zu erweitern, um die Wirksamkeit der Krebsbehandlung zu verbessern und zu untersuchen.
Introduction
Maus-Hirntumormodelle sind entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Entstehung und Behandlung von Hirntumoren. Derzeitige Modelle umfassen in der Regel schnell hergestellte subkutane oder orthotope Transplantationen häufig verwendeter Tumorzelllinien, die auf einer begrenzten Anzahl von Treibermutationen oder von Patienten abgeleiteten Xenotransplantatmodellen basieren, wobei immundefiziente Mäuse verwendet werden, die geeignete Immuntherapiestudien behindern 1,2,3,4. Darüber hinaus können diese präklinischen Ergebnisse zu falsch positiven Ergebnissen führen, da solche Modelle dramatische, oft heilende Effekte als Reaktion auf die Therapie aufweisen können, was sich jedoch nicht auf die Klinik übertragen lässt 2,5,6,7. Die Fähigkeit, schnell gentechnisch veränderte präklinische Mausmodelle herzustellen, die die Mutationssignaturen der Patienten besser widerspiegeln, ist unerlässlich, um die Validität präklinischer Ergebnisse zu verbessern.
Die auf Elektroporation (EP) basierende Verabreichung von DNA-Plasmiden, die sowohl Funktionsverlust- (LOF) als auch Funktionsverstärkungsmutationen (GOF) induzieren, ermöglicht die Generierung solcher Modelle. Wir haben eine Methode für eine noch genauere Darstellung von GOF-Treibermutationen entwickelt, die Mosaikanalyse mit dualem Rekombinase-vermitteltem Kassettenaustausch, kurz MADR8. Dieses Verfahren ermöglicht die Expression eines Gens (oder von Genen) von Interesse in einer kontrollierten, locusspezifischen Weise in somatischen Zellen8. In Kombination mit anderen molekularen Werkzeugen, wie z.B. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), können verschiedene Patientenmutationen kombiniert werden, um Hirntumormodelle für Mäuse zu entwickeln. Diese Methode wurde bei verschiedenen pädiatrischen Hirntumoren, darunter Gliome und Ependymome8, sowie bei erwachsenen Hirntumormodellen wie dem Glioblastom (GBM) eingesetzt.
Während die EP-Methode der Tumormodellierung nicht so verbreitet ist wie eine Transplantation, zeigt das Folgende die Einfachheit und hohe Reproduzierbarkeit dieses Modellierungssystems. mTmG-Mäuse werden für die Insertion der MADR-Plasmid-DNA 8,9 verwendet. Dieses System ermöglicht die Rekombination von loxP- und Flp-Rekombinase-Zielstellen (FRT), die sich am Rosa26-Locus befinden, für die anschließende Insertion des DNA-Plasmids des Spenders (d. h. des GOF-Gens von Interesse)8,9. Das folgende Protokoll demonstriert die Einfachheit dieser Methode nach sorgfältigem Üben und die Fähigkeit, Hirntumormodelle von Mäusen auf autochthone, konsistente Weise zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die elektroporationsbasierte Verabreichung von Plasmid-DNA ermöglicht die In-vivo-Anwendung der Molekularbiologie, ähnlich wie in gentechnisch veränderten Mausmodellen, jedoch mit der Geschwindigkeit, Lokalisierung und Effizienz der viralen Transduktion 8,13,14. Letzteres bringt jedoch Sicherheitsbedenken sowie Immunreaktionen mit sich. Wir haben in unserem Modellierungssystem unter Verwendung der EP-Verabreichung vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Gi Bum Kim für die Immunfluoreszenzfärbung und die Bilder. Wir danken auch Emily Hatanaka, Naomi Kobritz und Paul Linesch für hilfreiche Ratschläge zum Protokoll.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
