Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi
Summary
Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA’nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.
Abstract
Tümör modelleri, yeni ve daha etkili tedavilerin araştırılması açısından beyin tümörlerinin klinik öncesi testleri için kritik öneme sahiptir. İmmünoterapiye büyük ilgi duyulduğundan, beyindeki tümör ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve tedaviye yanıtlarını incelemek için tutarlı, klinik olarak uygun, immün yetmezliği olan bir fare modeline sahip olmak daha da kritiktir. Klinik öncesi modellerin çoğu, yerleşik tümör hücre hatlarının ortotopik transplantasyonunu kullanırken, burada sunulan modelleme sistemi, bölünen nöral öncü hücrelere (NPC’ler ) eklenen DNA yapılarından kademeli ancak etkili bir gelişimde hastaya özgü tümör mutasyonlarının “kişiselleştirilmiş” bir temsiline izin verir. DNA yapıları, sürücü mutasyonlarının tek kopyalı, somatik mutajenezine izin veren çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) yöntemiyle mozaik analizine sahiptir. Doğum ile 3 günlük arasındaki yeni doğan fare yavruları kullanılarak, NPC’ler lateral ventrikülleri kaplayan bu bölünen hücrelerden yararlanılarak hedeflenir. DNA plazmitlerinin (örneğin, MADR türevi, transpozonlar, CRISPR’ye yönelik sgRNA) ventriküllere mikroenjeksiyonunu, başın rostral bölgesini çevreleyen kürekler kullanılarak elektroporasyon takip eder. Elektriksel stimülasyon üzerine DNA, genoma entegre olma potansiyeli ile bölünen hücrelere alınır. Bu yöntemin kullanımı, en yaygın malign beyin tümörü olan glioblastoma dahil olmak üzere hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörlerinin geliştirilmesinde başarıyla gösterilmiştir. Bu makale, genç fare yavrularının uyuşturulması, plazmit karışımının mikroenjeksiyonu ve ardından elektroporasyon dahil olmak üzere bu tekniği kullanarak bir beyin tümörü modeli geliştirmenin farklı adımlarını tartışmakta ve göstermektedir. Bu otokton, bağışıklığı yeterli fare modeli ile araştırmacılar, etkili kanser tedavisini iyileştirme ve inceleme çabalarında klinik öncesi modelleme yaklaşımlarını genişletme yeteneğine sahip olacaklar.
Introduction
Murin beyin tümörü modelleri, beyin tümörü oluşum ve tedavi mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Mevcut modeller tipik olarak, uygun immünoterapi çalışmalarını engelleyen immün yetmezliği olan fareler kullanılarak, sınırlı sayıda sürücü mutasyonuna veya hastadan türetilen ksenogreft modellerine dayalı olarak, yaygın olarak kullanılan tümör hücre hatlarının hızla üretilen deri altı veya ortotopik transplantasyonlarını içerir 1,2,3,4. Ek olarak, bu klinik öncesi sonuçlar yanlış pozitiflere yol açabilir, çünkü bu tür modeller tedaviye yanıt olarak dramatik, çoğu zaman iyileştirici etkiler gösterebilir, ancak bu klinik 2,5,6,7’ye dönüşmez. Hasta mutasyon imzalarını daha fazla yansıtan, genetiği değiştirilmiş klinik öncesi fare modellerini hızlı bir şekilde üretme yeteneğine sahip olmak, klinik öncesi sonuçların geçerliliğini artırmak için zorunludur.
Hem fonksiyon kaybı (LOF) hem de fonksiyon kazancı (GOF) mutasyonlarını indüklemek için DNA plazmitlerinin elektroporasyon (EP) tabanlı iletimi, bu tür modellerin üretilmesine izin verir. Çift rekombinaz aracılı kaset değişimi veya MADR8 ile mozaik analizi adı verilen GOF sürücü mutasyonlarının daha kesin bir temsili için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin (veya genlerin) somatik hücrelerde kontrollü, lokusa özgü bir şekilde ekspresyonuna izin verir8. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gibi diğer moleküler araçlarla kombinasyon halinde, fare beyin tümörü modelleri geliştirmek için farklı hasta mutasyonları birleştirilebilir. Bu yöntem, gliomlar ve ependimomlar8 dahil olmak üzere farklı pediatrik beyin tümörlerinin yanı sıra glioblastoma (GBM) gibi yetişkin beyin tümörü modelleri için kullanılmıştır.
EP tümör modelleme yöntemi bir nakil kadar yaygın olmasa da, aşağıdakiler şimdiye kadar bu modelleme sisteminin kolaylığını ve yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. mTmG fareleri, MADR-plazmid DNA 8,9’un eklenmesi için kullanılır. Bu sistem, donör DNA plazmidinin (yani, ilgilenilen GOF geni) daha sonra eklenmesi için Rosa26 lokusunda bulunan loxP ve Flp rekombinaz hedef (FRT) bölgelerinin rekombinasyonuna izin verir8,9. Aşağıdaki protokol, gayretli bir uygulamadan sonra bu yöntemin basitliğini ve fare beyin tümörü modellerini otokton, tutarlı bir şekilde geliştirme yeteneğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plazmid DNA’nın elektroporasyona dayalı iletimi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kullanılana benzer, ancak viral transdüksiyonun hızı, lokalizasyonu ve verimliliği ile moleküler biyolojinin in vivo kullanımına izin verir 8,13,14. Bununla birlikte, ikincisi ile birlikte, güvenlik endişeleri ve bağışıklık tepkileri gelir. Plazmid DNA’nın EP iletimini kullanan modelleme sistemimizde, cam kıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İmmünofloresan boyama ve görüntüler için Gi Bum Kim’e teşekkür ederiz. Ayrıca protokolle ilgili yararlı tavsiyeleri için Emily Hatanaka, Naomi Kobritz ve Paul Linesch’e teşekkür ederiz.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
