Forskydningsassayprotokol til bestemmelse af enkeltcellematerialeegenskaber
Summary
Denne protokol skitserer kvantificeringen af de mekaniske egenskaber af kræftcellelinjer og ikke-kræftcellelinjer in vitro. Konserverede forskelle i mekanikken i kræftceller og normale celler kan fungere som en biomarkør, der kan have konsekvenser for prognose og diagnose.
Abstract
Uregelmæssig biomekanik er et kendetegn ved kræftbiologi, der er genstand for omfattende undersøgelse. De mekaniske egenskaber af en celle svarer til dem af et materiale. En celles modstand mod stress og belastning, dens afslapningstid og dens elasticitet er alle egenskaber, der kan udledes og sammenlignes med andre typer celler. Kvantificering af de mekaniske egenskaber af kræft (ondartede) versus normale (ikke-ondartede) celler giver forskere mulighed for yderligere at afdække de biofysiske fundamentale elementer i denne sygdom. Mens kræftcellernes mekaniske egenskaber vides konsekvent at afvige fra de mekaniske egenskaber hos normale celler, mangler der en standard eksperimentel procedure til at udlede disse egenskaber fra celler i kultur.
Dette papir skitserer en procedure til kvantificering af de mekaniske egenskaber af enkeltceller in vitro ved hjælp af et væskeforskydningsassay. Princippet bag dette assay indebærer påføring af væskeforskydningsspænding på en enkelt celle og optisk overvågning af den resulterende cellulære deformation over tid. Cellemekaniske egenskaber karakteriseres efterfølgende ved hjælp af digital billedkorrelation (DIC) analyse og tilpasning af en passende viskoelastisk model til de eksperimentelle data genereret fra DIC-analysen. Samlet set sigter den protokol, der er skitseret her, mod at give en mere effektiv og målrettet metode til diagnosticering af kræftformer, der er vanskelige at behandle.
Introduction
Undersøgelse af de biofysiske forskelle mellem kræftceller og ikke-kræftceller giver mulighed for nye diagnostiske og terapeutiske muligheder1. At forstå, hvordan forskelle i biomekanik / mekanobiologi bidrager til tumorprogression og behandlingsresistens, vil afsløre nye veje til målrettet terapi og tidlig diagnose2.
Selv om det er kendt, at kræftcellers mekaniske egenskaber adskiller sig fra normale celler (f.eks. plasmamembranens viskoelasticitet og den nukleare kappe)3,4,5, mangler der robuste og reproducerbare metoder til måling af disse egenskaber i levende celler 6. Forskydningsanalysemetoden bruges til at kvantificere cellernes mekaniske egenskaber ved at udsætte enkeltceller for væskeforskydningsspænding og analysere deres individuelle reaktioner og modstand mod den påførte spænding 3,4,5,7,8,9. Selvom flere metoder og teknikker er blevet brugt til at karakterisere enkeltcellers mekaniske egenskaber, har disse tendens til at påvirke cellematerialeegenskaber ved i) perforering/beskadigelse af cellemembranen på grund af indrykningsdybden, komplekse spidsgeometrier eller substratafstivning forbundet med atomkraftmikroskopi (AFM)10,11, ii) inducering af cellulær fotoskade under optisk fangst 12, 13, eller iii) inducering af komplekse stresstilstande forbundet med mikropipetteaspiration14,15. Disse eksterne virkninger er forbundet med betydelig usikkerhed i nøjagtigheden af celleviskoelasticitetsmålinger 6,16,17.
For at løse disse begrænsninger giver forskydningsanalysemetoden, der er beskrevet her, en meget kontrollerbar og enkel tilgang til at simulere fysiologisk flow i kroppen uden at påvirke cellulære materialeegenskaber i processen. Væskeforskydningsspændinger i dette assay repræsenterer mekaniske belastninger, der opleves af celler i kroppen enten af væsker i tumorinterstitium eller i blodet under cirkulation18,19,20. Endvidere fremmer disse væskespændinger forskellige ondartede adfærd i kræftceller, herunder progression, migration, metastase og celledød 19,21,22,23, som varierer mellem tumorigene og ikke-tumorigene celler. Desuden tillader de ændrede mekaniske egenskaber ved kræftceller (dvs. de er ofte “blødere” end normale celler, der findes i det samme organ) dem at fortsætte i fjendtlige tumormikromiljøer, invadere omgivende normale væv og metastasere til fjerne steder24,25,26. Ved at skabe et pseudobiologisk miljø, hvor celler oplever fysiologiske niveauer af væskeforskydningsstress, opnås en proces, der er fysiologisk relevant og ikke destruktiv for cellen. De cellulære reaktioner på disse anvendte væskeforskydningsspændinger giver os mulighed for at karakterisere cellemekaniske egenskaber.
Dette papir giver en forskydningsanalyseprotokol til omfattende undersøgelse af de mekaniske egenskaber og opførsel af kræftceller og ikke-kræftceller under anvendt forskydningsspænding. Celler reagerer på eksterne kræfter på en elastisk og viskøs måde og kan derfor idealiseres som et viskoelastisk materiale3. Denne teknik er kategoriseret i: (i) cellekultur af dispergerede enkeltceller, (ii) kontrolleret anvendelse af væskeforskydningsspænding, (iii) in situ-billeddannelse og observation af cellulær adfærd (herunder modstandsdygtighed over for stress og deformation), (iv) belastningsanalyse af celler for at bestemme omfanget af deformation og (v) karakterisering af enkeltcellers viskoelastiske egenskaber. Ved at undersøge disse mekaniske egenskaber og adfærd kan kompleks cellulær mekanobiologi destilleres til kvantificerbare data. En protokol, der skitserer denne metode, giver mulighed for katalogisering og sammenligning mellem forskellige maligne og ikke-maligne celletyper. Kvantificering af disse forskelle har potentiale til at etablere diagnostiske og terapeutiske biomarkører.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskydningsanalysemetoden, som omfatter oprettelse af et pseudomekanobiologisk miljø til simulering af cellernes interaktion med det omgivende mekaniske mikromiljø og deres reaktioner på mekaniske belastninger, har produceret et katalog over cellulære mekaniske egenskaber, hvis mønstre viser bevaret fysisk atypi blandt kræftcellelinjer 3,4,5,7,8 . Denne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker tidligere forskere fra Soboyejo-gruppen ved Worcester Polytechnic Institute, der først var banebrydende for denne teknik: Dr. Yifang Cao, Jingjie Hu og Vanessa Uzonwanne. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 til MD). Figurer blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
