Tek Hücreli Malzeme Özelliklerinin Belirlenmesi için Kesme Testi Protokolü
Summary
Bu protokol, kanserli ve kanserli olmayan hücre hatlarının mekanik özelliklerinin in vitro olarak ölçülmesini özetlemektedir. Kanserli ve normal hücrelerin mekaniğindeki korunmuş farklılıklar, prognoz ve tanıda etkileri olabilecek bir biyobelirteç görevi görebilir.
Abstract
Düzensiz biyomekanik, kapsamlı bir çalışmaya tabi tutulan kanser biyolojisinin ayırt edici bir özelliğidir. Bir hücrenin mekanik özellikleri bir malzemeninkine benzer. Bir hücrenin strese ve gerilmeye karşı direnci, gevşeme süresi ve elastikiyeti, türetilebilen ve diğer hücre türleriyle karşılaştırılabilen özelliklerdir. Kanserli (malign) hücrelerin normal (malign olmayan) hücrelere karşı mekanik özelliklerini ölçmek, araştırmacıların bu hastalığın biyofiziksel temellerini daha da ortaya çıkarmalarını sağlar. Kanser hücrelerinin mekanik özelliklerinin normal hücrelerin mekanik özelliklerinden sürekli olarak farklı olduğu bilinmesine rağmen, bu özellikleri kültürdeki hücrelerden çıkarmak için standart bir deneysel prosedür eksiktir.
Bu yazıda, bir sıvı kesme testi kullanılarak in vitro olarak tek hücrelerin mekanik özelliklerini ölçmek için bir prosedür özetlenmektedir. Bu tahlilin arkasındaki prensip, sıvı kesme stresinin tek bir hücreye uygulanmasını ve zaman içinde ortaya çıkan hücresel deformasyonun optik olarak izlenmesini içerir. Hücre mekanik özellikleri daha sonra dijital görüntü korelasyonu (DIC) analizi kullanılarak ve DIC analizinden üretilen deneysel verilere uygun bir viskoelastik model takılarak karakterize edilir. Genel olarak, burada özetlenen protokol, tedavisi zor kanserlerin teşhisi için daha etkili ve hedefli bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.
Introduction
Kanserli ve kanserli olmayan hücreler arasındaki biyofiziksel farklılıkların incelenmesi, yeni tanı ve tedavi fırsatlarına izin verir1. Biyomekanik/mekanobiyolojideki farklılıkların tümör progresyonuna ve tedavi direncine nasıl katkıda bulunduğunun anlaşılması, hedefe yönelik tedavi ve erken tanı için yeni yollar ortaya çıkaracaktır2.
Kanser hücresinin mekanik özelliklerinin normal hücrelerden farklı olduğu bilinmekle birlikte (örneğin, plazma zarının ve nükleer zarfın viskoelastisitesi)3,4,5, canlı hücrelerde bu özellikleri ölçmek için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemler eksiktir6. Kesme testi yöntemi, tek hücreleri sıvı kesme stresine maruz bırakarak ve uygulanan strese karşı bireysel tepkilerini ve dirençlerini analiz ederek hücrelerin mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılır 3,4,5,7,8,9. Tek hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için çeşitli yöntem ve teknikler kullanılmasına rağmen, bunlar i) girinti derinliği, karmaşık uç geometrileri veya atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile ilişkili substrat sertleşmesi nedeniyle hücre zarını delerek / zarar vererek, 10,11, ii) optik yakalama sırasında hücresel fotohasarı indükleyerek hücre materyali özelliklerini etkileme eğilimindedir 12, 13 veya iii) mikropipet aspirasyonu ile ilişkili karmaşık stres durumlarını indüklemek14,15. Bu dış etkiler, hücre viskoelastisite ölçümlerinin doğruluğundaki önemli belirsizliklerle ilişkilidir 6,16,17.
Bu sınırlamaları ele almak için, burada açıklanan kesme testi yöntemi, süreçteki hücresel materyal özelliklerini etkilemeden vücuttaki fizyolojik akışı simüle etmek için oldukça kontrol edilebilir ve basit bir yaklaşım sağlar. Bu tahlildeki sıvı kesme gerilmeleri, vücuttaki hücrelerin tümör interstisyumu içindeki sıvılar tarafından veya dolaşım sırasında kanda yaşadığı mekanik stresleri temsil eder18,19,20. Ayrıca, bu sıvı stresleri, kanser hücrelerinde, progresyon, göç, metastaz ve hücre ölümü 19,21,22,23 dahil olmak üzere, tümörojenik ve tümörojenik olmayan hücreler arasında değişen çeşitli malign davranışları teşvik eder. Dahası, kanser hücrelerinin değişmiş mekanik özellikleri (yani, aynı organda bulunan normal hücrelerden genellikle “daha yumuşaktırlar”), düşmanca tümör mikro ortamlarında devam etmelerine, çevredeki normal dokuları istila etmelerine ve uzak bölgelere metastaz yapmalarına izin verir24,25,26. Hücrelerin fizyolojik seviyelerde sıvı kesme stresi yaşadığı sahte biyolojik bir ortam yaratarak, fizyolojik olarak alakalı ve hücre için yıkıcı olmayan bir süreç elde edilir. Uygulanan bu sıvı kesme gerilmelerine verilen hücresel tepkiler, hücre mekanik özelliklerini karakterize etmemizi sağlar.
Bu yazıda, uygulanan kesme stresi altında kanserli ve kanserli olmayan hücrelerin mekanik özellikleri ve davranışlarının kapsamlı bir şekilde incelenmesi için bir kesme testi protokolü sunulmaktadır. Hücreler dış kuvvetlere elastik ve viskoz bir şekilde tepki verir ve bu nedenle viskoelastik bir malzeme olarak idealize edilebilir3. Bu teknik şu şekilde kategorize edilir: (i) dağınık tek hücrelerin hücre kültürü, (ii) sıvı kesme gerilmesinin kontrollü uygulanması, (iii) in situ görüntüleme ve hücresel davranışın gözlemlenmesi (stres ve deformasyona karşı direnç dahil), (iv) deformasyonun derecesini belirlemek için hücrelerin gerinim analizi ve (v) tek hücrelerin viskoelastik özelliklerinin karakterizasyonu. Bu mekanik özellikleri ve davranışları sorgulayarak, karmaşık hücresel mekanobiyoloji ölçülebilir verilere damıtılabilir. Bu yöntemi özetleyen bir protokol, çeşitli malign ve malign olmayan hücre tiplerinin kataloglanmasına ve karşılaştırılmasına izin verir. Bu farklılıkların ölçülmesi, tanısal ve terapötik biyobelirteçler oluşturma potansiyeline sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücrelerin çevredeki mekanik mikro çevre ile etkileşimini ve mekanik gerilmelere tepkilerini simüle etmek için psödo-mekanobiyolojik bir ortam kurmayı içeren kesme testi yöntemi, desenleri kanserli hücre hatları arasında korunmuş fiziksel atipiye işaret eden bir hücresel mekanik özellikler kataloğu üretmiştir 3,4,5,7,8 . Bu yöntem, hücrel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu tekniğe ilk öncülük eden Worcester Politeknik Enstitüsü’ndeki Soboyejo grubundan önceki araştırmacılara teşekkür ediyor: Dr. Yifang Cao, Jingjie Hu ve Vanessa Uzonwanne. Bu çalışma Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH / NCI K22 CA258410 to MD) tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
