単一セル材料特性を決定するためのせん断アッセイプロトコル
Summary
このプロトコルは、 in vitroでの癌性および非癌性細胞株の機械的特性の定量化の概要を示しています。がん細胞と正常細胞の機構における保存された違いは、予後と診断に影響を与える可能性のあるバイオマーカーとして機能する可能性があります。
Abstract
不規則なバイオメカニクスは、広範な研究の対象となる癌生物学の特徴です。セルの機械的特性は、材料の機械的特性と似ています。ストレスやひずみに対する細胞の耐性、緩和時間、弾力性はすべて、他のタイプの細胞と比較することができる特性です。癌性(悪性)細胞と正常(非悪性)細胞の機械的特性を定量化することで、研究者はこの病気の生物物理学的基礎をさらに明らかにすることができます。がん細胞の機械的性質は、正常細胞の機械的性質とは一貫して異なることが知られているが、培養中の細胞からこれらの性質を推定する標準的な実験手順は不足している。
この論文では、流体せん断アッセイを使用して in vitro で単一細胞の機械的特性を定量化する手順の概要を説明します。このアッセイの背後にある原理は、単一の細胞に流体せん断応力を適用し、結果として生じる細胞の変形を経時的に光学的に監視することです。その後、デジタル画像相関(DIC)解析を使用して細胞の機械的特性を特徴付け、DIC解析から生成された実験データに適切な粘弾性モデルをフィッティングします。全体として、ここで概説するプロトコルは、治療が困難な癌の診断のためのより効果的で標的を絞った方法を提供することを目的としています。
Introduction
がん細胞と非がん細胞の生物物理学的な違いを研究することで、新しい診断および治療の機会が可能になります1。バイオメカニクス/メカノバイオロジーの違いが腫瘍の進行と治療抵抗性にどのように寄与するかを理解することで、標的療法と早期診断の新しい道が明らかになります2。
がん細胞の機械的性質(原形質膜や核膜の粘弾性など)は正常細胞と異なることが知られていますが3,4,5、生細胞でこれらの性質を測定するための堅牢で再現性のある方法は不足しています6。せん断アッセイ法は、単一細胞を流体せん断応力にさらし、加えられた応力に対する個々の応答および抵抗を分析することにより、細胞の機械的特性を定量化するために使用されます3,4,5,7,8,9。単一細胞の機械的特性を特徴付けるためにいくつかの方法および技術が使用されてきたが、これらは、i)原子間力顕微鏡(AFM)10,11に関連するくぼみの深さ、複雑な先端形状、または基板硬化による細胞膜の穿孔/損傷、ii)光学トラップ中に細胞の光損傷を誘発することによって細胞材料特性に影響を与える傾向がある12、図13、又はiii)マイクロピペット吸引に関連する複雑なストレス状態を誘導する14、15。これらの外部効果は、細胞粘弾性測定の精度における重大な不確実性と関連している6、16、17。
これらの制限に対処するために、ここで説明するせん断アッセイ法は、プロセス中の細胞材料特性に影響を与えることなく、体内の生理学的流れをシミュレートするための高度に制御可能で簡単なアプローチを提供します。このアッセイにおける流体せん断応力は、循環中に腫瘍間質内の流体または血液中の流体のいずれかによって体内の細胞が受ける機械的ストレスを表す18、19、20。さらに、これらの流体ストレスは、腫瘍原性細胞と非腫瘍性細胞の間で異なる進行、遊走、転移、および細胞死を含む、癌細胞における様々な悪性挙動を促進する19,21,22,23。さらに、癌細胞の変化した機械的特徴(すなわち、それらはしばしば同じ器官内に見られる正常細胞よりも「柔らかい」)は、それらが敵対的な腫瘍微小環境に存続し、周囲の正常組織に浸潤し、そして遠隔部位に転移することを可能にする24,25,26。細胞が生理学的レベルの流体せん断応力を経験する疑似生物学的環境を作り出すことによって、生理学的に関連し、細胞に破壊されないプロセスが達成される。これらの加えられた流体せん断応力に対する細胞応答により、細胞の機械的特性を特徴付けることができます。
この論文は、せん断応力が加えられた下での癌性および非癌性の細胞の機械的特性と挙動の広範な研究のためのせん断アッセイプロトコルを提供します。細胞は弾性的かつ粘性のある方法で外力に応答するため、粘弾性材料3として理想化することができます。この手法は、(i)分散した単一細胞の細胞培養、(ii)流体せん断応力の制御された適用、(iii)細胞の挙動(ストレスおよび変形に対する抵抗性を含む)の in situ イメージングおよび観察、(iv)変形の程度を決定するための細胞のひずみ解析、および(v)単一細胞の粘弾性特性の特性評価に分類されます。これらの機械的特性と挙動を調べることにより、複雑な細胞メカノバイオロジーを定量化可能なデータに蒸留することができます。この方法を概説するプロトコルは、様々な悪性および非悪性細胞タイプのカタログ化および比較を可能にする。これらの違いを定量化することで、診断および治療バイオマーカーを確立する可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
せん断アッセイ法は、細胞と周囲の機械的微小環境との相互作用および機械的ストレスに対するそれらの応答をシミュレートするための疑似機械生物学的環境の設定を含み、そのパターンが癌性細胞株間の保存された物理的異型を示す細胞機械的特性のカタログを作成しました3,4,5,7,8 <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この技術を最初に開拓したウースター工科大学のソボエジョグループの以前の研究者であるYifang Cao博士、Jingjie Hu博士、Vanessa Uzonwanne博士に感謝します。この研究は、米国国立がん研究所(NIH/NCI K22 CA258410 to M.D.)の支援を受けた。図は BioRender.com で作成されました。
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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