Scherprobenprotokoll zur Bestimmung von Einzelzell-Materialeigenschaften
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zelllinien in vitro. Konservierte Unterschiede in der Mechanik von Krebszellen und normalen Zellen können als Biomarker dienen, der Auswirkungen auf die Prognose und Diagnose haben kann.
Abstract
Unregelmäßige Biomechanik ist ein Kennzeichen der Krebsbiologie und Gegenstand umfangreicher Untersuchungen. Die mechanischen Eigenschaften einer Zelle ähneln denen eines Materials. Die Stress- und Belastungsresistenz einer Zelle, ihre Relaxationszeit und ihre Elastizität sind Eigenschaften, die sich ableiten und mit anderen Zelltypen vergleichen lassen. Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen (bösartigen) im Vergleich zu normalen (nicht-bösartigen) Zellen ermöglicht es den Forschern, die biophysikalischen Grundlagen dieser Krankheit weiter aufzudecken. Während bekannt ist, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen durchweg von den mechanischen Eigenschaften normaler Zellen unterscheiden, fehlt ein experimentelles Standardverfahren, um diese Eigenschaften aus Zellen in Kultur abzuleiten.
In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen in vitro mit Hilfe eines Fluid-Shear-Assays beschrieben. Das Prinzip hinter diesem Assay besteht darin, eine einzelne Zelle durch Flüssigkeitsscherspannung zu belasten und die daraus resultierende Zellverformung im Laufe der Zeit optisch zu überwachen. Die mechanischen Eigenschaften der Zelle werden anschließend mit Hilfe der digitalen Bildkorrelation (DIC) charakterisiert und ein geeignetes viskoelastisches Modell an die aus der DIC-Analyse generierten experimentellen Daten angepasst. Insgesamt zielt das hier skizzierte Protokoll darauf ab, eine effektivere und gezieltere Methode für die Diagnose schwer behandelbarer Krebserkrankungen bereitzustellen.
Introduction
Die Untersuchung der biophysikalischen Unterschiede zwischen krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellen ermöglicht neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten1. Das Verständnis, wie Unterschiede in der Biomechanik/Mechanobiologie zum Fortschreiten von Tumoren und zur Therapieresistenz beitragen, wird neue Wege für eine zielgerichtete Therapie und Frühdiagnose aufzeigen2.
Während bekannt ist, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen von denen normaler Zellen unterscheiden (z. B. Viskoelastizität der Plasmamembran und der Kernhülle)3,4,5, fehlen robuste und reproduzierbare Methoden zur Messung dieser Eigenschaften in lebenden Zellen 6. Die Schermethode wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von Zellen zu quantifizieren, indem einzelne Zellen einer Flüssigkeitsscherbelastung ausgesetzt und ihre individuellen Reaktionen und Beständigkeit gegen die angelegte Belastunganalysiert werden 3,4,5,7,8,9. Obwohl verschiedene Methoden und Techniken verwendet wurden, um die mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen zu charakterisieren, neigen diese dazu, die Eigenschaften des Zellmaterials zu beeinflussen, indem sie i) die Zellmembran aufgrund der Eindringtiefe, komplexer Spitzengeometrien oder Substratversteifungen im Zusammenhang mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) perforieren/beschädigen10,11, ii) zelluläre Photoschäden während des optischen Einfangensinduzieren 12, 13 oder iii) Induktion komplexer Stresszustände, die mit der Mikropipettenaspiration verbunden sind14,15. Diese externen Effekte sind mit erheblichen Unsicherheiten in der Genauigkeit von Zellviskoelastizitätsmessungen verbunden 6,16,17.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, bietet die hier beschriebene Schertestmethode einen hochgradig kontrollierbaren und einfachen Ansatz, um den physiologischen Fluss im Körper zu simulieren, ohne dabei die zellulären Materialeigenschaften zu beeinträchtigen. Die Flüssigkeitsscherspannungen in diesem Assay stellen mechanische Belastungen dar, denen Zellen im Körper entweder durch Flüssigkeiten im Tumorinterstitium oder im Blut während der Zirkulation ausgesetzt sind18,19,20. Darüber hinaus fördern diese Flüssigkeitsbelastungen verschiedene bösartige Verhaltensweisen in Krebszellen, darunter Progression, Migration, Metastasierung und Zelltod 19,21,22,23, die zwischen tumorigenen und nicht-tumorigenen Zellen variieren. Darüber hinaus ermöglichen die veränderten mechanischen Eigenschaften von Krebszellen (d. h. sie sind oft “weicher” als normale Zellen, die sich im selben Organ befinden) es ihnen, in feindlichen Tumormikroumgebungen zu überleben, in umliegendes normales Gewebe einzudringen und an entfernte Stellen Metastasen zu bilden24,25,26. Durch die Schaffung einer pseudobiologischen Umgebung, in der die Zellen physiologischen Niveaus von Flüssigkeitsscherstress ausgesetzt sind, wird ein Prozess erreicht, der physiologisch relevant und nicht destruktiv für die Zelle ist. Die zellulären Reaktionen auf diese aufgebrachten Flüssigkeitsscherspannungen ermöglichen es uns, die mechanischen Eigenschaften der Zelle zu charakterisieren.
Dieser Artikel enthält ein Schertestprotokoll für die umfassende Untersuchung der mechanischen Eigenschaften und des Verhaltens von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellen unter angelegter Scherspannung. Zellen reagieren elastisch und viskos auf äußere Kräfte und können daher als viskoelastisches Material idealisiert werden3. Diese Technik wird kategorisiert in: (i) Zellkultur von dispergierten Einzelzellen, (ii) kontrollierte Anwendung von Flüssigkeitsscherspannung, (iii) In-situ-Bildgebung und Beobachtung des zellulären Verhaltens (einschließlich Beständigkeit gegen Stress und Verformung), (iv) Dehnungsanalyse von Zellen zur Bestimmung des Ausmaßes der Verformung und (v) Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften einzelner Zellen. Durch die Untersuchung dieser mechanischen Eigenschaften und Verhaltensweisen kann die komplexe zelluläre Mechanobiologie zu quantifizierbaren Daten destilliert werden. Ein Protokoll, das diese Methode beschreibt, ermöglicht die Katalogisierung und den Vergleich zwischen verschiedenen malignen und nicht-malignen Zelltypen. Die Quantifizierung dieser Unterschiede hat das Potenzial, diagnostische und therapeutische Biomarker zu etablieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Shear-Assay-Methode, die die Einrichtung einer pseudo-mechanobiologischen Umgebung umfasst, um die Interaktion von Zellen mit der umgebenden mechanischen Mikroumgebung und ihre Reaktionen auf mechanische Belastungen zu simulieren, hat einen Katalog zellulärer mechanischer Eigenschaften hervorgebracht, deren Muster konservierte physikalische Atypien zwischen krebsartigen Zelllinien aufweisen 3,4,5,7,8 <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken früheren Forschern der Soboyejo-Gruppe am Worcester Polytechnic Institute, die diese Technik als erste entwickelt haben: Dr. Yifang Cao, Dr. Jingjie Hu und Dr. Vanessa Uzonwanne. Diese Arbeit wurde vom National Cancer Institute (NIH/NCI K22 CA258410 to M.D.) unterstützt. Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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