Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एक ओरोनासल फिस्टुला चूहों मॉडल की स्थापना

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65578
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Oral Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Head and Neck Oncology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 3State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Eastern Clinic, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 4State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Oral Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

Summary

यह लेख एक ओरोनासल फिस्टुला के साथ एक चूहों के मॉडल की स्थापना के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है। ओरोनासल फिस्टुला को कठोर तालू के मध्य रेखा वाले हिस्से को नुकसान पहुंचाने के लिए गर्म नेत्र संबंधी दाग़ना को नियोजित करके बनाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप मौखिक और नाक गुहाओं के बीच एक उद्घाटन का गठन हुआ था।

Abstract

यह अध्ययन ओरोनासल फिस्टुलस की जांच के लिए एक व्यवहार्य मॉडल विकसित करने के लिए गर्म नेत्र संबंधी दाग़ना का उपयोग करने वाली एक विधि प्रस्तुत करता है। C57BL/6 चूहों का उपयोग ओरोनासल फिस्टुला (ONF) मॉडल स्थापित करने के लिए किया गया था। ओएनएफ बनाने के लिए, चूहों को संवेदनाहारीकृत, स्थिर किया गया था, और उनके कठोर तालू उजागर किए गए थे। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान, नेत्र संबंधी दाग़ना का उपयोग करके कठोर तालू की मध्य रेखा में 2.0 x 1.5 मिमी पूर्ण-मोटाई वाली म्यूकोसल चोट को प्रेरित किया गया था। प्रयोग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए ओएनएफ के आकार को नियंत्रित करना और रक्तस्राव को कम करना महत्वपूर्ण था। ओएनएफ मॉडल की प्रभावशीलता का सत्यापन 7 वें दिन के ऑपरेशन के बाद किया गया था, जिसमें शारीरिक और कार्यात्मक आकलन दोनों शामिल थे। मौखिक गुहा के भीतर नाक सेप्टम की उपस्थिति और मौखिक गुहा में इंजेक्शन पर नथुने से बाँझ पानी के बहिर्वाह ने ओएनएफ मॉडल की सफल स्थापना की पुष्टि की। मॉडल ने एक व्यावहारिक और सफल ओरोनासल फिस्टुला का प्रदर्शन किया, जिसमें कम मृत्यु दर, महत्वपूर्ण वजन परिवर्तन और ओएनएफ आकार में न्यूनतम भिन्नता की विशेषता है। भविष्य के अध्ययन तालू घाव भरने के तंत्र को स्पष्ट करने और ओरोनासल फिस्टुलस के लिए उपन्यास उपचार का पता लगाने के लिए इस पद्धति को अपनाने पर विचार कर सकते हैं।

Introduction

ओरोनासल फिस्टुला (ओएनएफ), मौखिक और नाक गुहाओं के बीच एक असामान्य उद्घाटन, चिकित्सकीय रूप से वायुकोशीय प्रक्रिया से यूवुला तक एक संरचनात्मक क्षेत्र में एक दोष के रूप में प्रकट होता है, जो आमतौर पर फांक तालु की मरम्मतके बाद एक जटिलता के रूप में होता है 1. ओएनएफ अनुभव वाले मरीजों को खाद्य भाटा, आर्टिक्यूलेशन विकार और बिगड़ा हुआ वेलोफरीन्जियल फ़ंक्शन होता है, जो उनके जीवन की गुणवत्ताको महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है 2,3,4. फांक चौड़ाई, वीयू प्रकार और सर्जिकल विधि 5,6,7,8 जैसे कारकों के कारण पोस्ट-ऑपरेटिव ओएनएफ की दर 2.4% से 55% तक होती है। इसके अतिरिक्त, ओएनएफ मरम्मत के बाद पुनरावृत्ति दर अधिक है, 0% से 43%9 तक।

कई उपन्यास उपचारों ने हाल ही में ओएनएफ के क्षेत्र में वादा दिखाया है, जिसमें विभिन्न सामग्रियां, दवाएं और उपन्यास तकनीक 10,11,12,13,14,15,16,17 शामिल हैं। चिकित्सीय प्रभावों का सटीक मूल्यांकन आवश्यक है क्योंकि यह ओएनएफ उपचारों को चुनने और आगे विकसित करने का आधार प्रदान करता है। हालांकि, सर्जरी के अलावा चिकित्सीय प्रभावों के लिए अल्पावधि में एक वैध मूल्यांकन प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि ओएनएफ की विशेषताएं विभिन्न रोगियों में भिन्न होती हैं। इसलिए, इन उपचार विधियों की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए एक ओएनएफ रोग मॉडल स्थापित करना आवश्यक है।

कई दशकों के लिए, शोधकर्ताओं ने चूहों सहित विभिन्न जानवरों की प्रजातियों में oronasal नालव्रण (ONF) मॉडल उत्पन्न किया है18,19, piglets20,21, minipigs22, और कुत्तों23, इन प्रजातियों के पास पर्याप्त कठोर तालू के अधिकारी शल्य चिकित्सा हेरफेर के लिए उपयुक्त. हालांकि, चूहों में एक आनुवंशिक अनुक्रम और पूरे जीनोम मनुष्यों के समान होते हैं, जिससे उन्हें नई दवाओं के शोध औरविकास के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल 24,25,26 मिल जाता है। इसके अलावा, चूहों बैच से बैच तक थोड़ा बदलाव की पेशकश करते हैं, जिससे उन्हें ओएनएफ मॉडल12,13,27 स्थापित करने के लिए अनुकूल विकल्प मिल जाता है।

हालांकि, ओएनएफ बनाने के लिए विस्तृत चरणों का वर्णन नहीं किया गया था, और ओएनएफ आकार की स्थिरता को ध्यान में नहीं रखा गया था। इसके अतिरिक्त, ओएनएफ गठन का सत्यापन मौखिक और नाक गुहाओं के बीच सीधे संचार सुनिश्चित किए बिना, पूरी तरह से अवलोकन28 पर निर्भर करता है। यह अन्य माध्यमों से प्रदर्शित नहीं किया गया था, जैसे कि ओएनएफ के कारण खाने में कठिनाइयों के कारण माउस के शरीर के वजन में कमी। इसके अलावा, घाव के आकार में सामान्य भिन्नता पर विचार नहीं किया गया था, जो घाव भरने को बढ़ावा देने या बाधित करने वाली दवाओं या सामग्रियों पर अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक स्थिर और मान्य ओएनएफ मॉडल स्थापित करने की सख्त आवश्यकता है।

इस अध्ययन का उद्देश्य एक व्यावहारिक ओएनएफ मॉडल विकसित करना था जो उपरोक्त मुद्दों को संबोधित करता है, इस उम्मीद के साथ कि यह प्रोटोकॉल ओएनएफ के लिए तालु घाव भरने और उपन्यास उपचार के तंत्र पर भविष्य के अनुसंधान की नींव के रूप में काम करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और वेस्ट चाइना स्कूल ऑफ स्टोमेटोलॉजी, सिचुआन विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। वयस्क C57BL/6 चूहों (महिला) वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया.

1. सर्जिकल तैयारी

  1. प्रक्रिया के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों को इकट्ठा करें: जर्मिनेटर, नेत्र संबंधी दाग़ना, माइक्रोसर्जिकल कैंची, माइक्रोसर्जिकल चिमटी, सीरिंज, और सुई (26 ग्राम x 0.63 इंच) (चित्रा 1 ए, बी) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: शल्य चिकित्सा प्रक्रिया से पहले, नेत्र संबंधी दाग़ना, माइक्रोसर्जिकल चिमटी, और microsurgical कैंची सहित, 102.9 kPa (1.05 किग्रा/सेमी2) और 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर शल्य चिकित्सा उपकरणों आटोक्लेव.
  2. आवश्यक सर्जिकल आपूर्ति एकत्र करें: सर्जिकल पर्दे, लेटेक्स दस्ताने, बाँझ कपास, बाँझ चादरें, बाँझ धातु पन्नी, शल्य चिकित्सा मंच के रूप में फोम बोर्ड, रबर बैंड (जो एक चिकित्सा लेटेक्स दस्ताने फाड़कर प्राप्त किया जा सकता है), और टेप(चित्रा 1सी)( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: सर्जिकल क्षेत्र के लिए सीरिंज और बाँझ चादरें सहित प्रत्येक माउस के लिए आपूर्ति का एक अलग सेट का उपयोग करें।
  3. अल्कोहल वाइप्स का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र और उपकरण (प्रकाश स्रोत, फोम बोर्ड और तापमान रखरखाव उपकरण, सामग्री की तालिकादेखें) को साफ करें। बाँझ धातु पन्नी के साथ प्रक्रिया के दौरान आवश्यक हो सकने वाले उपकरणों के knobs और हैंडल को कवर करें।
  4. Aseptically व्यक्तिगत उपकरणों को खोलने और ध्यान से शल्य चिकित्सा क्षेत्र में उन्हें स्थिति. जर्मिनेटर को सक्रिय करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और प्रक्रिया के दौरान उपयोग के लिए रोशनी। नेत्र संबंधी दाग़ना को जर्मिनेटर में रखें और इसे 20 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।

2. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. माउस का निर्धारण करें और नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए मौखिक गुहा खोलें।
    1. एक महिला C57BL/6J माउस का चयन करें जिसका वजन 20-25 ग्राम और आयु 8-12 सप्ताह है। किसी भी प्रक्रिया के संचालन से पहले 7 दिनों के लिए माउस हाउस.
    2. Zoletil50 (80 मिलीग्राम/किग्रा) और Xylazine (5 मिलीग्राम/किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज़ करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। माउस की आंख पर नेत्र नेत्र मरहम लगाएं। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कोई टो-पिंच प्रतिक्रिया न हो।
      नोट: माउस प्रक्रिया के लिए तैयार है जब यह स्वतंत्र रूप से चालू करने में असमर्थ है।
    3. बाँझ चादरों के साथ पंक्तिबद्ध फोम बोर्ड के लिए माउस सुरक्षित. एक लापरवाह स्थिति (चित्रा 2 ए) में शल्य चिकित्सा मंच के लिए माउस टाई करने के लिए टेप का प्रयोग करें.
    4. माउस की मौखिक गुहा खोलें। कक्षीय कान विमान के सामने दो सुइयों (26 ग्राम x 0.63 इंच) और इसके पीछे दो और स्थिति बनाएं। सुइयों के चारों ओर एक रबर बैंड रखें और मुंह को खुला रखने के लिए incenders को पार करें। मुंह के कोनों को खोलने के लिए माइक्रोसर्जिकल चिमटी का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कठोर तालू स्पष्ट रूप से उजागर है। बाद के प्रयोगों के दौरान देखने और जलने के क्षेत्र में रुकावट को रोकने के लिए रबर बैंड के नीचे जीभ को ठीक करें।
  2. कठोर तालू (चित्रा 3 ए-एफ) पर ओरोनासल फिस्टुला (ओएनएफ) बनाएं।
    1. नेत्र संबंधी दाग़ना को पुनः प्राप्त करें, जिसे 20 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस तक गरम किया गया है। तालू की मिडलाइन के चौराहे से 1 मिमी दूर दाग़ना टिप रखें और पहले प्रीमोलर की रेखा, मिडलाइन में कठोर तालू के लिए एक पूर्ण मोटाई वाली म्यूकोसल चोट पैदा करें।
      नोट: माउस की जीभ को जलाने से बचें।
    2. कुछ सेकंड के बाद, नेत्र संबंधी दाग़ना को हटा दें जब दाग़ की नोक के चारों ओर म्यूकोसा सफेद हो जाता है।
    3. नेत्र संबंधी दाग़ना को जर्मिनेटर में रखें और इसे 10 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना जारी रखें। किनारों के चारों ओर घाव को बड़ा करने के लिए पिछले चरण को दोहराएं जब तक कि यह 2.0 मिमी की लंबाई और 1.5 मिमी की चौड़ाई तक न पहुंच जाए।
      नोट: प्रत्येक एक्सटेंशन को अंतिम चोट के किनारे का पालन करना चाहिए। चोट की लंबाई और चौड़ाई को मापने के लिए वर्नियर कैलिपर का उपयोग करें। चोट को तालू के 10% को कवर करना चाहिए।
    4. घाव के चारों ओर किसी भी अतिरिक्त विकृत नरम ऊतक को हटाने के लिए माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करें। रक्तस्राव को रोकने और माउस के साँस लेना श्वासावरोध को रोकने के लिए बाँझ कपास का प्रयोग करें। घाव को मापने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह मिडलाइन में 2.0 x 1.5 मिमी मापने वाली एक पूर्ण मोटाई वाली कठोर तालू श्लैश्मिक चोट बनाता है।

3. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल

  1. पश्चात जागृति के समय माउस को मेलॉक्सिकैम का प्रशासन करें, 3 दिनों के लिए 5 मिलीग्राम / किग्रा / डी की खुराक पर, चमड़े के नीचे29.
  2. एक तापमान रखरखाव डिवाइस पर माउस प्लेस जब तक यह पूरी तरह से चेतना पुनः प्राप्त.
    नोट: सुनिश्चित करें कि माउस एक तरह से स्थित है जो सांस लेने की सुविधा देता है। रक्त पूलिंग या फेफड़ों के लोब के पतन को रोकने के लिए चूहों हर 10-15 मिनट घुमाएँ. एक बार माउस गर्म हो गया है, यह अपने पिंजरे में वापसी. चूहों का उपभोग करने के लिए पिंजरे के तल पर बाँझ जेली और विकिरणित फ़ीड प्रदान करें।

4. ओरोनासल नालव्रण निर्माण का सत्यापन

नोट: ओरोनासल फिस्टुला (ओएनएफ) निर्माण की सफलता का मूल्यांकन शल्य प्रक्रिया के बाद 7 वें दिन किया जाता है।

  1. आवश्यक सर्जिकल आपूर्ति तैयार करें: रबर बैंड, टेप, सीरिंज, सर्जिकल पर्दे, लेटेक्स दस्ताने, बाँझ चादरें, बाँझ धातु पन्नी, और फोम बोर्ड।
  2. सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखने के लिए सर्जिकल पर्दे और बाँझ दस्ताने पहनें। शराब के साथ फोम बोर्ड, प्रकाश स्रोत और तापमान रखरखाव उपकरण कीटाणुरहित करें।
  3. Zoletil50 (80 mg/kg) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा सामान्य संज्ञाहरण को प्रेरित करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कोई टो-पिंच प्रतिक्रिया न हो। माउस को स्थिर करने और कठोर तालू को बेनकाब करने के लिए चरण 2.1.3 और 2.1.4 में वर्णित उसी विधि का उपयोग करें।
  4. यह सुनिश्चित करके संरचनात्मक संरचनात्मक सत्यापन करें कि सेप्टम अभी भी घाव स्थल पर दिखाई दे रहा है, जो सफल ओएनएफ निर्माण(चित्रा 4ए,बी)का संकेत देता है।
  5. कार्यात्मक सत्यापन करें: माउस की मौखिक गुहा को बंद करें और एक बाँझ सिरिंज का उपयोग करके अपने मौखिक गुहा में बाँझ पानी इंजेक्षन करें। ओएनएफ के सफल निर्माण की पुष्टि तब होती है जब माउस के नथुने से तरल पदार्थ बहता है।
  6. यह पूरी तरह से चेतना पुनः प्राप्त करता है जब तक तापमान रखरखाव डिवाइस (37 डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें. रक्त पूलिंग या फेफड़ों के लोब के पतन को रोकने के लिए चूहों हर 10-15 मिनट घुमाएँ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

व्यवहार्यता और इस प्रयोगात्मक विधि की स्थिरता का आकलन करने के लिए, एक ही प्रक्रिया दस चूहों पर प्रदर्शन किया गया था, और मृत्यु दर, घाव के आकार में परिवर्तन, शरीर के वजन, और histologic विश्लेषण के बारे में टिप्पणियों किए गए थे. चूहों को 7 वें दिन इच्छामृत्यु दी गई थी।

प्रक्रिया ने कम मृत्यु दर का प्रदर्शन किया। चित्रा 1 ए-सी में दर्शाया गया नेत्र संबंधी दाग़ना और जर्मिनेटर इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रमुख उपकरण थे। ओएनएफ मॉडल प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार बनाया गया था। ऑपरेशन किए गए दस चूहों में से केवल एक ही ऑपरेशन के बाद 7 वें दिन समाप्त हो गया। पूरे प्रयोग में कुल मृत्यु दर लगभग 10% थी।

परिणामों ने वर्णित विधि का उपयोग करके उत्पन्न ओएनएफ के आकार में उल्लेखनीय परिवर्तनशीलता का खुलासा किया। सर्जरी के दिन, सभी चूहों ने लंबाई में 2.0 मिमी और चौड़ाई में 1.5 मिमी मापने वाले अंडाकार आकार के घावों का प्रदर्शन किया। सर्जरी के बाद 7 वें दिन ओएनएफ गठन का आकलन करते समय, ओएनएफ आकार में एक महत्वपूर्ण भिन्नता देखी गई (पी = 0.0085) (चित्रा 5 ए, बी)।

ओएनएफ की उपस्थिति के परिणामस्वरूप भोजन का भाटा और खाने की कठिनाइयों जैसी जटिलताएं हो सकती हैं, जिससे संभावित रूप से वजन में बदलाव हो सकता है। इसलिए, चूहों के शरीर के वजन को भी ध्यान में रखा गया था। चूहों को सर्जरी के दिन (दिन 1) और 7 वें दिन (दिन 7) पर तौला गया जब ओएनएफ गठन की जांच की गई। दिन 1 (पी < 0.001) (चित्रा 6 ए, बी) की तुलना में 7 दिन पर वजन में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी। उनके शरीर के वजन का नुकसान 25.16% था।

हिस्टोलॉजिक विश्लेषण के लिए, घाव और सामान्य ऊतक दोनों को 7 दिन चूहों से काटा गया था। पृथक तालुओं का उपयोग ऊतक विज्ञान सेक्शनिंग के नमूने के रूप में किया गया था। उन्हें ऊतक एम्बेडिंग बक्से में रखा गया था और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड और 10% फॉर्मिक एसिड डीकैल्सीफिकेशन अभिकर्मक का उपयोग करके तय किया गया था। ऊतकों को तब पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था, कोरोनल विमानों के साथ 7 माइक्रोन स्लाइस में विभाजित किया गया था, और हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिया गया था। ओएनएफ के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से हार्ड तालू म्यूकोसा, अनाच्छादित हड्डी और ओएनएफ गठन(चित्रा 7)के नुकसान का पता चला। फेफड़ों का ऊतक विज्ञान किया गया था, और सामान्य और ओएनएफ चूहों के बीच कोई असामान्यता नहीं पाई गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: सर्जिकल उपकरण और आपूर्ति। (ए) नेत्र संबंधी दाग़ना को गर्म करने के लिए उपयोग किया जाने वाला जर्मिनेटर (बी) सर्जिकल उपकरण: नेत्र संबंधी दाग़ना, माइक्रोसर्जिकल कैंची, माइक्रोसर्जिकल चिमटी, सीरिंज और सुई (26 ग्राम x 0.63 इंच)। (सी) सर्जिकल आपूर्ति: सर्जिकल पर्दे, बाँझ दस्ताने, बाँझ कपास, बाँझ चादरें, बाँझ धातु पन्नी, फोम बोर्ड, रबर बैंड और टेप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस के निर्धारण और मौखिक गुहा के उद्घाटन. (ए) माउस के forelimbs यह सुरक्षित करने के लिए टेप किए गए थे. (बी) सिरिंज सुइयों फोम बोर्ड में डाला गया, और एक रबर बैंड सुइयों पर रखा गया था. माउस की मौखिक गुहा एक रबर बैंड और माइक्रोसर्जिकल चिमटी का उपयोग करके खोला गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओरोनासल फिस्टुला का निर्माण । (ए) मौखिक गुहा को उजागर करना। (बी) कठोर तालू के मध्य रेखा भाग पर नेत्र संबंधी दाग़ना की नोक रखकर। (सी) नेत्र संबंधी दाग़ना को हटाना। (डी) माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके घाव के चारों ओर अतिरिक्त नरम ऊतक को हटाना। (ई) बाँझ कपास का उपयोग कर रक्तस्राव रोकना। (च) अंतिम गठित तालु घाव। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सर्जरी के बाद 7 वें दिन तालु घाव की परीक्षा। (ए) दिन 1 पर तालु घाव। (बी) 7 दिन पर तालु घाव। सफेद तीर ओरोनासल फिस्टुला (ओएनएफ) को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: दिन 1 और दिन 7 पर तालु घाव का आकार। (ए) 1 और 7 दिनों पर चूहों के लिए औसत मूल्य। (बी) युग्मित नमूने टी-परीक्षण का उपयोग करके सत्यापित महत्वपूर्ण अंतर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: दिन 1 और दिन 7 पर चूहों का वजन। (ए) दिन 1 और दिन 7 पर चूहों के लिए औसत मूल्य। (बी) युग्मित नमूने टी-परीक्षण का उपयोग करके सत्यापित महत्वपूर्ण अंतर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: हिस्टोलॉजिकल अवलोकन। ओएनएफ के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चलता है कि कठोर तालू म्यूकोसा, अनाकृत हड्डी और ओएनएफ गठन का नुकसान होता है। (ए) 7 दिन पर ओरोनासल फिस्टुला, आवर्धन: 4x। (बी) 7 दिन पर ओरोनासल फिस्टुला, आवर्धन: 10x। (सी) नो-इंजरी कंट्रोल, आवर्धन: 4x। (डी) नो-इंजरी कंट्रोल, आवर्धन: 10x। काला तीर ONF का स्थान दिखाता है। स्केल बार: ए, सी = 200 माइक्रोन; बी, डी = 100 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

शोधकर्ताओं ने ओएनएफ10,11,12,13,14,15,16,17 के इलाज के लिए विभिन्न सामग्रियों, दवाओं और उपन्यास तकनीकों का पता लगाया है। सर्जिकल प्रक्रियाओं में प्रगति के साथ, ओएनएफ की घटना और पुनरावृत्ति कम हो गई है। हालांकि, रोग की अनूठी विशेषताओं के कारण, क्लिनिक में ओएनएफ रोगियों की संख्या सीमित है, संभावित उपचारों का अध्ययन करने के लिए एक मानकीकृत मॉडल की आवश्यकता है। जबकि ओएनएफ मॉडल बनाने के लिए कई तरीकों का वर्णन 18,19,20,21,22,23 किया गया है, वे अक्सर संक्षिप्त थे और प्रयोगात्मक विधि की विस्तृत चर्चा का अभाव था। ओएनएफ के गठन को सूक्ष्म और ऊतकीय अध्ययनों के माध्यम से सत्यापित किया गया है जो हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं का वर्णन करते हैं12,13,27. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अनुसंधान की सुविधा के लिए ONF का एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माउस मॉडल स्थापित करना है।

एक समान ओएनएफ निर्माण हासिल करना एक चुनौती थी। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, चूहों के तालुओं को समान रूप से नुकसान पहुंचाना महत्वपूर्ण था। ओएनएफ के व्यास को नियंत्रित करना, घाव भरने को कम करना और रक्तस्राव को प्रभावी ढंग से रोकना ओएनएफ बनाने में महत्वपूर्ण कदम थे। नेत्र संबंधी दाग़ना का उपयोग करने के बाद घाव के चारों ओर अतिरिक्त नरम ऊतक को हटाने के लिए माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग किया गया था, जिससे उपचार चरण के दौरान घाव के व्यास में परिवर्तन को कम किया जा सके। हालांकि, अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग महत्वपूर्ण खून बह रहा है और यहां तक कि चूहों की मौत का खतरा उठाया, अन्य प्रयोगों 12,13,27 में मनाया उच्च मृत्यु दर के लिए योगदान. इस प्रोटोकॉल में, microsurgical कैंची और एक hemostatic नेत्र cautery के संयोजन denature और अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए नियोजित किया गया था, जबकि बाँझ कपास खून बह रहा को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस विधि ने रक्तस्राव को काफी कम कर दिया या यहां तक कि गर्म नेत्र संबंधी दाग़ा के cauterizing प्रभाव के कारण पूर्ण हेमोस्टेसिस प्राप्त किया।

चूहों में ओएनएफ मॉडल बनाने के लिए एक वैकल्पिक विधि की सूचना दी गई है, जिसमें बायोप्सी पंच13,27 का उपयोग शामिल है। हालांकि इस पद्धति ने पंच के लगातार आकार के कारण घाव के व्यास पर बेहतर नियंत्रण प्रदान किया, लेकिन इसकी उच्च विफलता दर थी और आवश्यक बल के प्रबंधन में चुनौतियों का सामना करना पड़ा, जिससे संभवतः चूहों की मृत्यु हो गई। इस पद्धति के साथ ओएनएफ निर्माण की गहराई और ताकत को नियंत्रित करना मुश्किल था, और यह निर्धारित करना कि नाक सेप्टम तक पहुंच गया था या नहीं, चुनौतीपूर्ण था। इसके अतिरिक्त, रक्तस्राव को नियंत्रित करना समस्याग्रस्त था, और प्रयोग के दौरान गंभीर रक्तस्राव के कारण चूहों को घुटन का खतरा था।

हालांकि, इस प्रयोगात्मक विधि की सीमाएं हैं। सबसे पहले, घाव के आकार को एक निश्चित व्यास आकार के साथ बायोप्सी पंच की तुलना में प्रत्येक माउस में एक ही फिस्टुला आकार द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। और प्रत्येक फिस्टुला के आकार को अधिकतम करने के लिए मापने वाले उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए। तालु घाव का आकार प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि घाव की देरी से उपचार ओएनएफ गठन के लिए केंद्रीय है। इसलिए, तालु घाव के लिए एक उपयुक्त आकार निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। घाव बहुत छोटा है, तो यह जल्दी से ठीक हो सकता है, बाद के प्रयोगों के लिए समय की आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकता। इसके विपरीत, यदि यह बहुत बड़ा है, तो सर्जरी के दौरान अत्यधिक रक्त की हानि से चूहे मर सकते हैं या सर्जरी के बाद खाने में कठिनाई का अनुभव कर सकते हैं, जिससे भुखमरी हो सकती है। इसलिए, तालु के घाव के इष्टतम आकार की खोज करना आवश्यक है। बहरहाल, वर्तमान प्रयोग में इस्तेमाल आकार (2.0 मिमी x 1.5 मिमी) उपयुक्त समझा गया था. इस प्रोटोकॉल में, हम केवल महिला चूहों का उपयोग करते हैं, लेकिन या तो महिला या पुरुष चूहों को अध्ययन के डिजाइन के अनुसार चुना जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को अनुसंधान और विकास कार्यक्रम, वेस्ट चाइना हॉस्पिटल ऑफ स्टोमेटोलॉजी, सिचुआन विश्वविद्यालय (RD-02-202107), सिचुआन प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (2022NSFSC0743), और सिचुआन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (TB2022005) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Germinator Electron Microscopy Sciences  66118-20 Heating and disinfection equipment
Latex gloves Allmed or similar
Lights Olympus A1813
Meloxicam MedChemExpress HY-B0261 crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers) Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. M-Y-0087 Surgical instrument
Ophthalmologic cautery Suqian Wenchong Medical Equipment Co. 1.00234E+13 Surgical instrument
Sterile cotton, Yancheng Begu Technology Co. or similar
Sterile metal foil Biosharp or similar
Sterile sheets 3M XH003801129 or similar
Surgical drapes Yancheng Begu Technology Co. or similar
Syringes Yancheng Begu Technology Co. S-015301 or similar
Tape Bkmamlab or similar
Temperature maintenance device Harvard Apparatus  LE-13-2104
Zoletil50 Virbac 80 mg/kg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alonso, V., et al. Three-layered repair with a collagen membrane and a mucosal rotational flap reinforced with fibrine for palatal fistula closure in children. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 127, 109679 (2019).
  2. Garg, R., Shah, S., Uppal, S., Mittal, R. K. A statistical analysis of incidence, etiology, and management of palatal fistula. National Journal of Maxillofacial Surgery. 10 (1), 43-46 (2019).
  3. Mahajan, R. K., Kaur, A., Singh, S. M., Kumar, P. A retrospective analysis of incidence and management of palatal fistula. Indian Journal of Plastic Surgery. 51 (3), 298-305 (2018).
  4. Huang, H., et al. Validation of the Chinese Velopharyngeal Insufficiency Effects on Life Outcomes Instrument. Laryngoscope. 129 (11), E395-E401 (2019).
  5. Sakran, K. A., et al. Evaluation of Postoperative Outcomes in Two Cleft Palate Repair Techniques without Relaxing Incisions. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2023).
  6. Sakran, K. A., et al. Evaluation of late cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. Journal of Stomatology, Oral and Maxillofacial Surgery. 124 (4), 101403 (2023).
  7. Sakran, K. A., et al. The Sommerlad-Furlow modified palatoplasty technique: postoperative complications and implicating factors. Laryngoscope. 133 (4), 822-829 (2023).
  8. Sakran, K. A., et al. Early cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. , (2022).
  9. Chen, J., Yang, R., Shi, B., Xu, Y., Huang, H. Obturator manufacturing for oronasal fistula after cleft palate repair: a review from handicraft to the application of digital techniques. Journal of Functional Biomaterials. 13 (4), 251 (2022).
  10. Yussif, N., Wagih, R., Selim, K. Propylene mesh versus acrylic resin stent for palatal wound protection following free gingival graft harvesting: a short-term pilot randomized clinical trial. BMC Oral Health. 21 (1), 208 (2021).
  11. Miron, R. J., et al. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (1), 83-99 (2017).
  12. Ballestas, S. A., et al. Improving hard palate wound healing using immune modulatory autotherapies. Acta Biomaterialia. 91, 209-219 (2019).
  13. Ferreira, C. L., et al. Electrical stimulation enhances early palatal wound healing in mice. Archives of Oral Biology. 122, 105028 (2021).
  14. Lindley, L. E., Stojadinovic, O., Pastar, I., Tomic-Canic, M. Biology and Biomarkers for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 18s-28s (2016).
  15. Xu, Y., et al. Rapid Additive Manufacturing of a Superlight Obturator for Large Oronasal Fistula in Pediatric Patient. Laryngoscope. 133 (6), 1507-1512 (2022).
  16. Leenstra, T. S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. The healing process of palatal tissues after palatal surgery with and without implantation of membranes: an experimental study in dogs. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 9 (5), 249-255 (1998).
  17. In de Braekt, M. M., van Alphen, F. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. Wound healing and wound contraction after palatal surgery and implantation of poly-(L-lactic) acid membranes in beagle dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 50 (4), 359-365 (1992).
  18. Suragimath, G., Krishnaprasad, K. R., Moogla, S., Sridhara, S. U., Raju, S. Effect of carbonated drink on excisional palatal wound healing: A study on Wistar rats. Indian Journal of Dental Research. 21 (3), 330-333 (2010).
  19. Zhu, T., Park, H. C., Son, K. M., Yang, H. -C. Effects of dimethyloxalylglycine on wound healing of palatal mucosa in a rat model. BMC Oral Health. 15 (1), 60 (2015).
  20. Kirschner, R. E., et al. Repair of oronasal fistulae with acellular dermal matrices. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 1431-1440 (2006).
  21. Rohleder, N. H., et al. Repair of oronasal fistulae by interposition of multilayered amniotic membrane allograft. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 172-181 (2013).
  22. Kesting, M. R., et al. Repair of oronasal fistulas with human amniotic membrane in minipigs. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 131-135 (2010).
  23. Ayvazyan, A., et al. Collagen-gelatin scaffold impregnated with bFGF accelerates palatal wound healing of palatal mucosa in dogs. Journal of Surgical Research. 171 (2), e247-e257 (2011).
  24. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  25. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
  26. Shan, L., Flavell, R. A., Herndler-Brandstetter, D. Development of humanized mouse models for studying human NK cells in health and disease. Methods in Molecular Biology. 2463, 53-66 (2022).
  27. Keswani, S. G., et al. Role of salivary vascular endothelial growth factor (VEGF) in palatal mucosal wound healing. Wound Repair and Regeneration. 21 (4), 554-562 (2013).
  28. Amanso, A. M., et al. Local delivery of FTY720 induces neutrophil activation through chemokine signaling in an oronasal fistula model. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (2), 160-174 (2021).
  29. Antiorio, A. T. F. B., et al. Administration of meloxicam to improve the welfare of mice in research: a systematic review (2000 - 2020). Veterinary Research Communications. 46 (1), 1-8 (2022).

Tags

ओरोनासल नालव्रण चूहों का मॉडल गर्म नेत्र संबंधी दाग़ना कठोर तालु श्लैष्मिक चोट सर्जिकल प्रक्रिया शारीरिक मूल्यांकन कार्यात्मक मूल्यांकन नाक सेप्टम बाँझ जल बहिर्वाह ओएनएफ आकार भिन्नता तालू घाव भरने उपन्यास उपचार
एक ओरोनासल फिस्टुला चूहों मॉडल की स्थापना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., Yin, J., Zhang, S.,… More

Chen, J., Yin, J., Zhang, S., Zhuang, S., Yang, R., Xu, Y., Zheng, Q., Shi, B., Huang, H. Establishment of an Oronasal Fistula Mice Model. J. Vis. Exp. (199), e65578, doi:10.3791/65578 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter