Summary
我们开发了一种方法来评估基因工程小鼠的神经系统肿瘤是否准确地概括了人类对应物的病理学。在这里,我们将这些组织学技术、定义的病理学标准和培养方法应用于 P 0-GGFβ3 小鼠模型中出现的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤。
Abstract
常染色体显性遗传肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 (NF1) 患者通常会发展为丛状神经纤维瘤 (PN),随后转化为高度侵袭性恶性周围神经鞘瘤 (MPNST)。基因工程小鼠 (GEM) 模型的可用性将有助于了解 PN 转化为 MPNST 的过程,这些模型可以准确复制在 NF1 患者中看到的 PN-MPNST 进展。不幸的是,具有 Nf1 消融的 GEM 模型并不能完全概括这一过程。这导致我们开发了 P 0-GGFβ3 小鼠,这是一种 GEM 模型,其中雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1 (NRG1) 在雪旺细胞中的过表达导致 PN 的发展,这些 PN 会发展为高频的 MPNST。然而,为了确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤发生和肿瘤进展是否准确地模拟了 NF1 患者所观察到的过程,我们必须首先证明 P0-GGFβ3 周围神经鞘瘤的病理学概括了其人类对应物的病理学。
在这里,我们描述了使用 P 0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3 在 GEM 模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专用方法;以Trp53+/-小鼠为例。我们描述了用于诊断 PN 和 MPNST 的组织学、免疫组化和组织化学方法,如何将这些肿瘤与模仿其病理学的其他肿瘤类型区分开来,以及如何对这些肿瘤进行分级。我们讨论了从 GEM MPNST 建立早期传代培养物,如何使用免疫细胞化学表征这些培养物,以及如何通过建立同种异体移植物来验证它们的致瘤性。总的来说,这些技术表征了GEM模型中出现的PN和MPNST的病理学,并将这些小鼠肿瘤的病理学与人类肿瘤进行了批判性比较。
Introduction
在过去的三十年中,许多实验室试图通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组或过表达在人类癌症中过度表达的基因产物来创建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠 (GEM) 模型可用于多种目的,例如确定新引入的基因组修饰启动肿瘤发生,识别导致肿瘤进展的其他随后发生的遗传或表观遗传变化,以及定义驱动肿瘤启动和进展的关键信号通路。与依赖于使用免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同,GEM癌症模型具有功能齐全的免疫系统,因此可以更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而,当将 GEM 癌症模型用于此类目的时,研究人员必须确认对 GEM 肿瘤的观察与人类对应物相关。该验证应包括对 GEM 肿瘤病理学的彻底评估,并确定 GEM 肿瘤的病理特征是否概括了相应人类肿瘤类型的病理学。
肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 (NF1) 是影响人类神经系统的最常见的遗传疾病,每 3,000-3,500 名活产婴儿中约有 1 名发生 1,2,3。患有 NF1 的个体在其皮肤(真皮神经纤维瘤)以及大神经和神经丛(丛状神经纤维瘤)中出现多个良性周围神经鞘瘤,称为神经纤维瘤。虽然真皮神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤都会通过产生身体、行为和/或社会障碍而恶化患者的生活质量,但丛状神经纤维瘤 (PN) 尤其危险 4,5。这是因为 PN 经常转化为恶性周围神经鞘瘤 (MPNST),这是一种侵袭性梭形细胞肿瘤,存活率极低 1,2。在很大程度上,这种低生存率是因为目前用于治疗MPNST的放疗和化疗方案无效。然而,开发新的、更有效的疗法一直具有挑战性。这是因为,尽管 MPNST 在 NF1 患者中很常见,但它们仍然是罕见的肿瘤。因此,很难获得大量的人类肿瘤进行研究;招募足够多的 MPNST 患者进行临床试验也具有挑战性。为了克服这些局限性,已经生成了几种 GEM 模型,目的是进一步了解驱动神经纤维瘤发病机制和 PN-MPNST 进展的异常,并促进候选治疗药物的临床前试验。
NF1 患者在 NF1 基因的一个拷贝中具有失活突变。当剩余功能性 NF1 基因的失活突变发生在雪旺细胞谱系的细胞中时,就会触发神经纤维瘤的发病机制。然而,令人惊讶的是,当小鼠产生生殖系失活 Nf1 突变时,它们并没有发展为神经纤维瘤 6,7。随后的证明是,在所有其他细胞类型中,具有 Nf1 无效雪旺细胞和 Nf1 单倍体功能不全的小鼠 (Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠)开发的丛状神经纤维瘤表明,神经纤维瘤发病机制需要减少其他细胞类型中 Nf1 基因的剂量8。即便如此,Krox20-Cre 中的丛状神经纤维瘤;Nf1flox/-小鼠没有发展成为MPNST,因此仅部分模仿了人类对应物的生物学。当 Nf1 突变与其他肿瘤抑制基因(如 Trp539 或 Cdkn2a10)的突变结合时,确实会发生 MPNST 发病机制,但这些 GEM 模型中的 MPNST 是从头或从生物潜力不确定的非典型神经纤维瘤 (ANNUBPs) 11,12 发展而来的,而不是来自先前存在的良性丛状神经纤维瘤(见13,14对这些模型以及其他模型的出色评论,这些模型在基因(如 Suz12 和 Pten15)中引入了额外的 MPNST 相关功能丧失突变)。
这些小鼠模型对于确定 NF1、TP53 和 CDKN2A 等基因在 NF1 相关周围神经系统肿瘤发病机制中的作用以及测试候选治疗药物的临床前试验非常宝贵。然而,我们对丛状神经纤维瘤发展为具有不确定生物学潜力的非典型神经纤维瘤性肿瘤 (ANNUBPs16) 然后发展为 MPNST 的过程仍然不完全了解。最近在理解这一过程方面取得了一些进展,最近的报告称,Nf1 和 Arf 缺失的小鼠会发展出 ANNUBP,这些 ANNUBP 会发展成为 MPNSTs11。然而,基于 Nf1 突变的小鼠模型完全概括了人类中观察到的丛状神经纤维瘤-MPNST 进展过程。此外,目前尚不清楚是否存在多种不同的途径导致MPNST的发展。鉴于此,上述 GEM 可能仅模拟导致神经纤维瘤-MPNST 进展和 MPNST 发病机制的几种不同途径的子集。MPNST也是零星发生的,一些零星的MPNST显然没有NF1突变17,18,这一事实强调了这一点。
尽管 Magollon-Lorenz 等人最近提出的建议对后一点提出了挑战,即至少一些缺乏 NF1 突变的散发性 MPNST 是黑色素瘤或不同类型的肉瘤19,但我们最近报道了一种散发的 MPNST 和一种源自该肿瘤的细胞系(2XSB 细胞)是 NF1 野生型20.在表征亲本肿瘤和 2XSB 细胞系的过程中,我们系统地排除了其他诊断可能性,包括黑色素瘤和在散发性恶性周围神经鞘瘤鉴别诊断中常规考虑的多种其他肉瘤类型20。此外,我们注意到 Magollon-Lorenz 等人承认,他们在他们研究的三种散发性 MPNST 细胞系中的发现不能推广到表明所有被鉴定为散发性 MPNST 的肿瘤都不是 MPNST。
为了构建神经纤维瘤和 MPNST 发病机制不一定依赖于特定肿瘤抑制基因突变的 GEM 模型,我们生成了转基因小鼠,其中有效的雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1 (NRG1) 的过表达由雪旺细胞特异性髓鞘蛋白零 (P0) 启动子 (P 0-GGFβ3 小鼠) 驱动21.我们之前已经证明,人神经纤维瘤、MPNST 和 MPNST 细胞系表达几种 NRG1 亚型以及介导 NRG1 信号传导的 erbB 受体酪氨酸激酶(erbB2、erbB3 和 erbB4),并且这些 erbB 受体被组成型激活22。我们还证明,erbB 激酶的药理学抑制剂可有效抑制 MPNST 增殖22、存活23 和迁移24。与我们在人类中的观察结果一致,P 0-GGFβ3 小鼠发展为丛状神经纤维瘤25,其发展为高频率的 MPNST 21,25。我们已经表明,P 0-GGFβ3 MPNST 与人类对应物一样,通常会发生 Trp53 和 Cdkn2a 的突变,以及许多其他可能导致肿瘤发生的基因组异常25。在 P 0-GGFβ3 小鼠中产生的 MPNST 没有失活的 Nf1 突变。然而,使用遗传互补,我们发现 NRG1 主要通过由 Nf1 缺失改变的相同信号级联促进 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤发生26;这一结论是基于我们的发现,即在存在 Trp53 单倍体功能不全的情况下,用 NRG1 过表达代替 Nf1 缺失 (P 0-GGFβ3;Trp53+/-小鼠)产生MPNST从头发育的动物,如顺式Nf1+/-所示;Trp53+/- 小鼠27.
为了获得这一和其他信息,证明 P 0-GGFβ3 小鼠准确地模拟了 NF1 患者中观察到的神经纤维瘤发病机制和神经纤维瘤-MPNST 进展的过程,我们开发了专门的方法来处理来自这些动物的组织,准确诊断它们的肿瘤,对这些小鼠中产生的 MPNST 进行分级,建立和表征早期传代 P0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 培养并批判性地比较 P 0-GGFβ3 PN 和 MPNST 以及 P0-GGFβ3 的病理学;Trp53+/- MPNSTs与人类对应物的MPNST。其中许多方法可以推广到神经系统肿瘤的其他GEM模型。此外,其中一些方法更广泛地适用于在其他器官部位出现肿瘤的 GEM 模型。因此,我们在这里对这些方法进行了详细描述。
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Protocol
此处描述的程序已获得南卡罗来纳医科大学 IACUC 的批准,并由经过适当培训的人员根据 NIH 实验动物护理和使用指南和 MUSC 的机构动物护理指南执行。
1. 确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤外显率和存活率,并鉴定这些动物的肿瘤以进一步表征
- 生成将评估肿瘤发生的小鼠队列。所需的小鼠数量取决于肿瘤表型的外显率。为了弥补这些损失,请从比所需的最终动物数量高 10-15% 的队列开始。
注意:我们在 50 只小鼠的初始队列中凭经验确定了 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤外显率(其中 6 只因与肿瘤无关的原因(例如,战斗)而丢失)25。 - 每周评估动物的健康状况三次,并记录每次检查的身体状况评分,包括体重和行为变化。使用二氧化碳安乐死和宫颈脱位终止荷瘤或垂死的小鼠(见下文注释)。以天为单位记录死亡年龄。如果肿瘤在外部可见,请记录肿瘤尺寸(长度、宽度和高度)。
注意:至关重要的是,不允许动物超过IACUC批准的最大允许肿瘤大小和/或人道终点。 - 使用死亡年龄,建立 Kaplan-Meier 生存曲线以确定平均死亡年龄和生存范围。
注:P 0-GGFβ3小鼠的平均死亡年龄为261.5天,范围为74-533天;我们队列中 91% 患有多发性神经纤维瘤,71% 患有 MPNST21。 - 确定是否存在肉眼可见的肿瘤,如果存在,则在无菌条件下解剖它们以确定肿瘤是否与周围神经相关,然后切除肿瘤。在 P 0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3 中;Trp53+/-小鼠,周围神经鞘瘤最常见于三叉神经和坐骨神经。即使没有看到与这些神经相关的肉眼可见的肿瘤,也要如下所述固定并嵌入这些神经,以便检查它们是否存在微肿瘤。微肿瘤通常发生在与这些神经相关的神经节内。
- 将肉眼可见的肿瘤切成三块(图1A)。将第 1 部分用于组织学(石蜡切片、免疫组化和组织化学)。使用第 2 部分建立早期传代培养物。快速冷冻片段 3(使用液氮)用于未来可能的实验(例如,免疫印迹、RNA 和 DNA 分离)。
- 将4%多聚甲醛中的第1块固定在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,在4 °C下过夜,通过在4°C下浸入4%多聚甲醛中过夜来固定动物身体的其余部分。
2. 石蜡包埋肉眼可见的肿瘤,制备苏木精和伊红染色切片,用于初步诊断评估
- 石蜡包埋肉眼可见的肿瘤
- 将肿瘤片1在4%多聚甲醛中固定过夜后,将组织置于体积至少比组织体积大10倍的PBS中冲洗15分钟;使用相同的体积进行所有后续冲洗。再重复两次 15 分钟的 PBS 冲洗,每次冲洗使用新鲜体积的 PBS。
- 将肿瘤片1转移至70%乙醇。将组织在4°C下保持在70%乙醇中24小时。 如果需要,在这些条件下长期储存组织。
注意:步骤 2.1.1 至 2.1.7 是为无法使用商用组织处理机器的研究人员提供的。如果研究者确实可以使用组织处理器,则将按照编程的仪器协议通过分级乙醇和二甲苯处理组织。 - 在室温下将肿瘤片1至80%乙醇转移30分钟。在新鲜体积的80%乙醇中重复孵育30分钟。
- 在室温下将肿瘤片1至95%乙醇转移75分钟。再重复孵育两次,每次在新鲜体积的95%乙醇中再孵育75分钟。
- 将肿瘤片1转移到100%乙醇中,并在室温下孵育60分钟。重复60分钟的孵育两次,每次使用新鲜体积的100%乙醇。
- 将肿瘤片1转移到d-柠檬烯基溶剂中,并在室温下孵育30-60分钟。将肿瘤片1转移到新鲜体积的d-柠檬烯基溶剂中,并在室温下再孵育30-60分钟。
- 将肿瘤片1转移到1:1石蜡/ d-柠檬烯基溶剂中,在60 °C下1小时。 弃去1:1石蜡/ d-柠檬烯基溶剂,将肿瘤片1转移到60 °C石蜡中,并在60 °C下孵育20分钟。 再次在60 °C石蜡的新鲜体积中重复孵育20分钟。将肿瘤片1在石蜡中在60 °C下孵育过夜。
- 将石蜡基层倒入钢制组织学模具中,使其凝固。将肿瘤片1转移到基石蜡表面,定位后立即用60 °C石蜡覆盖组织,并将组织盒放在熔融石蜡的顶部并与熔融石蜡接触。将模具转移到嵌入站的冷侧,使其凝固10-15分钟。
- 从模具中取出带有附着的组织盒的石蜡块。在切片过程中,使用随附的组织盒将块夹入切片机中。
注意:石蜡块现在可以在室温下无限期储存。
- 准备苏木精和伊红染色的明显可见肿瘤切片。
- 使用切片机切割肿瘤组织的4-5μm切片,并将它们安装在带正电荷的载玻片上。
- 为了进行苏木精和伊红(H&E)染色,通过在室温下将载玻片在d-柠檬烯基溶剂中孵育10分钟来脱蜡组织切片。在新鲜体积的d-柠檬烯基溶剂中重复孵育10分钟。
- 将载玻片转移到100%乙醇中,并在室温下孵育5分钟。将载玻片转移到新鲜体积的100%乙醇中,并在室温下再孵育5分钟。
- 将载玻片转移到95%乙醇中,并在室温下孵育5分钟。将载玻片转移到新鲜体积的95%乙醇中,并在室温下再孵育5分钟。
- 将载玻片转移到70%乙醇中,并在室温下孵育5分钟。然后,转移到50%乙醇中,并在室温下孵育5分钟。
- 将载玻片转移到蒸馏水中,并在室温下孵育5分钟。
- 在室温下将载玻片浸入苏木精中5分钟,对载玻片进行染色。用自来水冲洗 1-2 分钟。通过在0.5%盐酸和70%乙醇中浸泡载玻片2-5倍来区分。在自来水浴中冲洗1-2分钟。将载玻片置于含有0.5%乙酸的95%乙醇中10秒。
- 在室温下用曙红-Y染色载玻片30秒,然后将载玻片转移到100%乙醇中5分钟。将样品在d-柠檬烯基溶剂中清除5分钟。
- 使用二甲苯基封固剂安装盖玻片,同时载玻片仍被 d-柠檬烯基溶剂弄湿。让安装介质凝固过夜。
注意: 请勿 使用水性安装介质。
- 准备没有明显可见肿瘤的组织,以识别丛状神经纤维瘤和微型 MPNST。将组织包埋在石蜡中,制备组织学切片,并用苏木精和伊红对这些切片进行染色。
- 取出内脏器官并将每个器官的代表性部分嵌入石蜡中,以制备H&E染色切片,以检查肿瘤的微观证据(图1B)。去除头部、前肢、后肢和尾巴(图1C)。为了 原位 检查脊髓和神经根是否有神经根肿瘤的证据,通过在4 °C下浸入0.3M EDTA / 4%多聚甲醛(pH 8.0)中48-72小时,使脊柱和相关肋骨和软组织脱钙;然后,用 1x PBS 冲洗样品。在脱钙结束时,通过尝试用针刺穿脊柱来确保脱钙完成。如果针头很容易穿透骨骼而不嘎吱作响,则脱钙成功。
- 将脱钙的脊柱和相关结构切成适合组织盒的块。如步骤2.1.2-2.1.7所述,先用分级乙醇脱水,然后用d-柠檬烯基溶剂脱水。嵌入石蜡并制备4-5μm切片,如步骤2.1.7-2.2.1所述。按照步骤 2.2.2-2.2.9 中的说明进行 H&E 染色;让安装介质凝固过夜。
3. 识别潜在的丛状神经纤维瘤并进行特殊染色以确认诊断
注意:我们强烈建议在评估 H&E 和 GEM 肿瘤切片的特殊染色时包括经验丰富的人类或兽医病理学家。
- 使用明场显微镜检查如上所述制备的 H&E 染色载玻片,以识别潜在的周围神经鞘肿瘤。由于神经纤维瘤和 MPNST 发生在周围神经内,因此确定微观肿瘤是否与周围神经相关非常重要。识别具有潜在周围神经鞘瘤的阻滞,以便进行免疫染色和其他特殊染色以确认或反驳诊断。
- 根据 H&E 染色切片明场检查期间观察到的组织学特征,将潜在的 PN 与 MPNST/其他高级别肿瘤区分开来。人类 PN 是轻度细胞增生肿瘤,主要由具有细长、通常呈波浪形细胞核的细胞组成。在许多区域,细胞松散堆积,可能被粘液样细胞外物质分离;P 0-GGFβ3小鼠中的PN具有相似的外观。有丝分裂通常不存在;如果是,并且肿瘤是中度至高度细胞增生,则肿瘤是 MPNST 或其他类型的高级别肿瘤(见下文)。
- PN由肿瘤性雪旺细胞和其他非肿瘤性细胞类型(如肥大细胞)的混合物组成。为了确认 PN 的身份,对 H&E 检查中鉴定的含有潜在 PN 的块切片进行雪旺细胞标志物 S100β 和 Sox10 以及肥大细胞标志物 CD117 (c-Kit) 的免疫染色(参见第 3.4 节了解替代肥大细胞标志物染色选项)。进行 Ki67 免疫染色以确认低增殖率。
注: 表 1 列出了用于常规识别 GEM 丛状神经纤维瘤(S100β、Sox10、CD117、Ki67)、MPNST 诊断以及完整评估神经纤维瘤中存在的其他细胞类型的抗原标志物;我们仅在首次描述新的GEM模型时才对后一种抗原进行染色。有关推荐条件,请参阅抗体制造商的数据表。注意抗体制造商的说明书是否建议抗原修复;并非所有抗原都需要可检索才能检测到。- 从选定的石蜡块中制备4-5μm切片,并将它们安装在带正电荷的载玻片上。如步骤 2.2.2-2.2.6 中所述对部分进行脱蜡处理。
- 用 1x PBS 冲洗切片 3-5 分钟。
- 如果抗体制造商建议进行抗原修复,请制备柠檬酸盐缓冲液。将 9 mL 柠檬酸溶液(10.5 g 柠檬酸在 500 mL 蒸馏水中)和 41 mL 柠檬酸钠溶液(14.7 g 柠檬酸钠在 500 mL 蒸馏水中)混合。
- 通过将载玻片置于加热电饭煲中的柠檬酸盐缓冲液中20分钟来执行抗原修复。
- 将载玻片转移到 3% 过氧化氢/1x PBS 中 10 分钟,以消除组织中的过氧化物酶活性。
注意:每次都使此溶液新鲜,如果超过 3-4 个月,请不要使用过氧化氢的储备溶液。 - 用 1x PBS 冲洗切片。
- 使用封闭缓冲液(2%BSA,0.1%Triton X-100在1x PBS中的1x)封闭切片1小时。在 1x PBS 中短暂冲洗载玻片。
- 将一抗添加到组织切片中。在稀释的封闭缓冲液中制备一抗。将载玻片在37 °C下孵育2小时或在4 °C下孵育过夜。
- 在1x PBS中洗涤载玻片5分钟,重复3次。
- 将组织与生物素化二抗孵育1-2小时。
- 根据制造商的方案制备二氨基联苯胺(DAB)溶液,并将载玻片浸入溶液中2-10分钟。在水中洗涤载玻片5分钟。
- 通过将切片浸入苏木精中10-15分钟来复染切片。暴露在流水中,直到它变清。快速将载玻片浸入酒精中,然后用水冲洗载玻片。
- 通过快速浸入载玻片,在70%乙醇,95%乙醇,然后100%乙醇中快速浸泡载玻片,每种溶液4-5次,使梯度乙醇中的载玻片脱水。将载玻片在d-柠檬烯基溶剂中孵育2分钟。将载玻片在第二批d-柠檬烯基溶剂中孵育2分钟。
- 使用二甲苯基封片介质封装载玻片。
- 通过明场显微镜检查载玻片。
- 对于免疫荧光,省略步骤3.3.10-3.3.15。相反,用在封闭缓冲液中稀释的物种特异性二抗孵育组织1-2小时。
- 在 1x PBS 中冲洗载玻片 5 分钟,重复 3 次。
- 使用 1x PBS/甘油安装载玻片。
- 使用荧光显微镜检查载玻片。
- 肥大细胞染色的替代方法:甲苯胺蓝染色
- 通过将 1 g 甲苯胺蓝 O 溶解在 100 mL 70% 乙醇中来制备甲苯胺蓝储备溶液。
- 通过将 0.5 g NaCl 溶解在 50 mL 蒸馏水中来制备 1% 氯化钠 (NaCl) 溶液。混合溶解。使用HCl将pH调节至约2.0-2.5。
注意:每次进行染色时,这种 NaCl 溶液都必须新鲜。 - 通过将 5 mL 甲苯胺蓝储备溶液加入 45 mL 1% NaCl 溶液中来制备甲苯胺蓝工作溶液。充分混合,确保pH值约为2.3。
注意:pH 值高于 2.5 将导致染色减少变色。每次进行染色时,使该溶液新鲜。 - 如步骤2.2.2-2.2.6所述,将安装在带正电荷载玻片上的4-5μm切片脱蜡。在流水中洗涤脱蜡切片2分钟。
- 在甲苯胺蓝工作溶液中染色切片2-3分钟。在蒸馏水中洗涤2分钟。
- 通过在 95% 乙醇中浸泡 10 倍来脱水切片。将玻片浸入 100% 乙醇 10 倍。将玻片浸入新鲜的 100% 乙醇中 10 次以上。
- 将载玻片在d-柠檬烯基溶剂中孵育2分钟。将载玻片在第二批d-柠檬烯基溶剂中孵育2分钟。
- 使用二甲苯基封固介质安装盖玻片,同时载玻片仍被 d-柠檬烯基溶剂弄湿。
注意: 请勿 使用水性安装介质。 - 通过明场显微镜检查载玻片。通过肥大细胞的细胞质中存在深紫色颗粒来识别肥大细胞。其他细胞类型被染成浅蓝色。
4. 用于诊断 MPNST 并排除其他诊断的特殊染色剂
- 人类 MPNST 的组织学表现变化很大,几种不同的肿瘤类型具有与 MPNST 相似的外观28。由于 MPNST 来源于雪旺细胞谱系,因此通过对 H&E 染色切片进行大体检查或明场显微镜检查来确定肿瘤是起源于周围神经还是存在于现有的良性 PN 内。尽管偶尔发现 MPNST 与周围神经或 PN 无关(通常是因为在夹层过程中无意中与神经分离、MPNST 过度生长破坏了原有的 PN,或者因为病变是转移性的),但要寻找肿瘤与神经或 PN 的关联,因为如果肿瘤与神经或 PN 无关,则诊断的可能性较小。
- 从含有潜在MPNST的石蜡块中制备4-5μm切片,并将其安装在带正电荷的载玻片上,如步骤2.2.1中所述。如步骤 2.2.2-2.2.6 中所述对部分进行脱蜡处理。
- 如步骤3.3.1-3.3.15所述,使用 表2 所示的一组抗体进行免疫组化。
- 通过明场显微镜检查免疫染色。由于 MPNST 显示 schwannian 分化,因此寻找 S100β、nestin 和 Sox10 的均匀或斑块状免疫反应性。如果肿瘤对这三个标志物不呈阳性,请参阅 表 2 以确定诊断。
注意:人和小鼠MPNST可以表现出不同的分化。例如,一些人类 MPNST 表现出局灶性横纹肌母细胞分化(这些变异称为恶性 Triton 肿瘤);虽然这些肿瘤会染色为雪旺尼亚标志物,但它们也表达肌肉标志物,如结蛋白、MyoD1 和肌生成素。后一种标志物的免疫反应性不应阻止研究人员将肿瘤诊断为MPNST。尽管已经建立了多个条件表达 SS18-SSX 融合基因的小鼠模型来模拟滑膜肉瘤发病机制29,但据我们所知,自发产生等效融合转录本的滑膜肉瘤模型尚不清楚。因此,我们不在GEM肿瘤中寻找SS18-SSX融合转录本,而是依赖于免疫组织化学谱。
5. MPNST的分级
- 确定是否存在肿瘤坏死(WHO IV 级 MPNST 的标志)。对于 IV 级 MPNST,寻找突出的细胞增生、活跃的有丝分裂活性(每 10 个高倍 (40x) 野中有 ≥4 个有丝分裂)和细胞学异型性。
- 如果不存在坏死,则评估肿瘤以确定是否存在细胞增生、有丝分裂活动活跃和细胞学异型性。如果这些特征在没有坏死的情况下都存在,则将肿瘤分级为 WHO III 级 MPNST。
- WHO II 级肿瘤的特征是细胞性增加,但程度低于 WHO III 级和 IV 级 MPNST。WHO II 级 MPNST 中的肿瘤细胞核显示大小增加(超过神经纤维瘤中肿瘤细胞核大小的 3 倍)和高色素症。有丝分裂活性增加(<每 10 个高倍场有 4 个有丝分裂)与 WHO II 级肿瘤相关,但不是必需的。
注意:由于高级别肿瘤通常从低级别进展,因此低级别和高级别区域可能存在于同一 MPNST 中。在这种情况下,肿瘤的分级由存在的最高分级区域决定。
注意:人类病理学家对上述 WHO 分级系统是否可预测患者预后存在争议,其中一些病理学家更愿意简单地将 MPNST 分类为低级别或高级别。根据该方案,高级别 MPNST 具有突出的细胞学异型性、活跃的有丝分裂活性(每 10 个高倍视野 >5 个有丝分裂)和明显的细胞增生伴或不伴坏死。低级别 MPNST 没有坏死,但显示出有丝分裂活性、细胞学异型性和介于高级别 MPNST 和具有未知生物学潜力的非典型神经纤维瘤性肿瘤 (ANNUBP) 之间的细胞性。我们更喜欢上述系统,因为对于没有长期接触这些实体经验的调查人员来说,区分 ANNUBP 和低级 MPNST 可能具有挑战性。
6.早期传代P 0-GGFβ3 MPNST细胞培养物的制备
- 从新鲜肿瘤片段2中培养早期传代P 0-GGFβ3肿瘤细胞(步骤1.5,图1A)。从现在开始保持无菌状态。
- 将肿瘤切成小块(2-4mm)并在含有10%胎牛血清,2μmol/L毛喉素和10nmol/L神经调节蛋白1β(NRG1β)的DMEM10(Dulbecco的最小必需培养基)中切碎,在100mm组织培养皿中解离。
- 让细胞在37 °C的5%CO2 中从切碎的组织碎片中生长出来,直到平板汇合。每 3-4 天更换一次介质。
- 分离细胞培养物。从 100 mm 培养皿中取出培养基并用 PBS 洗涤细胞;取出并丢弃切碎的组织。去除 PBS,在室温下加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶 2-5 分钟。为了促进细胞分离,轻轻敲击板并使用光学显微镜检查是否分离;根据需要延长胰蛋白酶孵育时间。
- 通过加入 2 mL DMEM10 中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移到离心管中,并以500× g 沉淀细胞5分钟。取出培养基,向沉淀中加入 5 mL 新鲜 DMEM10。
- 将细胞悬液分布到两个至四个含有DMEM10的100mm培养皿中。不要分裂细胞超过五次传代(步骤6.1.3和6.1.4),并将它们维持在不含毛喉素和NRG1β的DMEM中。请记住在传代 2 时冷冻细胞以备将来使用。
7. 通过免疫细胞化学验证早期传代MPNST细胞的身份
- 将无菌18mm #1.5圆形玻璃盖玻片置于6孔无菌组织培养皿的孔中。
- 将聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白溶液以足以覆盖盖玻片的体积放入孔中。用保鲜膜密封板以尽量减少蒸发。在4°C孵育过夜。第二天早上,用无菌PBS清洗盖玻片3次。
注意:我们尝试在未包被的盖玻片上铺板早期传代 MPNST 细胞,并发现在没有聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白涂层的情况下,细胞不能很好地粘附。 - 将 10,000 个细胞铺板到盖玻片上,将生长培养基中的 2 mL 细胞悬浮液轻轻加入每个含有盖玻片的孔中。将板在37°C下与5%CO2 在组织培养箱中孵育过夜。
- 第二天早上,用PBS冲洗盖玻片2×5分钟。
- 在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定细胞18分钟。
- 用PBS冲洗盖玻片3×5分钟。如果需要,使用塑料薄膜密封板,此时将其储存在4°C。
- 在PBS中制作新鲜的50mM NH4Cl。通过在室温下将盖玻片在 PBS 中的 50 mM NH4Cl 中孵育 10 分钟来淬灭醛。
- 通过在室温下将盖玻片在0.3%Triton X-100中的PBS中孵育15分钟来透化细胞。用PBS洗涤盖玻片3×5分钟。
- 通过在室温下将盖玻片在封闭缓冲液(含有1%牛血清白蛋白,0.2%脱脂奶粉和0.3%Triton X-100的1x PBS)中孵育1小时来阻断非特异性结合。
- 取出封闭缓冲液并添加一抗,识别母体肿瘤中存在的MPNST标志物(通常为S100β,Nestin和Sox10),稀释至封闭缓冲液中预定的最佳稀释度。用塑料薄膜包裹板,并在4°C下在加湿室中孵育过夜。
- 用 PBS 洗涤 3 x 5 分钟以除去未结合的一抗。加入在封闭缓冲液中稀释的荧光标记二抗,并在室温下孵育 1 小时。 避光。
- 用PBS洗涤3 x 5分钟。将盖玻片在1-5μgHoechst染料中孵育10分钟。 继续 避光。
- 用PBS洗涤盖玻片5分钟。使用 1:1 1x PBS/甘油安装载玻片。用荧光显微镜拍摄图像。
- 将聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白溶液以足以覆盖盖玻片的体积放入孔中。用保鲜膜密封板以尽量减少蒸发。在4°C孵育过夜。第二天早上,用无菌PBS清洗盖玻片3次。
8. 早期传代肿瘤细胞的同种异体移植物以证明致瘤性
- 在 DMEM10 中培养早期传代 P 0-GGFβ3 MPNST 细胞至 80% 汇合。用室温汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 冲洗细胞一次。用非酶促细胞解离溶液处理细胞30秒至1分钟,以将其从底物中除去。每 1 mL 非酶细胞解离试剂加入 5 mL DMEM10。
注意:细胞解离可能需要更长的时间,长达 10-20 分钟。请参阅制造商的协议。
注意:不要将细胞培养到汇合处,因为这会降低移植的有效性。- 使用血细胞计数器计数细胞。将细胞以 5 × g 旋转 5 分钟,并以每 100 μL DMEM1010 10 个 6 个细胞的 1-2 ×浓度重悬。将细胞放在冰上,直到准备注射。
- 在异氟烷汽化器的诱导室中麻醉NOD-SCIDγ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl / SzJ)小鼠。将动物放在肚子上,用70%乙醇对注射部位进行消毒。注射前让该部位风干。注射前,让细胞达到室温。
- 在右翼皮下注射 1-2 x 106 个细胞。将老鼠单独放在没有垫料的笼子里,让它恢复。确保笼子只有一部分放在加热垫上,以防止体温过低。这提供了一个区域,鼠标在过热时可以移动到该区域。
注意:我们在每次早期传代培养物中至少移植三只小鼠,因为某些移植物可能无法接受。 - 让移植物生长15-60天;每周评估动物健康 3 次,并记录每次检查的身体状况评分,包括体重和行为变化。使用二氧化碳安乐死处决已达到最大允许移植物大小的小鼠或垂死的小鼠,然后进行宫颈脱位。以天为单位记录死亡年龄。当肿瘤在外部可见时,记录肿瘤尺寸(长度、宽度和高度)。
注意:根据我们的经验,不同的早期传代MPNST培养物以不同的效率进行嫁接,并且移植物生长所需的时间也不同。不得允许动物超过 IACUC 批准的最大允许肿瘤大小和/或人道终点。
- 收获肿瘤,将其固定在 4% 多聚甲醛中,将其包埋在石蜡中,并按照第 2.1-2.2.9 节所述进行 H&E 染色,以验证同种异体移植物是肿瘤而不是反应性组织。如有必要,对移植物进行免疫染色,以寻找母体肿瘤中存在的标志物。
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Representative Results
图 2 显示了 P 0-GGFβ3 小鼠中出现的明显肿瘤的例子。肉眼容易识别的肿瘤可以看作是肿块扩张的身体区域,如图2A(箭头)所示。在确定肿瘤是否可能是周围神经鞘瘤时,必须确定肿瘤与周围神经有关。在这种情况下,MRI扫描(图2B)表明肿瘤与坐骨神经(箭头)有关;在对小鼠实施安乐死并解剖肿瘤后证实了这种关联。应该注意的是,大尺寸并不一定表明肿瘤是恶性的。在这种情况下,肿瘤的组织学检查(图2C)表明它是一种神经纤维瘤。然而,最常见的是,在对小鼠进行尸检之前,不会发现明显明显的肿瘤。图 2D 显示了该动物臂丛神经内出现的一个大的肉质 MPNST。
图3显示了根据方案第1节中概述的程序制备的来自P 0-GGFβ3小鼠的MPNST和神经纤维瘤的代表性示例。图 3A-J 说明了来自我们的 P0-GGFβ3 小鼠群体的十个独立产生的 MPNST 示例。请注意,MPNST的组织学表现可能变化很大,即使在同一动物中独立出现的MPNST之间也是如此。这种组织学变异性说明了为什么我们常规使用免疫组织化学染色来确认 P 0-GGFβ3 MPNST 的诊断。我们还要指出,在一些近交系小鼠品系中,其他明显无关的肿瘤类型以低频率零星发生(例如,我们多次在携带转基因的 P 0-GGFβ3 小鼠中遇到淋巴瘤在 C57BL/6J 背景上),进一步强调了使用免疫组化来确认肿瘤诊断的重要性。尽管其组织学外观存在差异,但图 3A-J 所示的所有 10 个肿瘤对 S100β 和巢蛋白均具有免疫反应性,对其他肿瘤类型的标志物呈阴性。图3K显示了正确脱钙的脊柱和相关组织的代表性图像。请注意,脊髓、神经根、椎体和骨骼肌都保持着彼此之间的正确解剖关系。图3L是椎体和上覆脊髓的高倍图像。由于这种组织经过适当的脱钙,骨骼很容易切割而不会切碎或折叠,并且骨髓在骨髓空间中很容易识别。如果组织没有正确脱钙,它就会卡在切片机刀片上并被撕出切片,对邻近组织(脊髓、脊神经根和骨骼肌)造成严重损害。图3M显示了P 0-GGFβ3小鼠背神经根内发生的神经纤维瘤的代表性图像。请注意,该肿瘤的细胞比图 3A-J 所示的 MPNST 少。神经纤维瘤的关键诊断是它们由肿瘤性雪旺细胞和非肿瘤性肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和浸润神经并扩散轴突的神经周围样元件的复杂混合物组成。
图 4 说明了对初始识别丛状神经纤维瘤和区分丛状神经纤维瘤和 MPNST 最有用的染色示例。图4A显示了P 0-GGFβ3丛状神经纤维瘤中的S100β免疫反应性。请注意,S100β 免疫反应性仅在细胞亚群中明显,这与神经纤维瘤由肿瘤雪旺细胞和其他非肿瘤元件(成纤维细胞、肥大细胞、巨噬细胞、神经周围样细胞、定义不清的 CD34 免疫反应细胞群和脉管系统)的混合物组成的事实一致。不幸的是,斑片状 S100β 染色不能区分丛状神经纤维瘤和 MPNST,因为 S100β 染色在 MPNST 中可能是斑块状的(H&E 染色可用于此目的;然而,由于 MPNST 通常比丛状神经纤维瘤更具细胞性 [见图 3])。肿瘤性雪旺细胞对中间丝巢蛋白也具有免疫反应性,如图 4B 所示的 P 0-GGFβ3 MPNST 所示。肿瘤性雪旺细胞也经常表现出转录因子 Sox10 的核免疫反应性,如图 4C 中的 MPNST 所示。有助于区分丛状神经纤维瘤和 MPNST 的特征是肥大细胞的存在和对 Ki67 增殖标志物的显着免疫反应性。图 4D 显示了对 P 0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤进行的 Unna 染色,以突出肥大细胞的存在,肥大细胞很容易通过其细胞质颗粒的突出异染紫染色来识别。肥大细胞不存在于 MPNST 中。相比之下,Ki67免疫反应性在丛状神经纤维瘤中几乎不存在,如图4E所示的P 0-GGFβ3肿瘤所示。核 Ki67 标记通常存在于非常高比例的肿瘤细胞中,如 P 0-GGFβ3 小鼠三叉神经节中产生的微观 MPNST 所示(图 4F)。
图 5 说明了我们在新开发的 GEM 模型中为充分表征神经纤维瘤的细胞组成而进行的染色示例。虽然该图中显示的染色是在人真皮神经纤维瘤中获得的,但它们在外观上与我们在 GEM 肿瘤中看到的相同。CD117 (c-Kit) 的免疫反应性存在于神经纤维瘤内的肥大细胞中,因此其分布与 Unna 染色高度相似(见图 3A)。巨噬细胞也散布在整个神经纤维瘤中,如泛巨噬细胞标志物Iba1所示(见 图5D);这包括对CD163和CD86具有免疫反应性的巨噬细胞亚类(分别见 图5B 和 图5C)。神经纤维瘤中一小部分雪万尼元素也显示出对 Sox10 的核免疫反应性。成纤维细胞可以通过其对 TCF4 的免疫反应性来突出。在 图5G中,CD31标记了神经纤维瘤内的血管元件,而 图5H所示的CD34标记了一个神秘的树突状细胞群,这些细胞群被认为是驻留组织巨噬细胞30 的亚群或既不是雪旺细胞也不是成纤维细胞31的新型神经鞘细胞群。
包括图6是为了能够将人丛状神经纤维瘤和MPNST与P 0-GGFβ3小鼠中观察到的肿瘤进行比较,并提供一些可能与MPNST混淆的人类肿瘤类型的代表性示例。 图6A显示了NF1患者臂丛神经中出现的丛状神经纤维瘤, 而图 6B 显示了在同一丛状神经纤维瘤中出现的 WHO IV 级 MPNST。图6B显示了WHO IV级MPNST的一些特征,包括明显的细胞增生和细胞异型性、有丝分裂活性旺盛和肿瘤坏死。为了进行比较,图6C显示了WHO II级MPNST,该MPNST具有明显的细胞异型性,但比IV级MPNST的细胞增多程度较低,尽管存在有丝分裂,但表现出较少的有丝分裂活性。图6D显示了一种纤维肉瘤,其特征性的“人字形”模式是肿瘤细胞的交织鞘。然而,这种模式不一定区分纤维肉瘤和 MPNST,因为一些 MPNST 将具有类似的模式。此外,图6E中显示的高倍视图显示的细胞形态与图6B中所示的WHO IV级MPNST中的细胞形态相似。图 6F 显示了平滑肌肉瘤。与大多数 MPNST 不同,平滑肌肉瘤对平滑肌肌动蛋白和结蛋白等肌肉标志物具有免疫反应性。然而,平滑肌肌动蛋白免疫反应性可能因肿瘤而异,一些肿瘤表现出强烈的均匀免疫反应性(图6G),而另一些肿瘤表现出免疫反应性,显示肿瘤内的细胞变异性(图6H)。结蛋白免疫反应性在平滑肌肉瘤中也可以是斑片状的(图6I)。黑色素瘤的形态变化很大,一些肿瘤由多边形细胞组成(图6J),而另一些则由纺锤形细胞组成,可以模仿MPNST细胞的形态。黑色素瘤可以通过对黑色素体标志物(如 MART1)的免疫反应性与 MPNST 区分开来(图 6K)。然而,黑色素瘤与 MPNST 一样,通常对 S100β 和 Sox10 呈阳性(图 6L)。
图 7 显示了从 P0-GGFβ3 小鼠中分离的 WHO II、III 和 IV 级 MPNST 的病理特征。图 8 显示了低功率(图 7A)和高功率(图 7B)下早期传代 P 0-GGFβ3 MPNST 细胞的代表性图像。这些细胞的致瘤性表现在它们悬浮在软琼脂中时形成菌落的能力(图7C)和在免疫缺陷小鼠中皮下移植同种异体移植时形成移植物的能力(图7D)。
图 1:用于处理 P 0-GGFβ3 小鼠肿瘤和其他组织的工作流程。 (A) 收获肉眼可见的肿瘤并将其分成三部分,用于 1) 固定在 4% 多聚甲醛中,然后进行免疫组化和组织化学,2) 建立早期传代肿瘤细胞培养和/或基因组分析,以及 3) 使用液氮快速冷冻用于蛋白质、DNA 或 RNA 分离。(B)切除肿瘤后,将小鼠的身体固定在4%多聚甲醛中,并取出内脏。对这些器官进行取样进行组织学检查,以确定肿瘤和其他病理过程的微观证据。(C) 切除内脏后,从尸体上取出四肢(头、四肢、尾巴)和皮肤。使用 0.3 M EDTA/4% 多聚甲醛 (pH 8.0) 对脊柱、相邻肋骨和相邻骨骼肌进行脱钙。然后将脱钙组织包埋在石蜡中,并制备用于免疫组织化学和组织化学检查的组织切片。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:P 0-GGFβ3 小鼠中明显神经纤维瘤和 MPNST 的代表性图像。 (A) P0-GGFβ3 小鼠,右侧有一个大而明显的肿瘤(箭头)。(B) 这只小鼠的 MRI 扫描显示肿瘤与坐骨神经(箭头)相连,并且它已经通过覆盖的筋膜生长并在皮下(箭头、块状肿瘤肿块)内扩展。(C)该肿瘤的显微镜检查表明,尽管肿瘤体积很大,但该肿瘤是一种神经纤维瘤。(D) 在 P 0-GGFβ3 小鼠的臂丛神经中出现的大肉质 MPNST。比例尺 = 100 μm。缩写:MPNSTs = 恶性周围神经鞘瘤;MRI = 磁共振成像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:按照协议第 1 节所述制备的 MPNST、脱钙脊柱和神经纤维瘤的代表性图像。(A-J) 切除和 H&E 染色的 P 0-GGFβ3 MPNST 显示组织学变异性。所有图像都是独立生成的 MPNST。尽管存在这种组织学差异,但这些肿瘤都显示出表1所示的MPNST标志物的适当标记。比例尺 = 200 μm。 (K) 脱钙脊柱的 H&E 染色横截面的代表性图像。在这张图片中,以下结构很容易可视化:脊髓;椎骨;背脊神经根上的背根神经节;和椎旁骨骼肌。放大倍率 4 倍。 (L) K 中显示的脊髓和椎骨的高倍图像显示了使用这种方法脱钙后骨骼的正常外观。放大倍率 10 倍。 (M) P 0-GGFβ3 小鼠背神经根神经纤维瘤的代表性图像。放大倍率:40倍。比例尺 = 100 μm。缩写:MPNSTs = 恶性周围神经鞘瘤;H&E = 苏木精和伊红。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:用于初步鉴定丛状神经纤维瘤的诊断染色剂及其与 MPNST 的区别。 (A) P 0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤中 S100β 的免疫染色剂。请注意,该抗原的强烈棕色染色仅存在于该肿瘤的细胞子集中,这与神经纤维瘤由肿瘤性雪旺细胞和多种其他非肿瘤性细胞类型组成的事实一致。(B) P 0-GGFβ3 MPNST 的免疫荧光图像,用中间丝巢蛋白染色(红色)并用双苯甲酰亚胺复染(蓝色,核染色)。(C) MPNST 染色转录因子 Sox10。强烈的免疫反应性(棕色)在肿瘤细胞亚群的细胞核中很明显。(D) Unna 染色后 P 0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤的高倍视图。该染色剂对肥大细胞中的颗粒产生异染色(紫色)染色。丛状神经纤维瘤可以与 MPNST 区分开来,因为后者缺乏肥大细胞。(英、女)Ki67 免疫组化在 (E) a P 0-GGFβ3 丛状神经纤维瘤和 (F) a P0-GGFβ3 MPNST 中。两个切片均已用苏木精(蓝色核染色)复染,Ki67免疫反应性在这些免疫过氧化物酶染色中表现为棕色核染色。请注意,丛状神经纤维瘤中没有明显的棕色核染色,而大多数肿瘤细胞核在 MPNST 中呈阳性。比例尺 = 100 μm。缩写:MPNST=恶性周围神经鞘瘤。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:用于识别组成神经纤维瘤的细胞亚群的免疫染色剂的代表性图像。 这些来自人真皮神经纤维瘤的免疫荧光图像已被染色 (A) CD117(c-Kit;肥大细胞标志物)、(B) CD163(M2 巨噬细胞)、(C) CD86(M1 巨噬细胞)、(D) Iba1(泛巨噬细胞标志物)、(E) Sox10(雪旺细胞标志物)、(F) TCF4(成纤维细胞标志物)、(G) CD31(脉管系统标志物)和 (H) CD34(标志着神经纤维瘤中一个独特的、知之甚少的细胞亚群)。放大倍率 60 倍,比例尺 = 200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:在 MPNST 鉴别诊断中考虑的丛状神经纤维瘤、MPNST 和其他一些人类肿瘤类型的代表性图像。 (A) 起源于 NF1 患者臂丛神经的丛状神经纤维瘤,显示该肿瘤的整体细胞性较低和良性外观。虽然在 H&E 染色切片中不容易显现,但存在复杂的细胞类型混合物。没有看到有丝分裂。放大倍率:40 倍。 (B) 由 A 所示的丛状神经纤维瘤引起的 WHO IV 级 MPNST。请注意蜂窝的更高程度。箭头表示有丝分裂图,星号表示该微观视野右上方的肿瘤坏死区域。放大倍率:40 倍。 (C) 世卫组织二级MPNST。该肿瘤的细胞性程度低于 B 所示的 WHO IV 级 MPNST。然而,核异型性和高色素症比 A 中所示的丛状神经纤维瘤中更明显。箭头表示在该肿瘤中偶尔遇到的有丝分裂图形之一。放大倍率:63 倍。 (D) 成人型纤维肉瘤的低倍视图,说明了这种肿瘤类型中常见的“人字形”模式(肿瘤细胞的交织鞘)。不幸的是,在一些人类 MPNST 中也遇到了人字形结构,因此不能用于区分纤维肉瘤和 MPNST。 放大倍率:20 倍。 (E) D 所示的纤维肉瘤的高倍视图。请注意,该纤维肉瘤中的细胞形态与 B 中所示的 WHO IV 级 MPNST 中明显的细胞形态之间的相似性。放大倍率:40 倍。 (F) 平滑肌肉瘤的高倍图像,显示细胞形态在 MPNST 中看到的变异范围内。 放大倍率:40 倍。 (G) 平滑肌肉瘤平滑肌动蛋白的免疫染色, 如 F 所示。请注意,肿瘤细胞对该抗原表现出均匀的强烈免疫反应性。放大倍率:40 倍。 (H) 不同平滑肌肉肉瘤平滑肌肌动蛋白的免疫染色。在这种肿瘤中,免疫反应性程度的变异性更大,一些细胞的染色比其他细胞更强烈。同一抗原均匀存在于一个肿瘤中,并且仅存在于不同肿瘤的肿瘤细胞亚群中,这种免疫反应性并不少见。放大倍率:40 倍。 (I) 第三例平滑肌肉瘤中结蛋白的免疫染色。在这种肿瘤中,只有一部分肿瘤细胞对这种抗原具有强烈的免疫反应性。(J) 转移性黑色素瘤。黑色素瘤因具有高度可变的形态而臭名昭著,范围从立方体到纺锤形;具有后一种形态的肿瘤最有可能与 MPNST 混淆,特别是考虑到黑色素瘤和 MPNST 都可以表现出 S100β 和 Sox10 免疫反应性。放大倍率:40 倍。 (K) J 所示肿瘤中黑色素瘤标志物 MART1 的免疫反应性。放大倍率:40 倍。 (L) J 中所示的黑色素瘤中转录因子 Sox10 的核免疫反应性。放大倍率:40 倍,比例尺 = 100 μm。缩写:MPNST=恶性周围神经鞘瘤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7:WHO II-IV级P 0-GGFβ3 MPNST的代表性图像。 (A) WHO II 级 MPNST 的低倍和 (B) 高倍显微照片。请注意,细胞性低于图 C 中所示的 WHO III 级 MPNST,并且 D 中肿瘤细胞的细胞核比图 B 中看到的更深色(更暗)。(C) WHO III 级 MPNST 的低倍和 (D) 高倍显微照片。这种肿瘤每 10 个高倍场表现出 >4 个有丝分裂图,细胞堆积更密集,更深色,非典型细胞核。(E) WHO IV 级 MPNST 的低功率和 (F) 高倍视图。注意坏死的焦点在面板 F 的底部中心部分。低功耗 = 20 倍。 高倍率 = 40 倍,比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8:早期传代 P 0-GGFβ3 MPNST 细胞的代表性图像及其致瘤性,如软琼脂中的生长及其作为同种异体移植物生长的能力所证明的那样。 (A) 早期传代 P0-GGFβ3 MPNST 细胞的低功率和 (B) 高功率相差图像。(C) P 0-GGFβ3 MPNST细胞生长在软琼脂中,并用苏丹黑染色;菌落在琼脂中明显为黑色点状。(D) 如方案所述,在免疫缺陷小鼠中皮下移植 P 0-GGFβ3 MPNST 细胞后形成的肿瘤的苏木精和伊红染色图像。(E) 通过 Celigo 图像细胞仪测定的早期传代 P 0-GGFβ3 MPNST 细胞在 5 天内的增殖。低功耗 = 10 倍,高功耗 = 40 倍;比例尺 = 100 μm 用于所有面板 请点击这里查看此图的较大版本.
名字 | 用法 | 物种反应性/类别 |
CD117型 | 预稀释 | 兔 单克隆 |
CD163型 | 1:200 | 小鼠 单克隆 |
CD31型 | 1:50 | 兔多克隆 |
CD34型 | 1:2000 | 兔 单克隆 |
CD86型 | 1:1000 | 兔 单克隆 |
细胞角蛋白 | 1微克/毫升 | 小鼠 单克隆 |
德斯敏 | 1:50 | 小鼠 单克隆 |
伊巴1 | 1:500 | 多克隆兔 |
Ki-67型 | 1:50 | 兔 单克隆 |
MART1(马尔特1号公寓) | 1微克/毫升 | 小鼠 单克隆 |
巢蛋白 | 1:1,000 | 小鼠 单克隆 |
PMEL公司 | 1:100 | Rabbot 单克隆 |
S100B系列 | 1:200 | 兔多克隆 |
SMA系列 | 1:100 | 小鼠 单克隆 |
袜子10 | 1:10 | 小鼠 单克隆 |
TCF4/TCFL2型 | 1:100 | 兔 单克隆 |
表1:用于诊断丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤的抗体。 用于常规识别 GEM 丛状神经纤维瘤(S100β、Sox10、CD117、Ki67)、诊断 MPNST 以及完整评估神经纤维瘤中存在的其他细胞类型的抗体。缩写:MPNST=恶性周围神经鞘瘤。
S100β型 | 巢蛋白 | 袜子10 | MART1(马尔特1号公寓) | PMEL公司 | 德斯敏 | 平滑肌肌动蛋白 | 细胞角蛋白 | SS18-SSX融合 | ||
MPNST的 | 50-90%,通常为局灶性 | 好评1 | ~30% | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | |
纤维肉瘤 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | |
平滑肌 肉瘤 | 罕见 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 50-100% | 阳性 | ~40% | 阴性 | |
上皮肉瘤 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | |
黑色素瘤 | 阳性 | 阳性 | 85% | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | |
单相滑膜肉瘤 | ~30% | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 | 阳性 |
表2:用于建立人类肿瘤身份的标志物。 这些免疫组织化学和组织化学标志物,以及肿瘤显微形态学的评估,用于将MPNST与其他模仿它们的肿瘤区分开来。通常考虑的人 MPNST 的鉴别诊断包括成人型纤维肉瘤、上皮样肉瘤、平滑肌肉瘤、单相滑膜肉瘤和黑色素瘤。成人型纤维肉瘤在显微镜下具有人字形和波形蛋白染色,但不具有 S100β。平滑肌肉瘤,但不是 MPNST,对结蛋白具有免疫反应性;平滑肌肉瘤的细胞核也具有明显钝端形态。上皮样肉瘤(而非 MPNST)对细胞角蛋白具有免疫反应性。黑色素瘤与 MPNST 一样,可能是 S100β 阳性,但也对 MART-1 和 PMEL 具有免疫反应性。缩写:MPNST=恶性周围神经鞘瘤。 1S100β 和巢蛋白的组合对 MPNST 具有高度预测性。
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Discussion
这里介绍的组织学和生化方法为诊断和表征神经纤维瘤的GEM模型和MPNST发病机制提供了一个框架。多年来,我们发现这些方法对于评估 GEM 模型21、25、26 中出现的周围神经鞘瘤的病理学非常有用。然而,虽然这里概述的方案对于确定GEM模型中的肿瘤如何准确地概括其人类对应物的病理学很有用,但这些策略存在一些局限性,应该受到重视。首先,P 0-GGFβ3小鼠的肿瘤表型几乎完全显出,这使得获得大量具有神经纤维瘤和MPNST的小鼠相对容易,可用于基因组研究和基因组规模的shRNA筛选。该模型中表型的高外显率也使 P 0-GGFβ3 小鼠在临床前试验中非常有用。然而,应该认识到,并非所有GEM癌症模型都是如此。这就是为什么我们强调确定可以预测发生肿瘤的动物比例的重要性。当使用不太常发生肿瘤的动物模型时,我们发现使用磁共振成像或正电子发射断层扫描等成像方式来明确识别携带肿瘤的动物是有利的,这些动物可以进入临床前试验或其他研究。但是,如果需要重复扫描,这种方法的成本可能高昂。这就是为什么我们还强调了建立感兴趣的 GEM 模型的平均生存时间的重要性26-理解何时可以预期动物发展为肿瘤,从而减少了识别具有所需表型和相关成本的动物所需的扫描次数。
同样重要的是要认识到,小鼠中的大肿瘤实际上仍然是相当少量的组织。在该方案中,我们推荐将肿瘤组织分成三份的过程,其中部分专门用于组织学/免疫组化,建立早期传代细胞培养物,并分离感兴趣的生物分子(蛋白质,RNA,DNA)。然而,肿瘤大小会有所不同,如果肿瘤非常小,这可能会排除有足够的组织以这种方式分裂。在这种情况下,研究者必须确定肿瘤诊断或肿瘤组织的其他用途是否优先32.在这种情况下,我们的偏见是,在开始其他实验之前,我们必须有一个正确的诊断来了解我们正在做什么。我们发现,通常可以使用不到三分之一的肿瘤来轻松确定肿瘤诊断。在处理小肿瘤时,我们通常会取出一小块肿瘤组织,将其包裹在组织组织中,然后将其放入组织盒中,以确保组织在处理过程中不会丢失。这种方法的缺点是,如果需要 WHO 分级,它可能会导致研究者对肿瘤进行低等级;这是因为低级别和高级别区域通常在癌症中共存,如果采集的样本非常小,则获得的等级将取决于肿瘤样本的采集位置。
我们描述的用于确定周围神经鞘瘤身份的方案在很大程度上依赖于免疫组化。虽然偶尔有替代方法可用于某些细胞类型(例如,进行 Unna 染色以识别肥大细胞),但对于神经纤维瘤和 MPNST 中存在的大多数细胞类型来说,这并不完全相同。因此,必须非常小心地确定将要使用的免疫组织化学程序已得到适当优化。根据我们的经验,有几个问题会影响诊断性免疫组化。研究者使用他们以前未使用过的一抗进行稀释系列研究至关重要;此外,当使用先前优化的新批次抗体时,应进行稀释系列33。还必须注意确保手头有新鲜批次的试剂。根据我们的经验,当它们老化时,过氧化氢和 DAB 特别容易出现无法正常工作的情况,这可能会导致研究者不恰当地决定它们的染色是阴性的。
我们描述的丛状神经纤维瘤、MPNST 和 MPNST 鉴别诊断中考虑的各种类型的肿瘤的免疫组织化学特征是我们最常遇到的 21,25,26,34。然而,由于发散性分化在 MPNST 和其他恶性肿瘤中并不少见,因此研究者可能会遇到与我们在此处描述的略有不同的染色谱。这些细微差别是我们强烈建议表征新的GEM肿瘤发生模型的团队包括经验丰富的人类或兽医病理学家。在该协议中,我们已将WHO分级应用于GEM和人类MPNST。我们更喜欢这种分级系统,因为分级标准相对明确,并且易于在人和小鼠 MPNST之间进行比较 2,28。不过,我们要指出的是,病理学家并不统一接受世卫组织的分级标准。这是因为尚不清楚应用于 MPNST 的三个 WHO 等级是否能预测患者的临床结果。正因为如此,许多病理学家更愿意将 MPNST 简单地归类为低级别或高级别恶性肿瘤。使用这种方法,大约 85% 的 MPNST 被认为是高级别恶性肿瘤,其特征是有丝分裂活动活跃、明显的细胞异型性和可能伴有肿瘤坏死的多色素症。低级别 MPNST 显示较少的细胞性、高色素症和有丝分裂活性。
我们发现同种异体移植早期传代MPNST细胞是验证这些培养物致瘤性的直接方法。然而,当细胞不建立同种异体移植物时,应考虑一些问题32。根据我们的经验,虽然绝大多数早期传代MPNST细胞会建立同种异体移植物,但我们偶尔会遇到不会的早期传代培养物。尽管失败了,但阵列比较基因组杂交 (aCGH) 和全外显子组测序表明,这些早期传代培养物具有多种基因组异常,与它们是肿瘤细胞一致25,26。我们还发现了不健康的早期传代培养物,通常是因为在收获它们进行嫁接之前允许培养物汇合。因粗暴处理而受损的细胞(例如,用上下移液的非酶促细胞解离溶液孵育时间过长)在移植时也表现不佳。我们还要指出,我们所指出的贪污建立时间是根据我们的经验估计的。有时,我们会遇到早期传代培养物,它们可以成功建立同种异体移植物,但需要更长的时间才能建立。
上述方法提供了一种综合手段,用于表征新开发的周围神经系统肿瘤 GEM 模型的关键方面,并正确诊断这些动物发展的任何神经纤维瘤和 MPNST。我们概述的用于建立早期传代 MPNST 培养物并使用这些培养物进行同种异体移植的方法也为 GEM 模型中鉴定的肿瘤的致瘤性提供了明确的证据。我们要强调的是,在建立早期传代培养物时,我们并没有对单个克隆进行选择。尽管我们认识到在将肿瘤细胞置于培养物中时,某些选择是不可避免的,但这些初步发现表明,在早期传代的GEM MPNST培养物中发现的突变仍然与亲本肿瘤中存在的突变高度相似。然而,使用aCGH,我们还发现,继续携带这些早期传代培养物进行更长的传代会导致基因组变化,这些变化开始与这些肿瘤细胞早期传代中看到的变化不同。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所(R01 NS048353和R01 NS109655)的资助。R01 NS109655-03S1 至 D.P.J.)、美国国家癌症研究所(R01 CA122804 至 S.L.C.)和国防部(X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 至 S.L.C.)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
CD31 | ABCAM | ab29364 | |
CD34 | ABCAM | ab81289 | |
CD86 | ABCAM | ab53004 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
Liquid Nitrogen | |||
MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
Microtome | |||
Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
P0-GGFβ3 mice | In house | ||
Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
Steel histology mold | |||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
Tissue Cassette | |||
Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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