Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Identifisere, diagnostisere og gradere ondartede perifere nerveskjede svulster i genetisk utviklede musemodeller

Published: May 17, 2024 doi: 10.3791/65740
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

Summary

Vi har utviklet en metodikk for å vurdere om nervesystemet neoplasmer i genetisk utviklede mus nøyaktig rekapitulerer patologien til deres menneskelige kolleger. Her bruker vi disse histologiske teknikkene, definerte patologiske kriterier og kulturmetoder på nevrofibromer og ondartede perifere nerveskjede svulster som oppstår i P 0-GGFβ3 musemodellen.

Abstract

Pasienter med autosomal dominant tumor følsomhetssyndrom nevrofibromatose type 1 (NF1) ofte utvikle pleksiforme nevrofibromer (PN) som senere transformere til svært aggressive ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNSTs). Å forstå prosessen der en PN forvandles til en MPNST vil bli lettere av tilgjengeligheten av genetisk utviklede musmodeller (GEM) som nøyaktig replikerer PN-MPNST-progresjonen sett hos mennesker med NF1. Dessverre rekapitulerer ikke GEM-modeller med Nf1-ablasjon denne prosessen fullt ut. Dette førte til at vi utviklet P 0-GGFβ3 mus, en GEM-modell der overekspresjon av Schwann-cellens mitogennevrenegulin-1 (NRG1) i Schwann-celler resulterer i utvikling av PNer som utvikler seg til å bli MPNST med høy frekvens. For å avgjøre om tumorigenese og neoplastisk progresjon i P 0-GGFβ3-mus nøyaktig modellerer prosessene sett hos NF1-pasienter, måtte vi imidlertid først bevise at patologien til P0-GGFβ3 perifere nerveskjede svulster rekapitulerer patologien til deres menneskelige kolleger.

Her beskriver vi de spesialiserte metodene som brukes til nøyaktig å diagnostisere og gradere perifere nervesystemsvulster i GEM-modeller, ved bruk av P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus som eksempel. Vi beskriver de histologiske, immunhistokjemiske og histokjemiske metodene som brukes til å diagnostisere PN og MPNST, hvordan man skiller disse neoplasmene fra andre tumortyper som etterligner deres patologi, og hvordan man graderer disse neoplasmene. Vi diskuterer etablering av kulturer i tidlig passasje fra GEM MPNST, hvordan disse kulturene kan karakteriseres ved hjelp av immuncytokjemi, og hvordan tumorgenisiteten kan verifiseres ved å etablere allotransplantater. Samlet karakteriserer disse teknikkene patologien til PN og MPNST som oppstår i GEM-modeller og sammenligner kritisk patologien til disse murintumorene med deres menneskelige kolleger.

Introduction

I løpet av de siste tre tiårene har mange laboratorier forsøkt å lage musemodeller av menneskelige kreftformer ved å introdusere humane kreftassosierte mutasjoner i musegenomet eller ved å overuttrykke et genprodukt som er overuttrykt i humane kreftformer. De resulterende genetisk utviklede musmodellene (GEM) kan brukes til en rekke formål, for eksempel å fastslå at den nylig introduserte genomiske modifikasjonen initierer tumorigenese, identifiserer andre senere forekommende genetiske eller epigenetiske endringer som bidrar til tumorprogresjon, og definerer de viktigste signalveiene som driver tumorinitiering og progresjon. I motsetning til ortotopiske xenograftmodeller, som er avhengige av bruk av immundefekte mus, har GEM-kreftmodeller et fullt funksjonelt immunsystem og modellerer derfor mer nøyaktig responser på kandidatterapeutiske midler. Men når du bruker GEM-kreftmodeller til formål som disse, er det viktig at etterforskere bekrefter at observasjoner gjort med GEM-neoplasmer er relevante for deres menneskelige kolleger. Denne valideringen bør omfatte en grundig vurdering av patologien til GEM-neoplasmene og en bestemmelse om hvorvidt de patologiske egenskapene til GEM-neoplasmene rekapitulerer patologien til den tilsvarende humane tumortypen.

Tumorfølsomhetssyndromet nevrofibromatose type 1 (NF1) er den vanligste genetiske sykdommen som påvirker det menneskelige nervesystemet, og forekommer hos omtrent 1 av hver 3.000-3.500 levendefødte 1,2,3. Personer plaget med NF1 utvikle flere godartede perifere nerveskjede svulster kjent som nevrofibromer i huden (dermal nevrofibromer) og i store nerver og nerve plexuses (plexiform nevrofibromer). Mens både dermal og plexiform nevrofibromer forverre pasientens livskvalitet ved å produsere fysisk, atferdsmessig, og / eller sosial svekkelse, plexiform nevrofibromer (PN) er spesielt farlig 4,5. Dette skyldes at PNs ofte transformerer til ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNST), som er aggressive spindelcelleneoplasmer med en eksepsjonelt lav overlevelse 1,2. I stor grad skyldes denne lave overlevelsesraten at radio- og kjemoterapeutiske regimer som for tiden brukes til å behandle MPNST, er ineffektive. Det har imidlertid vært utfordrende å utvikle nye og mer effektive behandlingsformer. Dette er fordi, til tross for hvor ofte MPNST forekommer hos NF1-pasienter, er de fortsatt sjeldne neoplasmer. Som et resultat er det svært vanskelig å skaffe et stort antall humane svulster for studier; Det er også utfordrende å rekruttere nok pasienter med MPNST til kliniske studier. For å overvinne disse begrensningene har flere GEM-modeller blitt generert med sikte på å få ytterligere innsikt i abnormitetene som driver patogenese av nevrofibrom og PN-MPNST-progresjon og for å lette prekliniske studier med kandidatterapeutiske midler.

NF1-pasienter har inaktiverende mutasjoner i en kopi av NF1-genet. Nevrofibroma patogenese utløses når en inaktiverende mutasjon i det gjenværende funksjonelle NF1-genet forekommer i en celle i Schwann-cellelinjen. Overraskende, men når mus ble generert med germline inaktiverende Nf1 mutasjoner, utviklet de ikke nevrofibromer 6,7. Den påfølgende demonstrasjonen av at mus med Nf1-null Schwann-celler og Nf1 haploinsuffisiens i alle andre celletyper (Krox20-Cre;Nf1flox / - mus) utviklet pleksiforme nevrofibromer antydet at redusert Nf1 gendosering i flere celletyper var nødvendig for nevrofibroma patogenese8. Selv da, de pleksiforme nevrofibromer i Krox20-Cre; Nf1flox / - mus utviklet seg ikke til å bli MPNSTs og så bare delvis etterlignet biologien til sine menneskelige kolleger. MPNST-patogenesen oppsto når Nf1-mutasjoner ble assosiert med mutasjoner i ytterligere tumorsuppressorgener som Trp539 eller Cdkn2a10, men MPNST i disse GEM-modellene utviklet de novo eller fra atypiske nevrofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potensial (ANNUBPs)11,12, snarere enn fra allerede eksisterende benigne pleksiforme nevrofibromer (se13,14 for gode vurderinger av disse modellene, samt andre modeller som introduserer ytterligere MPNST-assosiert tap av funksjonsmutasjoner i gener som Suz12 og Pten15).

Disse musemodellene har vært uvurderlige for å etablere rollen som gener som NF1, TP53 og CDKN2A spiller i patogenesen av NF1-assosierte perifere nervesystemsvulster og for prekliniske studier som tester kandidatterapeutiske midler. Imidlertid har vi fortsatt en ufullstendig forståelse av prosessen der pleksiforme nevrofibromer utvikler seg til å bli atypiske nevrofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potensial (ANNUBPs16) og deretter MPNSTs. Noe fremgang har nylig blitt gjort i å forstå denne prosessen med den nylige rapporten om at mus med slettinger i Nf1 og Arf utvikler ANNUBPs som utvikler seg til å bli MPNSTs11. Imidlertid eksisterer ikke Nf1-mutasjonsbaserte musemodeller som fullstendig rekapitulerer prosessen med pleksiform nevrofibrom-MPNST-progresjon sett hos mennesker. I tillegg er det ikke klart om det er flere forskjellige veier som fører til utviklingen av MPNST. Gitt dette er det mulig at GEMene beskrevet ovenfor bare modellerer en delmengde av flere forskjellige veier som fører til nevrofibrom-MPNST-progresjon og MPNST-patogenese. Dette poenget understrekes av det faktum at MPNST også forekommer sporadisk og at noen sporadiske MPNSTer tilsynelatende ikke har NF1-mutasjoner 17,18.

Selv om dette siste punktet har blitt utfordret av Magollon-Lorenz et al. 's siste forslag om at minst noen sporadiske MPNSTs mangler NF1 mutasjoner er melanomer eller en annen type sarkom19, har vi nylig rapportert en sporadisk MPNST og en cellelinje avledet fra denne svulsten (2XSB celler) som var NF1 villtype20. Under karakteriseringen av modertumor og 2XSB-cellelinjen utelukket vi systematisk alternative diagnostiske muligheter, inkludert melanom og de mange andre sarkomtypene som rutinemessig vurderes i differensialdiagnosen av en sporadisk ondartet perifer nerveskjedesvulst 20. I tillegg bemerker vi at Magollon-Lorenz et al. erkjente at deres funn i de tre sporadiske MPNST-cellelinjene som de studerte, ikke kunne generaliseres for å indikere at alle svulster identifisert som sporadiske MPNST ikke er MPNST.

For å konstruere en GEM-modell der nevrofibrom og MPNST-patogenese ikke nødvendigvis var avhengig av spesifikke tumorsuppressorgenmutasjoner, genererte vi transgene mus der overekspresjon av den potente Schwann-cellen mitogen neuregulin-1 (NRG1) ble drevet av Schwann-cellespesifikt myelinprotein null (P0) promotor (P 0-GGFβ3 mus)21. Vi har tidligere vist at humane nevrofibromer, MPNST og MPNST-cellelinjer uttrykker flere NRG1-isoformer sammen med erbB-reseptortyrosinkinasene (erbB2, erbB3 og erbB4) som medierer NRG1-signalering og at disse erbB-reseptorene er konstitutivt aktivert22. Vi har også vist at farmakologiske hemmere av erbB-kinasene kraftig hemmer MPNST-proliferasjon22, overlevelse23 og migrasjon24. I tråd med våre observasjoner hos mennesker utvikler P 0-GGFβ3-mus pleksiforme nevrofibromer25 som utvikler seg til å bli MPNST med høy frekvens 21,25. Vi har vist at P 0-GGFβ3 MPNSTs, som deres menneskelige kolleger, ofte utvikler mutasjoner av Trp53 og Cdkn2a, samt mange andre genomiske abnormiteter som potensielt bidrar til tumorigenesis25. MPNST som oppstår i P 0-GGFβ3-mus har ikke inaktiverende Nf1-mutasjoner. Ved hjelp av genetisk komplement viste vi imidlertid at NRG1 fremmer tumorigenese hos P 0-GGFβ3-mus hovedsakelig gjennom de samme signalkaskader som endres av Nf1-tap 26; denne konklusjonen er basert på vårt funn om at erstatning av NRG1-overuttrykk for Nf1-tap i nærvær av Trp53-haploinsuffisiens (P 0-GGFβ3;Trp53+/- mus) produserer dyr der MPNST utvikler de novo, som man ser i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus27.

For å få denne og annen informasjon som viser at P 0-GGFβ3-mus nøyaktig modellerer prosessene for nevrofibromapatogenese og nevrofibrom-MPNST-progresjon sett hos mennesker med NF1, har vi utviklet spesialiserte metoder for behandling av vev fra disse dyrene, nøyaktig diagnostisering av svulstene deres, gradering av MPNST-ene som oppstår i disse musene, etablering og karakterisering av tidlig passasje P0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST-kulturer og kritisk sammenligning av patologien til P 0-GGFβ3 PN og MPNST og P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNSTs til sine menneskelige kolleger. Mange av disse metodene er generaliserbare til andre GEM-modeller av nervesystemet neoplasi. I tillegg er flere av disse metodene mer bredt anvendelige for GEM-modeller der neoplasmer oppstår på andre organsteder. Derfor presenterer vi her en detaljert beskrivelse av disse metodene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene beskrevet her ble godkjent av Medical University of South Carolina IACUC og ble utført av riktig opplært personell i samsvar med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs retningslinjer for institusjonell dyrepleie.

1. Bestemme tumorpenetrans og overlevelse i P 0-GGFβ3 mus og identifisere svulster i disse dyrene for videre karakterisering

  1. Generer kohorten av mus som vil bli vurdert for tumorigenese. Antall mus som kreves, avhenger av penetransen av tumorfenotypen. For å kompensere for tap som disse, start med en kohort som er 10-15% høyere enn ønsket endelig antall dyr.
    MERK: Vi bestemte tumorpenetrans i P 0-GGFβ3-mus empirisk i en innledende kohort på 50 mus (hvorav seks gikk tapt av grunner som ikke var relatert til neoplasi (f.eks. Kamper))25.
  2. Vurder dyrs helse tre ganger i uken og registrer kroppstilstandspoeng, inkludert vekt og atferdsendringer ved hver undersøkelse. Avslutt tumorbærende eller døende mus (se merknad nedenfor) ved bruk av karbondioksideutanasi etterfulgt av cervikal dislokasjon. Rekordalder ved død i dager. Hvis svulster er eksternt synlige, registrer tumordimensjoner (lengde, bredde og høyde).
    MERK: Det er viktig at dyr ikke har lov til å fortsette forbi den IACUC-godkjente maksimalt tillatte tumorstørrelsen og / eller humane endepunktet.
  3. Ved hjelp av alder ved død, etablere en Kaplan-Meier overlevelseskurve for å bestemme gjennomsnittlig alder ved død og rekkevidde av overlevelse.
    MERK: P 0-GGFβ3 mus hadde en gjennomsnittsalder ved død på 261,5 dager, med en rekkevidde på 74-533 dager; 91% av vår kohort hadde flere nevrofibromer og 71% hadde MPNST21.
  4. Bestem om grovt synlige svulster er til stede, og hvis de er, dissekere dem under sterile forhold for å fastslå om svulsten er assosiert med en perifer nerve og deretter excise svulsten. I P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53 +/- mus, perifere nerveskjede svulster er oftest funnet i trigeminal og sciatic nerver. Selv om grovt synlige svulster ikke ses i forbindelse med disse nervene, fikser og legg inn disse nervene som beskrevet nedenfor, slik at de kan undersøkes for tilstedeværelse av mikrotumorer. Mikrotumorer forekommer vanligvis i ganglia forbundet med disse nerver.
  5. Skjær grovt synlige svulster i tre stykker (figur 1A). Bruk stykke 1 for histologi (parafinsnitt, immunhistokjemi og histokjemi). Bruk stykke 2 til å etablere kulturer for tidlig passasje. Snap-fryse stykke 3 (ved bruk av flytende nitrogen) for mulige fremtidige eksperimenter (f.eks. immunoblots, RNA og DNA-isolasjon).
  6. Fest stykke 1 i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) over natten ved 4 oC. Fiks resten av dyrets kropp ved nedsenking i 4% paraformaldehyd over natten ved 4 ° C.

2. Parafin-innebygging av grovt synlige svulster og fremstilling av hematoksylin og eosinfargede seksjoner for innledende diagnostisk vurdering

  1. Parafininnebygging av grovt synlige svulster
    1. Etter å ha fiksert tumorstykke 1 over natten i 4% paraformaldehyd, skyll vevet ved å plassere det i et volum PBS som er minst 10x større enn vevets volum i 15 minutter; Bruk samme volum for alle påfølgende skyllinger. Gjenta ytterligere to 15 min PBS skyll, bruk et nytt volum PBS for hver skylling.
    2. Overfør tumor stykke 1 til 70% etanol. Hold vevet i 70 % etanol i 24 timer ved 4 °C. Hvis ønskelig, lagre vevet på lang sikt under disse forholdene.
      MERK: Trinn 2.1.1 til og med 2.1.7 er gitt til fordel for etterforskere som ikke har tilgang til en kommersiell vevsbehandlingsmaskin. Hvis etterforskeren har tilgang til en vevsprosessor, vil vevet bli behandlet gjennom graderte etanoler og xylener i henhold til den programmerte instrumentprotokollen.
    3. Overfør tumorstykke 1 til 80% etanol i 30 minutter ved romtemperatur. Gjenta inkubasjonen i ytterligere 30 minutter i et friskt volum på 80% etanol.
    4. Overfør tumorstykke 1 til 95% etanol i 75 min ved romtemperatur. Gjenta inkubasjonen to ganger til, hver gang i ytterligere 75 minutter i et friskt volum på 95% etanol.
    5. Overfør tumor stykke 1 til 100% etanol og inkuber i 60 min ved romtemperatur. Gjenta 60 min inkubasjon to ganger til, hver gang med et nytt volum på 100% etanol.
    6. Overfør tumorstykke 1 til et d-limonenbasert løsningsmiddel og inkuber i 30-60 minutter ved romtemperatur. Overfør tumor stykke 1 til et friskt volum av det d-limonenbaserte løsningsmidlet og inkuber i ytterligere 30-60 minutter ved romtemperatur.
    7. Overfør tumorstykke 1 til 1: 1 parafin / d-limonenbasert løsningsmiddel i 1 time ved 60 oC. Kast 1: 1 parafin / d-limonenbasert løsningsmiddel og overfør tumorstykke 1 til 60 oC parafin og inkuber i 20 minutter ved 60 oC. Gjenta inkubasjonen i et nytt volum på 60 oC parafin en gang til i 20 minutter. Inkuber tumor stykke 1 i parafin over natten ved 60 oC.
    8. Hell et underlag av parafin i en stålhistologiform og la den størkne. Overfør tumor stykke 1 til overflaten av baseparafinen og umiddelbart etter posisjonering, dekk vevet med 60 oC parafin og plasser vevskassetten på toppen av og i kontakt med den smeltede parafinen. Overfør formen til den kalde siden av innebyggingsstasjonen og la den stivne i 10-15 minutter.
    9. Fjern parafinblokken med den vedlagte vevskassetten fra formen. Bruk den vedlagte vevskassetten til å klemme blokken inn i mikrotomen under seksjonering.
      MERK: Parafinblokken kan nå lagres på ubestemt tid ved romtemperatur.
  2. Forbered hematoksylin og eosinfargede seksjoner av grovt synlige svulster.
    1. Klipp 4-5 μm seksjoner av tumorvev ved hjelp av en mikrotome og monter dem på positivt ladede glassglass.
    2. For å utføre farging av hematoksylin og eosin (H&E), deparaffiniser vevsseksjonene ved å inkubere lysbildene i et d-limonenbasert løsningsmiddel i 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta inkubasjonen i et friskt volum d-limonenbasert løsningsmiddel i 10 minutter.
    3. Overfør lysbildene til 100% etanol og rug i 5 minutter ved romtemperatur. Overfør lysbildene til et friskt volum på 100% etanol og inkuber i ytterligere 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Overfør lysbildene til 95% etanol og rug i 5 minutter ved romtemperatur. Overfør lysbildene til et friskt volum på 95% etanol og inkuber i ytterligere 5 minutter ved romtemperatur.
    5. Overfør lysbildene til 70% etanol og rug i 5 minutter ved romtemperatur. Overfør deretter til 50% etanol og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    6. Overfør lysbildene til destillert vann og rug i 5 minutter ved romtemperatur.
    7. Beis lysbildene ved å senke dem i hematoksylin i 5 minutter ved romtemperatur. Skyll med rennende vann fra springen i 1-2 min. Differensiere ved å dyppe lysbilder 2-5x i 0,5% saltsyre i 70% etanol. Skyll i et rennende vann fra springen i 1-2 min. Plasser lysbildene i 95% etanol med 0,5% eddiksyre i 10 s.
    8. Beis lysbildene med eosin-Y i 30 s ved romtemperatur og overfør deretter lysbildene til 100% etanol i 5 minutter. Fjern prøvene i et d-limonenbasert oppløsningsmiddel i 5 minutter.
    9. Monter deksler med et xylenbasert monteringsmedium mens lysbildet fortsatt er vått med det d-limonenbaserte løsningsmidlet. La monteringsmediet stivne over natten.
      MERK: Ikke bruk et vannbasert monteringsmedium.
  3. Forbered vev uten grovt synlige svulster for å identifisere pleksiforme nevrofibromer og mikro-MPNST. Legg vevet i parafin, forbered histologiske seksjoner, og flekk disse seksjonene med hematoksylin og eosin.
    1. Fjern de indre organene og legg inn representative deler av hvert organ i parafin for å forberede H&E-fargede seksjoner som vil bli undersøkt for mikroskopiske tegn på svulster (figur 1B). Fjern hodet, forbenene, bakbenene og halen (figur 1C). For å undersøke ryggmargen og nerverøttene in situ for tegn på nerverottumorer, avkalke vertebral kolonnen og tilhørende ribber og bløtvev ved nedsenking i 0,3 M EDTA / 4% paraformaldehye (pH 8,0) i 48-72 timer ved 4 oC; Skyll deretter prøvene med 1x PBS. På slutten av avkalkning, sørg for at avkalkningen er fullført ved å forsøke å stikke hull i vertebral kolonnen med en nål. Avkalkning er vellykket hvis nålen lett trenger inn i beinet uten å knase.
    2. Klipp den avkalkede vertebrale kolonnen og tilhørende strukturer i blokker som passer i en vevkassett. Dehydrer gjennom graderte etanoler etterfulgt av et d-limonenbasert løsningsmiddel som beskrevet i trinn 2.1.2-2.1.7. Bygg inn parafin og lag 4-5 μm seksjoner som beskrevet i trinn 2.1.7-2.2.1. Utfør H&E-flekker som beskrevet i trinn 2.2.2-2.2.9; La monteringsmediet stivne over natten.

3. Identifiser potensielle pleksiforme nevrofibromer og utfør spesielle flekker for å bekrefte diagnoser

MERK: Vi anbefaler på det sterkeste å inkludere en erfaren human- eller veterinærpatolog i evalueringen av H&E og spesielle flekker av GEM-tumorseksjoner.

  1. Undersøk H&E-fargede lysbilder utarbeidet som beskrevet ovenfor ved hjelp av brightfield-mikroskopi for å identifisere potensielle perifere nerveskjede svulster. Siden nevrofibromer og MPNST oppstår i perifere nerver, er det viktig å avgjøre om mikroskopiske svulster er assosiert med en perifer nerve. Identifiser blokker med potensielle perifere nerveskjede svulster, slik at immunflekker og andre spesielle flekker kan utføres for å bekrefte eller avkrefte diagnoser.
  2. Skille potensielle PNer fra MPNSTs/andre høygradige neoplasmer basert på histologiske trekk sett under brightfield-undersøkelse av H&E-fargede seksjoner. Humane PN er mildt hypercellulære neoplasmer som hovedsakelig består av celler med langstrakte, ofte bølgete kjerner. I mange områder er cellene løst pakket og kan skilles av myxoid ekstracellulært materiale; PN i P 0-GGFβ3 mus har et lignende utseende. Mitoser er vanligvis ikke til stede; hvis de er og svulsten er moderat til svært hypercellulær, er svulsten en MPNST eller en annen type høyverdig neoplasma (se nedenfor).
  3. PN er sammensatt av en blanding av neoplastiske Schwann-celler og andre ikke-neoplastiske celletyper som mastceller. For å bekrefte identiteten til et PN, utfør immunflekker for Schwann-cellemarkørene S100β og Sox10 og mastcellemarkøren CD117 (c-Kit) på seksjoner fra blokker som inneholder potensielle PNer identifisert ved H&E-undersøkelse (se pkt. 3.4 for alternative alternativer for farging av mastcellemarkører). Utfør Ki67 immunoflekker for å bekrefte lave proliferasjonshastigheter.
    MERK: Tabell 1 viser antigenmarkørene som brukes til rutinemessig identifisering av GEM plexiforme nevrofibromer (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnosen MPNST og for en fullstendig vurdering av andre celletyper som er tilstede i nevrofibromer; vi flekker for disse sistnevnte antigenene bare når vi først beskriver en ny GEM-modell. Se antistoffprodusentens datablad for anbefalte forhold. Legg merke til om antistoffprodusentens innlegg anbefaler antigenuthenting; Ikke alle antigener krever gjenfinning for å kunne påvises.
    1. Forbered 4-5 μm seksjoner fra de valgte parafinblokkene og monter dem på positivt ladede lysbilder. Deparaffiniser seksjoner som beskrevet i trinn 2.2.2-2.2.6.
    2. Skyll seksjoner med 1x PBS i 3-5 min.
    3. Hvis antistoffprodusenten anbefaler antigenhenting, må du forberede citratbuffer. Kombiner 9 ml sitronsyreoppløsning (10,5 g sitronsyre i 500 ml destillert vann) og 41 ml natriumcitratoppløsning (14,7 g natriumsitrat i 500 ml destillert vann).
    4. Utfør antigenhenting ved å plassere lysbilder i citratbuffer i 20 minutter i en oppvarmet riskoker.
    5. Transfer glir inn i 3% hydrogenperoksid / 1x PBS i 10 minutter for å eliminere peroksidaseaktivitet i vevet.
      MERK: Gjør denne løsningen frisk hver gang og ikke bruk stamløsningen av hydrogenperoksid hvis den er eldre enn 3-4 måneder.
    6. Skyll seksjoner i 1x PBS.
    7. Blokkseksjoner som bruker blokkeringsbuffer (2% BSA, 0,1% Triton X-100 i 1x PBS) i 1 time. Skyll lysbildene kort i 1x PBS.
    8. Legg primære antistoff til vev seksjoner. Klargjør primære antistoffer i fortynnet blokkeringsbuffer. Inkuber lysbilder i 2 timer ved 37 oC eller over natten ved 4 oC.
    9. Vask lysbildene i 1x PBS i 5 min. Gjenta 3x.
    10. Inkuber vev med biotinylert sekundært antistoff i 1-2 timer.
    11. Forbered diaminobenzidin (DAB) -løsning basert på produsentens protokoll og senk lysbildene i løsningen i 2-10 minutter. Vask sklier i vann i 5 min.
    12. Motflekkseksjoner ved å senke dem i hematoksylin i 10-15 minutter. Utsett for rennende vann til det renner klart. Dypp raskt glidninger i alkohol og skyll sklier i vann.
    13. Dehydrer lysbilder i graderte etanoler ved raskt å dyppe lysbilder, 4-5x per løsning, i 70% etanol, 95% etanol og deretter 100% etanol. Inkuber lysbilder i et d-limonenbasert løsningsmiddel i 2 minutter. Inkuber lysbilder i en andre batch av d-limonenbasert løsningsmiddel i 2 minutter.
    14. Monter lysbilder med et xylenbasert monteringsmedium.
    15. Undersøk lysbilder ved hjelp av lysfeltmikroskopi.
    16. For immunfluorescens, utelat trinn 3.3.10-3.3.15. I stedet inkuberer vev med artsspesifikt sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer i 1-2 timer.
    17. Skyll lysbildene i 1x PBS i 5 min. Gjenta 3x.
    18. Monter lysbilder med 1x PBS / glyserol.
    19. Undersøk lysbilder ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
  4. Alternativ metode for farging av mastceller: toluidinblå farging
    1. Forbered toluidinblå stamoppløsning ved å oppløse 1 g toluidinblå O i 100 ml 70% etanol.
    2. Klargjør 1% natriumklorid (NaCl) oppløsning ved å oppløse 0,5 g NaCl i 50 ml destillert vann. Bland for å oppløse. Juster pH til ca. 2,0-2,5 ved bruk av HCl.
      MERK: Denne NaCl-løsningen må gjøres frisk hver gang flekker utføres.
    3. Forbered toluidinblå arbeidsløsning ved å tilsette 5 ml toluidinblå stamoppløsning til 45 ml av 1% NaCl-oppløsningen. Bland godt og sørg for at pH er ca. 2,3.
      MERK: En pH høyere enn 2,5 vil resultere i farging med mindre metakromasi. Gjør denne løsningen frisk hver gang farging utføres.
    4. Deparaffiniser 4-5 μm seksjoner montert på positivt ladede lysbilder som beskrevet i trinn 2.2.2-2.2.6. Vask deparaffiniserte seksjoner i rennende vann i 2 minutter.
    5. Flekkseksjoner i toluidinblå arbeidsløsning i 2-3 minutter. Vask i destillert vann i 2 min.
    6. Dehydrer seksjoner ved å dyppe 10x i 95% etanol. Dip glir i 100% etanol 10x. Dip glir i fersk 100% etanol 10 ganger til.
    7. Inkuber lysbilder i et d-limonenbasert løsningsmiddel i 2 minutter. Inkuber lysbilder i en andre batch av d-limonenbasert løsningsmiddel i 2 minutter.
    8. Monter deksler med et xylenbasert monteringsmedium mens lysbildet fortsatt er vått med et d-limonenbasert løsningsmiddel.
      MERK: Ikke bruk et vannbasert monteringsmedium.
    9. Undersøk lysbilder ved hjelp av lysfeltmikroskopi. Identifiser mastceller ved tilstedeværelse av mørke lilla granulater i deres cytoplasma. Andre celletyper er farget lyseblå.

4. Spesielle flekker for å diagnostisere MPNST og utelukke alternative diagnoser

  1. Det histologiske utseendet til humane MPNST er svært variabelt, og flere forskjellige tumortyper har et utseende som ligner på MPNST28. Siden MPNST er avledet fra Schwann-cellelinjen, må du avgjøre om svulsten oppstår fra en perifer nerve eller innenfor en eksisterende godartet PN ved grov undersøkelse eller brightfield mikroskopisk undersøkelse av H &E-fargede seksjoner. Selv om MPNST noen ganger ikke er funnet i forbindelse med en perifer nerve eller PN (vanligvis på grunn av utilsiktet separasjon fra nerven under disseksjon, ødeleggelse av eksisterende PN via MPNST-overvekst, eller fordi lesjonen er metastatisk), se etter foreningen av svulsten med en nerve eller PN, da diagnosen er mindre sannsynlig hvis svulsten ikke er forbundet med en nerve eller PN.
  2. Forbered 4-5 μm seksjoner fra parafinblokker som inneholder potensielle MPNSTer og monter dem på positivt ladede lysbilder som beskrevet i trinn 2.2.1. Deparaffiniser seksjoner som beskrevet i trinn 2.2.2-2.2.6.
  3. Utfør immunhistokjemi med antistoffpanelet angitt i tabell 2 som beskrevet i trinn 3.3.1-3.3.15.
  4. Undersøk immunflekkene ved lysfeltmikroskopi. Siden MPNST viser schwannian differensiering, se etter jevn eller flekkvis immunoreaktivitet for S100β, nestin og Sox10. Hvis svulstene ikke er positive for disse tre markørene, se tabell 2 for å stille diagnosen.
    MERK: MPNST for mennesker og mus kan demonstrere divergerende differensiering. For eksempel viser noen humane MPNST fokal rabdomyoblastisk differensiering (disse variantene er kjent som ondartede Triton-svulster); Selv om disse neoplasmene vil flekke for Schwannian markører, uttrykker de også muskelmarkører som desmin, MyoD1 og myogenin. Immunoreaktivitet for disse sistnevnte markørene bør ikke fraråde forskere fra å diagnostisere svulsten som en MPNST. Selv om det er etablert flere musemodeller som betinget uttrykker SS18-SSX-fusjonsgenet for å modellere synovial sarkompatogenese29, er synoviale sarkommodeller som spontant genererer ekvivalent fusjonstranskript så vidt vi vet, ikke kjent. Følgelig ser vi ikke etter SS18-SSX fusjonstranskripsjoner i GEM-svulster og stoler i stedet på immunhistokjemiske profiler.

5. Gradering av MPNSTs

  1. Bestem om tumornekrose, et kjennetegn ved WHO grad IV MPNST, er tilstede. For grad IV MPNST, se etter fremtredende hypercellularitet, rask mitotisk aktivitet (≥4 mitoser per 10 felt med høy effekt (40x) og cytologisk atypi.
    1. Hvis nekrose ikke er tilstede, vurder svulsten for å avgjøre om hypercellularitet, rask mitotisk aktivitet og cytologisk atypi er tilstede. Hvis alle disse funksjonene er tilstede i fravær av nekrose, grader svulsten som en WHO grad III MPNST.
    2. WHO grad II svulster er preget av cellularitet som er økt, men i mindre grad enn WHO grad III og IV MPNSTs. Kjernene til tumorceller i en WHO grad II MPNST viser økt størrelse (mer enn 3x størrelsen på tumorcellekjernene i nevrofibromer) og hyperkromasi. Økt mitotisk aktivitet (<4 mitoser per 10 høyeffektfelt) er assosiert med, men ikke et krav til, WHO grad II-svulster.
      MERK: Siden høyere gradige svulster vanligvis utvikler seg fra lavere karakterer, kan lavverdige og høyverdige regioner være tilstede i samme MPNST. I denne omstendigheten bestemmes svulstens karakter av den høyeste grad som er tilstede.
      MERK: Det er kontrovers blant menneskelige patologer om hvorvidt WHO-graderingssystemet beskrevet ovenfor er prediktivt for pasientutfall, og noen av disse patologene foretrekker i stedet å bare klassifisere MPNST som lavgradig eller høygradig. Under denne ordningen har høygradige MPNST fremtredende cytologisk atypi, rask mitotisk aktivitet (>5 mitoser per 10 høyeffektfelt) og markert hypercellularitet med eller uten nekrose. Lavgradige MPNST mangler nekrose, men viser mitotisk aktivitet, cytologisk atypi og cellularitet som er mellomliggende mellom en høygradig MPNST og en atypisk nevrofibromatøs neoplasma med ukjent biologisk potensial (ANNUBP). Vi foretrekker systemet beskrevet ovenfor fordi det kan være utfordrende for etterforskere som ikke har lang erfaring med disse enhetene å skille mellom et annubp og et lavgradig MPNST.

6. Fremstilling av kulturer av tidlig passasje P 0-GGFβ3 MPNST-celler

  1. Dyrkning tidlig passasje P 0-GGFβ3 tumorceller fra fersk tumor stykke 2 (trinn 1.5, figur 1A). Oppretthold sterile forhold fra dette punktet fremover.
    1. Dissosiere svulsten ved å kutte den i små (2-4 mm) biter og hakke i DMEM10 (Dulbeccos minimale essensielle medium) som inneholder 10% føtal kalveserum, 2 μmol / L forskolin og 10 nmol / L neuregulin 1β (NRG1β) i 100 mm vevskulturretter.
    2. La celler vokse ut fra hakkede vevsfragmenter ved 37 oC i 5% CO2 til platene er sammenflytende. Bytt media hver 3-4 dag.
    3. Del cellekulturen. Fjern mediet fra 100 mm tallerkenen og vask cellene med PBS; Fjern og kast hakket vev. Fjern PBS og tilsett 1 ml 0,25% trypsin i 2-5 min ved romtemperatur. For å fremme celleavløsning, trykk forsiktig på platen og se etter løsrivelse ved hjelp av et lysmikroskop; utvide trypsininkubasjon etter behov.
    4. Nøytraliser trypsin ved å legge til 2 ml DMEM10. Overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør og pelletsceller ved 500 × g i 5 minutter. Fjern mediet og tilsett 5 ml fersk DMEM10 til pelleten.
    5. Fordel cellesuspensjonen i to til fire 100 mm fat som inneholder DMEM10. Ikke del cellene i mer enn fem passasjer (trinn 6.1.3 og 6.1.4) og vedlikehold dem i DMEM uten forskolin og NRG1β. Husk å fryse ned celler ved passasje 2 for fremtidig bruk.

7. Verifisere identiteten til MPNST-celler i tidlig passasje ved immuncytokjemi

  1. Plasser sterile 18 mm #1.5 runde glassdeksler i brønnene til 6-brønns sterile vevskulturretter.
    1. Plasser poly-L-lysin / lamininoppløsning i brønnene i et volum som er tilstrekkelig til å dekke dekkslippet. Forsegl platen med plastfolie for å minimere fordampning. Inkuber ved 4 °C over natten. Neste morgen vasker du dekslene 3x med steril PBS.
      MERK: Vi har forsøkt å plate MPNST-celler med tidlig passasje på ubelagte deksler og har funnet ut at cellene ikke fester seg godt i fravær av poly-L-lysin / lamininbelegg.
    2. Plate 10.000 celler på dekselet ved forsiktig å legge 2 ml av cellesuspensjonen i vekstmedier inn i hver brønn som inneholder dekselet. Inkuber platene over natten ved 37 °C med 5% CO2 i en vevskulturinkubator.
    3. Neste morgen, skyll dekslene i 2 x 5 min med PBS.
    4. Fest celler med 4% paraformaldehyd i PBS i 18 minutter ved romtemperatur.
    5. Skyll dekslene 3 x 5 min med PBS. Hvis ønskelig, forsegl platen med plastfilm og oppbevar den ved 4 °C på dette tidspunktet.
    6. Lag fersk 50 mM NH4Cl i PBS. Slukk aldehyder ved å inkubere dekkslipp i 50 mM NH4Cl i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
    7. Permeabiliser cellene ved å inkubere dekkslips i 0,3% Triton X-100 i PBS i 15 minutter ved romtemperatur. Vask dekklapper i 3 x 5 min med PBS.
    8. Blokker uspesifikk binding ved å inkubere dekkslips i blokkerende buffer (1x PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin, 0,2% fettfri tørrmelk og 0,3% Triton X-100) i 1 time ved romtemperatur.
    9. Fjern blokkeringsbufferen og legg til primære antistoffer som gjenkjenner MPNST-markørene som er tilstede i modertumoren (vanligvis S100β, Nestin og Sox10) fortynnet til den forhåndsbestemte optimale fortynningen i blokkeringsbufferen. Pakk platen inn med plastfilm og rug ved 4 °C over natten i et fuktet kammer.
    10. Vask 3 x 5 min med PBS for å fjerne ubundet primærantistoff. Tilsett fluorescerende merket sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Beskytt mot lys.
    11. Vask 3 x 5 min med PBS. Inkuber deksler i 1-5 μg Hoechst-fargestoff i 10 minutter. Fortsett å beskytte mot lys.
    12. Vask dekklapper med PBS i 5 min. Monter lysbilder med 1: 1 1x PBS / glyserol. Bilde med fluorescerende mikroskop.

8. Allograft av tidlig passasje tumorceller for å demonstrere tumorigenisitet

  1. Vokse tidlig passasje P 0-GGFβ3 MPNST celler i DMEM10 til 80% konfluens. Skyll cellene en gang med romtemperatur Hanks 'balansert saltløsning (HBSS). Behandle celler i 30 s til 1 min med en ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning for å fjerne dem fra substratet. Tilsett 5 ml DMEM10 per 1 ml av et ikke-enzymatisk celledissosiasjonsreagens.
    MERK: Cellulær dissosiasjon kan ta mye lengre tid, opptil 10-20 minutter. Se produsentens protokoll.
    MERK: Ikke dyrk celler til sammenløp, da dette vil redusere grafteffektiviteten.
    1. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer. Spinn celler ned ved 5 × g i 5 minutter og resuspender dem i en konsentrasjon på 1-2 × 106 celler per 100 μL DMEM10. Oppbevar cellene på is til de er klare for injeksjon.
    2. Bedøv NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) mus i induksjonskammeret til en isofluran fordamper. Plasser dyret på magen og steriliser injeksjonsstedet med 70% etanol. La stedet lufttørke før injeksjon. Før injeksjon, la cellene komme til romtemperatur.
    3. Injiser 1-2 x 106 celler subkutant i høyre flanke. Plasser musen alene i et sengetøyfritt bur og la den komme seg. Forsikre deg om at bare en del av buret er på en varmepute for å forhindre hypotermi. Dette gir en sone som musen kan bevege seg til hvis den blir overopphetet.
      MERK: Vi poder minst tre mus med hver tidlig passasjekultur, da noen transplantater kanskje ikke tar.
    4. La transplantatet vokse i 15-60 dager; Vurder dyrehelse 3x ukentlig og registrer kroppstilstandspoeng, inkludert vekt og atferdsendringer ved hver undersøkelse. Avslutt mus som har nådd maksimalt tillatt graftstørrelse eller døende mus ved bruk av karbondioksideutanasi etterfulgt av cervikal dislokasjon. Rekordalder ved død i dager. Etter hvert som svulster blir eksternt synlige, registrer tumordimensjoner (lengde, bredde og høyde).
      MERK: Vår erfaring er at ulike MPNST-kulturer i tidlig passasje grafses med varierende effektivitet og varierer i tiden som kreves for graftvekst. Dyr må ikke tillates å fortsette forbi den IACUC-godkjente maksimalt tillatte tumorstørrelsen og/eller humane endepunktet.
  2. Høst svulsten, fikser den i 4% paraformaldehyd, legg den inn i parafin, og utfør H&E-flekker som beskrevet i pkt. 2.1-2.2.9 for å bekrefte at allograft er en svulst i stedet for et reaktivt vev. Om nødvendig, immunflekk transplantatet for markørene som var tilstede i modertumoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerer eksempler på grovt tydelige svulster som oppstår i P 0-GGFβ3-mus. Svulster som er lett identifiserbare med det blotte øye, kan ses som masser som strekker seg mot kroppsregioner som vist i figur 2A (pil). Ved avgjørelse av om neoplasma er potensielt en perifer nerveskjede svulst, er det viktig å fastslå at svulsten er assosiert med en perifer nerve. I dette tilfellet viser en MR-undersøkelse (figur 2B) at svulsten er assosiert med isjiasnerven (pilspiss); Denne foreningen ble bekreftet etter å ha avlivet musen og dissekert svulsten. Det skal bemerkes at en stor størrelse ikke nødvendigvis indikerer at svulsten er ondartet. I dette tilfellet viste histologisk undersøkelse av svulsten (figur 2C) at det var et nevrofibrom. Vanligst, men grovt tydelig svulster er ikke identifisert før du utfører nekropsi av musen. Figur 2D illustrerer en stor, kjøttfull MPNST som oppsto innenfor plexus brachialis hos dette dyret.

Figur 3 illustrerer representative eksempler på MPNST og nevrofibromer fra P 0-GGFβ3 mus fremstilt i henhold til prosedyrene beskrevet i protokollavsnitt 1. Figur 3A-J illustrerer ti eksempler på uavhengig oppstått MPNST fra vår P0-GGFβ3 musekoloni. Merk at det histologiske utseendet til MPNST kan være svært variabelt, selv mellom MPNST som oppstår uavhengig av hverandre i samme dyr. Denne histologiske variabiliteten illustrerer hvorfor vi rutinemessig bekrefter diagnosen P 0-GGFβ3 MPNST med immunhistokjemiske flekker. Vi vil også påpeke at andre, tilsynelatende ikke-relaterte tumortyper forekommer sporadisk med lav frekvens i noen innavlede musestammer (f.eks. Vi har flere ganger møtt lymfomer i P 0-GGFβ3-mus som bærer transgenet på en C57BL/6J-bakgrunn), noe som ytterligere understreker viktigheten av å bruke immunhistokjemi for å bekrefte tumordiagnoser. Til tross for variasjonen i histologisk utseende var alle de ti svulstene illustrert i figur 3A-J immunoreaktive for S100β og nestin og negative for markører for andre tumortyper. Figur 3K illustrerer et representativt bilde av en riktig avkalket virvelsøyle og tilhørende vev. Legg merke til at ryggmargen, nerverøttene, vertebrallegemet og skjelettmuskulaturen alle opprettholder sitt riktige anatomiske forhold til hverandre. Figur 3L er et bilde med høyere effekt av virvellegemet og overliggende ryggmarg. Siden dette vevet er riktig avkalket, har beinet kuttet lett uten makulering eller folding, og benmargen er lett identifiserbar i margrommene. Hvis vevet ikke hadde blitt avkalket ordentlig, ville det ha fanget på mikrotombladet og blitt revet ut av seksjonen, noe som gjør betydelig skade på tilstøtende vev (ryggmarg, spinalnerverøtter og skjelettmuskulatur. Figur 3M presenterer et representativt bilde av et nevrofibrom som oppstår i en dorsalnerverot i en P 0-GGFβ3-mus. Merk at denne svulsten er mindre cellulær enn MPNST vist i figur 3A-J. Nøkkeldiagnosen for nevrofibromer er at de består av en kompleks blanding av neoplastiske Schwann-celler og ikke-neoplastiske mastceller, makrofager, fibroblaster og perineurial-lignende elementer som infiltrerer nerven og sprer axoner fra hverandre.

Figur 4 illustrerer eksempler på de flekkene som er mest nyttige for den første identifiseringen av et pleksiformt nevrofibrom og skille mellom et pleksiformt nevrofibrom og et MPNST. Figur 4A illustrerer S100β immunoreaktivitet i et P 0-GGFβ3 plexiform nevrofibrom. Merk at S100β immunoreaktivitet bare er tydelig i en underpopulasjon av celler, noe som er i tråd med det faktum at nevrofibromer består av en blanding av neoplastiske Schwann-celler og andre ikke-neoplastiske elementer (fibroblaster, mastceller, makrofager, perineurial-lignende celler, en dårlig definert CD34-immunoreaktiv cellulær populasjon og vaskulatur). Dessverre skiller ikke flekkvis S100β-farging mellom pleksiforme nevrofibromer og MPNST-er, da S100β-farging kan være ujevn i MPNST (H&E-farging er nyttig for dette formålet, men siden MPNST vanligvis er mer cellulære enn pleksiforme nevrofibromer [se figur 3]). Neoplastiske Schwann-celler er også immunoreaktive for det mellomliggende filamentnestinet som vist i P 0-GGFβ3 MPNST presentert i figur 4B. Neoplastiske Schwann-celler viser også ofte nukleær immunreaktivitet for transkripsjonsfaktoren Sox10, som vist i en MPNST i figur 4C. Funksjoner som er nyttige for å skille mellom pleksiforme nevrofibromer og MPNST er tilstedeværelsen av mastceller og fremtredende immunoreaktivitet for Ki67-proliferasjonsmarkøren. Figur 4D illustrerer en Unna-flekk utført på et P 0-GGFβ3 plexiform nevrofibrom for å markere tilstedeværelsen av mastceller, som lett kan identifiseres ved den fremtredende metakromatiske fiolette fargingen av deres cytoplasmatiske granulater. Mastceller er ikke tilstede i MPNST. I motsetning til dette er Ki67-immunoreaktivitet praktisk talt ikke-eksisterende i pleksiforme nevrofibromer som vist i P 0-GGFβ3-svulsten vist i figur 4E. Nukleær Ki67-merking er vanligvis tilstede i en svært høy brøkdel av tumorceller som sett i mikroskopisk MPNST som oppstår i trigeminalganglion av en P 0-GGFβ3-mus (figur 4F).

Figur 5 illustrerer eksempler på flekker som vi utfører for å fullt ut karakterisere den cellulære sammensetningen av nevrofibromer i en nyutviklet GEM-modell. Selv om flekkene vist i denne figuren ble oppnådd i humane dermale nevrofibromer, er de identiske i utseende med det vi har sett i GEM-svulster. Immunoreaktivitet for CD117 (c-Kit) er tilstede i mastceller i nevrofibromer og har dermed en fordeling som er svært lik den man ser med Unna-flekker (se figur 3A). Makrofager er også til stede spredt gjennom nevrofibromer, som sett med panmakrofagmarkøren Iba1 (se figur 5D); Dette inkluderer underklasser av makrofager som er immunreaktive for CD163 og CD86 (se henholdsvis figur 5B og figur 5C). En brøkdel av Schwannian-elementet i nevrofibromer demonstrerer også nukleær immunoreaktivitet for Sox10. Fibroblaster kan fremheves av deres immunoreaktivitet for TCF4. I figur 5G merker CD31 de vaskulære elementene i nevrofibromet, mens CD34, demonstrert i figur 5H, merker en gåtefull dendritisk populasjon av celler som har blitt foreslått å være enten en underpopulasjon av bosatt vevsmakrofager30 eller en ny populasjon av nerveskjede celler som verken er Schwann-celler eller fibroblaster31.

Figur 6 er inkludert for å muliggjøre sammenligning av humane pleksiforme nevrofibromer og MPNST med svulstene sett i P 0-GGFβ3-mus og for å gi representative eksempler på noen av de humane tumortypene som kan forveksles med MPNST. Figur 6A illustrerer et pleksiformt nevrofibrom som oppsto i plexus brachialis hos en NF1-pasient, mens figur 6B presenterer WHO grad IV MPNST som oppsto innenfor det samme pleksiforme nevrofibromet. Figur 6B viser noen av de karakteristiske trekkene ved en WHO grad IV MPNST, inkludert markert hypercellularitet og cellulær atypi, rask mitotisk aktivitet og tumornekrose. Til sammenligning viser figur 6C en WHO grad II MPNST som har signifikant cellulær atypi, men er mindre hypercellulær enn grad IV MPNST, og selv om mitoser er tilstede, viser mindre mitotisk aktivitet. Figur 6D illustrerer et fibrosarkom med sitt karakteristiske "fiskebein" mønster av sammenflettede skjeder av tumorceller. Dette mønsteret skiller ikke nødvendigvis mellom fibrosarkomer og MPNSTs, men fordi noen MPNSTs vil ha et lignende mønster. Videre viser utsikten med høyere effekt presentert i figur 6E cellulær morfologi som ligner den som er sett i WHO grad IV MPNST presentert i figur 6B. Figur 6F illustrerer et leiomyosarkom. I motsetning til de fleste MPNSTs, er leiomyosarcomas immunoreaktive for muskelmarkører som glatt muskelaktin og desmin. Immunreaktivitet mot glatt muskulaturaktin kan imidlertid variere fra svulst til svulst, med noen svulster som viser intens jevn immunoreaktivitet (figur 6G) og andre som viser immunreaktivitet som viser cellulær variabilitet i svulsten (figur 6H). Desmins immunreaktivitet kan også være flekkvis ved leiomyosarkomer (figur 6I). Melanom er svært variable i morfologi, med noen svulster som består av polygonale celler (figur 6J) og andre består av spinklede celler som kan etterligne morfologien til MPNST-celler. Melanom kan skilles fra MPNST ved immunreaktivitet for melanosommarkører som MART1 (figur 6K). Imidlertid er melanomer, som MPNST, ofte positive for S100β og Sox10 (figur 6L).

Figur 7 illustrerer patologiske trekk ved WHO grad II, III og IV MPNST isolert fra P0-GGFβ3-mus. Figur 8 viser representative bilder av tidlig passasje P 0-GGFβ3 MPNST-celler ved lav (figur 7A) og høy (figur 7B) effekt. Tumorgenisiteten til disse cellene demonstreres både ved deres evne til å danne kolonier når de suspenderes i myk agar (figur 7C) og for å danne transplantater når de allograferes subkutant i immundefekte mus (figur 7D).

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt brukt til å behandle tumor og annet vev fra P 0-GGFβ3 mus. (A) Grovt synlige svulster høstes og segmenteres i tre porsjoner for 1) fiksering i 4% paraformaldehyd etterfulgt av immunhistokjemi og histokjemi, 2) etablering av tidlig passasje tumorcellekultur og / eller genomiske analyser, og 3) snap-frysing ved bruk av flytende nitrogen for protein-, DNA- eller RNA-isolasjon. (B) Etter eksisjon av svulsten er musens kropp festet i 4% paraformaldehyd og de indre organene fjernes. Disse organene blir samplet for histologisk undersøkelse utført for å identifisere mikroskopiske bevis på neoplasma og andre patologiske prosesser. (C) Etter fjerning av indre organer fjernes ekstremitetene (hode, lemmer, hale) og hud fra. Virvelsøylen, tilstøtende ribber og tilstøtende skjelettmuskulatur avkalkes ved hjelp av 0,3 M EDTA/4 % paraformaldehyd (pH 8,0). Det avkalkede vevet blir deretter parafininnebygd og deler av vevet fremstilt for immunhistokjemisk og histokjemisk undersøkelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative bilder av grovt tydelige nevrofibromer og MPNST i P 0-GGFβ3 mus. (A) P 0-GGFβ3 mus med en stor grovt tydelig svulst på høyre flanke (pil). (B) En MR-skanning av denne musen viser at svulsten er koblet til isjiasnerven (pilspiss) og at den har vokst gjennom den overliggende fascia for å utvide seg i subkutan (pil, bulktumormasse). (C) Mikroskopisk undersøkelse av denne svulsten viser at, til tross for sin store størrelse, er svulsten et nevrofibrom. (D) Stor kjøttfull MPNST som oppsto i plexus brachialis på en P 0-GGFβ3-mus. Skala bar = 100 μm. (C). Forkortelser: MPNST = ondartede perifere nerveskjede svulster; MR = magnetisk resonansavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Representative bilder av MPNST, avkalket virvelsøyle og nevrofibromer fremstilt som beskrevet i protokollavsnitt 1. (VG Nett) Utskåret og H&E-farget P 0-GGFβ3 MPNST viser histologisk variabilitet. Alle bilder oppstår uavhengig av hverandre. Til tross for denne histologiske variabiliteten viste alle disse svulstene passende merking for MPNST-markørene angitt i tabell 1. Skalastenger = 200 μm. (K) Representativt bilde av et H&E-farget tverrsnitt av den avkalkede virvelsøylen. I dette bildet er følgende strukturer lett visualisert: ryggmargen; vertebral bein; dorsalrotganglia på dorsal spinal nerverot; og paravertebral skjelettmuskulatur. Forstørrelse 4x. (L) Et bilde med høyere effekt av ryggmargen og ryggvirvelen vist i K viser riktig utseende av bein etter avkalkning med denne metoden. Forstørrelse 10x. (M) Representativt bilde av en dorsal nerverot nevrofibrom i en P 0-GGFβ3 mus. Forstørrelse 40x. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: MPNST = ondartede perifere nerveskjede svulster; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Diagnostisk flekk brukt for første identifisering av pleksiforme nevrofibromer og deres skille fra MPNST. (A) Immunflekker for S100β i et P 0-GGFβ3 plexiform nevrofibrom. Merk at intens brunfarging for dette antigenet bare er tilstede i en delmengde av celler i denne svulsten, i samsvar med det faktum at nevrofibromer er sammensatt av neoplastiske Schwann-celler og flere andre ikke-neoplastiske celletyper. (B) Immunfluorescensbilde av en P 0-GGFβ3 MPNST farget for mellomliggende filamentnestin (rød) og motfarget med bisbenzimid (blå, kjernefysisk flekk). (C) MPNST farget for transkripsjonsfaktoren Sox10. Intens immunoreaktivitet (brun) er tydelig i kjernene til en delmengde av tumorceller. (D) Høyeffektvisning av et P 0-GGFβ3 plexiform nevrofibrom etter en Unna-flekk. Denne flekken produserer metakromatisk (fiolett) farging av granulatene i mastceller. Plexiforme nevrofibromer kan skilles fra MPNST fordi sistnevnte mangler mastceller. (E,F) Ki67 immunhistokjemi i (E) a P 0-GGFβ3 plexiform nevrofibrom og (F) a P0-GGFβ3 MPNST. Begge seksjonene har blitt motfarget med hematoksylin (blå nukleær farging), med Ki67 immunoreaktivitet som er tydelig som brun nukleær farging i disse immunoperoksidaseflekkene. Merk at ingen brun kjernefysisk farging er tydelig i pleksiform nevrofibrom, mens de fleste tumorcellekjernene er positive i MPNST. Skalastenger = 100 μm. Forkortelse: MPNST = ondartet perifer nerveskjede svulst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder av immunflekker brukt til å identifisere subpopulasjoner av celler som komponerer nevrofibromer. Disse immunfluorescerende bildene fra et humant dermalt nevrofibrom har blitt farget for (A) CD117 (c-Kit; en markør for mastceller), (B) CD163 (M2 makrofager), (C) CD86 (M1 makrofager), (D) Iba1 (panmakrofagmarkør), (E) Sox10 (Schwann-cellemarkør), (F) TCF4 (fibroblastmarkør), (G) CD31 (markør for vaskulatur) og (H) CD34 (markerer en distinkt, dårlig forstått subpopulasjon av celler i nevrofibromer). Forstørrelse 60x, skala barer = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative bilder av pleksiforme nevrofibromer, MPNST og noen andre humane tumortyper som vurderes i differensialdiagnosen til en MPNST. (A) Plexiform nevrofibrom som oppstår i plexus brachialis hos en NF1-pasient, som viser den generelle lavere cellulariteten og godartet utseende av denne neoplasma. Selv om det ikke er lett visualisert i H&E-fargede seksjoner, er en kompleks blanding av celletyper til stede. Mitoser er ikke sett. Forstørrelse: 40x. (B) En WHO grad IV MPNST som oppsto fra pleksiform nevrofibrom illustrert i A. Legg merke til den mye høyere grad av cellularitet. Pilen indikerer en mitotisk figur, og stjernen angir et område av tumornekrose i øvre høyre del av dette mikroskopiske feltet. Forstørrelse: 40x. (C) A WHO grad II MPNST. Denne svulsten har en lavere grad av cellularitet enn WHO grad IV MPNST illustrert i B. Imidlertid er det mer nukleær atypi og hyperkromasi enn det som er tydelig i pleksiform nevrofibrom illustrert i A. Pilen indikerer en av de sporadiske mitotiske figurene som ble oppdaget i denne neoplasma. Forstørrelse: 63x. (D) En lav-effekt visning av en voksen-type fibrosarcoma illustrerer "sildbein" mønster (den sammenvevde skjede av tumorceller) vanligvis sett i denne tumortypen. Dessverre er fiskebensarkitektur også påtruffet i noen humane MPNSTs og kan derfor ikke brukes til å skille mellom fibrosarkomer og MPNSTs. Forstørrelse: 20x. (E) Et høyere effektsyn på fibrosarkom illustrert i D. Legg merke til likheten mellom cellulær morfologi i denne fibrosarkom og cellulær morfologi tydelig i WHO grad IV MPNST vist i B. Forstørrelse: 40x. (F) Høyeffektsbilde av et leiomyosarkom, som demonstrerer cellulær morfologi som faller innenfor variasjonsområdet sett i MPNST. Forstørrelse: 40x. (G) Immunflekker for glatt muskulaturaktin i leiomyosarkom illustrert i F. Merk at tumorcellene viser jevn intens immunoreaktivitet for dette antigenet. Forstørrelse: 40x. (H) Immunflekker for glatt muskulaturaktin i en annen leiomyosarcoma. I denne svulsten er det større variasjon i graden av immunoreaktivitet, med noen celler som farger mer intenst enn andre. Det er ikke uvanlig at immunreaktivitet for det samme antigenet er jevnt tilstede i en svulst og bare er tilstede i en delmengde av tumorceller i en annen neoplasma. Forstørrelse: 40x. (I) Immunostain for desmin i en tredje leiomyosarcoma. I denne svulsten er bare en delmengde av tumorceller intenst immunoreaktiv for dette antigenet. (J) Metastatisk melanom. Melanom er beryktet for å ha svært variabel morfologi som kan variere fra kuboid til spindel; svulster med sistnevnte morfologi er mest sannsynlig å forveksle med MPNST, spesielt gitt at både melanomer og MPNST kan demonstrere S100β og Sox10 immunoreaktivitet. Forstørrelse: 40x. (K) Immunreaktivitet for melanommarkøren MART1 i svulsten illustrert i J. Forstørrelse: 40x. (L) Nukleær immunoreaktivitet for transkripsjonsfaktoren Sox10 i melanom vist i J. Forstørrelse: 40x, skalastenger = 100 μm. Forkortelse: MPNST = ondartet perifer nerveskjede svulst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative bilder av WHO grad II-IV P 0-GGFβ3 MPNSTs. (A) Lav- og (B) fotomikrografer med høy effekt av en WHO grad II MPNST. Merk at cellulariteten er lavere enn WHO grad III MPNST illustrert i panel C og at kjernene til tumorcellene i D er mer hyperkromatiske (mørkere) enn de som er sett i panel B. (C) Lav- og (D) fotomikrografer med høy effekt av en WHO grad III MPNST. Denne svulsten viste >4 mitotiske tall per 10 høyeffektfelt, med celler som var tettere pakket og mer hyperkromatiske, atypiske kjerner. (E) Lav- og (F) høyeffektsvisninger av en WHO-grad IV MPNST. Legg merke til fokuset på nekrose i den nederste midterste delen av panel F. Lav effekt = 20x. Høy effekt = 40x, skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative bilder av tidlig passasje P 0-GGFβ3 MPNST-celler og deres tumorgenisitet som demonstrert ved vekst i myk agar og deres evne til å vokse som allotransplantater. (A) Lav- og (B) høyeffekts fasekontrastbilder av P0-GGFβ3 MPNST-celler i tidlig passasje. (C) P 0-GGFβ3 MPNST-celler dyrket i myk agar og farget med Sudan svart; Koloniene er tydelige som svart puncta i agar. (D) Hematoksylin og eosinfarget bilde av en tumor som ble dannet etter P 0-GGFβ3 MPNST-celler ble allopodet subkutant i en immundefekt mus som beskrevet i protokollen. (E) Spredning av tidlig passasje P 0-GGFβ3 MPNST-celler over en 5-dagers periode som bestemt av et Celigo Image Cytometer. Lav effekt = 10x, høy effekt = 40x; skala bar = 100 μm for alle paneler Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn Bruk Artsreaktivitet/klasse
CD117 Fortynnet kanin monoklonal
CD163 1:200 Mus monoklonl
CD31 1:50 kanin polyklonal
CD34 1:2000 kanin monoklonal
CD86 1:1000 kanin monoklonal
Cytokeratin 1 mikrogram/ml monoklonal mus
Desmin 1:50 monoklonal mus
Iba1 1:500 polyklonal kanin
Ki-67 1:50 kanin monoklonal
MART1 1 mikrogram/ml monoklonal mus
Nestin 1:1,000 monoklonal mus
PMEL 1:100 Rabbot monoklonal
S100B 1:200 kanin polyklonal
SMA 1:100 monoklonal mus
Sox10 1:10 monoklonal mus
TCF4/TCFL2 1:100 kanin monoklonal

Tabell 1 Antistoffer brukt til diagnostisering av pleksiformt nevrofibrom og maligne perifere nerveskjede svulster. Antistoffer som brukes til rutinemessig identifisering av GEM pleksiforme nevrofibromer (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnostisering av MPNST, og en fullstendig vurdering av andre celletyper tilstede i nevrofibromer. Forkortelse: MPNST = ondartet perifer nerveskjede svulst.

S100β Nestin Sox10 MART1 PMEL Desmin Glatt muskel aktin Cytokeratin SS18-SSX fusjon
MPNST 50-90%, vanligvis fokal Positiv1 ~30% Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
Fibrosarkom Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
Leiomyosarkom Sjelden Negativ Negativ Negativ Negativ 50-100% Positiv ~40% Negativ
Epiteloid sarkom Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Negativ
Melanom Positiv Positiv 85% Positiv Positiv Negativ Negativ Negativ Negativ
Monofasisk synovial sarkom ~30% Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Positiv

Tabell 2: Markører brukt til å etablere tumoridentitet hos mennesker. Disse immunhistokjemiske og histokjemiske markørene, sammen med en vurdering av tumormikroskopisk morfologi, brukes til å skille MPNST fra andre neoplasmer som etterligner dem. Differensialdiagnosen som vanligvis vurderes for humant MPNST, inkluderer fibrosarkom av voksen type, epiteloid sarkom, leiomyosarkom, monofasisk synovial sarkom og melanom. Fibrosarkom av voksen type har et fiskebensmønster mikroskopisk og flekk for vimentin, men ikke S100β. Leiomyosarkomer, men ikke MPNSTs, er immunoreaktive for desmin; Leiomyosarcomas har også kjerner med en spesielt stump morfologi. Epiteloide sarkomer, men ikke MPNST, er immunoreaktive for cytokeratin. Melanom, som MPNST, kan være S100β-positive, men er også immunoreaktive for MART-1 og PMEL. Forkortelse: MPNST = ondartet perifer nerveskjede svulst. 1Kombinasjon av S100β og nestin er svært prediktiv for MPNST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De histologiske og biokjemiske metodene som presenteres her, gir et rammeverk for diagnostisering og karakterisering av GEM-modeller av nevrofibrom og MPNST-patogenese. Gjennom årene har vi funnet disse metodene å være ganske nyttige for å vurdere patologien til perifere nerveskjede svulster som oppstår i GEM-modeller 21,25,26. Imidlertid, mens protokollene som er skissert her, er nyttige for å bestemme hvor nøyaktig svulster i GEM-modellene rekapitulerer patologien til deres menneskelige kolleger, er det noen begrensninger for disse strategiene som bør verdsettes. Til å begynne med viser P 0-GGFβ3-mus nesten fullstendig penetrans av deres tumorfenotype, noe som gjør det relativt enkelt å oppnå et stort antall mus med nevrofibromer og MPNST 21,25,26 som kan brukes til genomiske studier og genomskala shRNA-skjermer. Den høye penetransen av fenotypen i denne modellen gjør også P 0-GGFβ3-mus ganske nyttige for prekliniske studier. Det bør imidlertid erkjennes at dette ikke vil være tilfelle for alle GEM-kreftmodeller. Derfor har vi understreket viktigheten av å bestemme brøkdelen av dyr som kan forutsies å utvikle svulster. Når vi arbeider med en dyremodell som mindre vanlig utvikler svulster, har vi funnet det fordelaktig å bruke bildebehandlingsmodaliteter som magnetisk resonansavbildning eller positronutslippstomografi for å definitivt identifisere dyr som bærer svulster som kan inngås i prekliniske studier eller andre studier. Denne tilnærmingen kan imidlertid være kostnadsuoverkommelig hvis det kreves gjentatte skanninger. Derfor understreket vi også viktigheten av å etablere gjennomsnittlig overlevelsestid for GEM-modellen av interesse26-forståelse når et dyr kan forventes å utvikle en svulst reduserer antall skanninger som kreves for å identifisere dyr med ønsket fenotype og tilhørende kostnader.

Det er også viktig å innse at en stor svulst i en mus fortsatt er faktisk en ganske liten mengde vev. I denne protokollen anbefaler vi en prosess der tumorvevet deles inn i tredjedeler, med deler viet til histologi/immunhistokjemi, etablering av tidlige passasjecellekulturer og isolering av biomolekyler (proteiner, RNA, DNA) av interesse. Imidlertid vil tumorstørrelsen variere, og hvis svulsten er ganske liten, kan dette utelukke å ha nok vev til å dele seg på denne måten. I så fall må utprøver avgjøre om tumordiagnose eller annen bruk av tumorvev prioriteres32. Under slike omstendigheter er vår bias at vi må ha en riktig diagnose for å forstå hva vi jobber med før vi går i gang med andre eksperimenter. Vi har funnet at tumordiagnoser vanligvis lett kan etableres ved bruk av mindre enn en tredjedel av svulsten. Når vi arbeider med små svulster, vil vi i stedet vanligvis fjerne et lite fragment av tumorvev, pakke det inn i histologivev og plassere det i en vevskassett for å sikre at vevet ikke går tapt under behandlingen. Ulempen med denne tilnærmingen er at det kan føre til at utprøver undergraderer svulsten hvis WHO-gradering er ønsket; Dette skyldes at lavere og høyere regioner vanligvis sameksisterer i kreft, og hvis en svært liten prøve blir tatt, vil karakteren som er oppnådd, avhenge av hvor tumorprøven ble tatt fra.

Protokollene vi beskriver for å etablere perifer nerveskjede tumoridentitet, er avhengige av immunhistokjemi. Selv om det finnes sporadiske alternative tilnærminger som kan brukes til noen celletyper (for eksempel å utføre Unna-flekker for å identifisere mastceller), er det ikke ensartet sant for de fleste celletyper som er tilstede i nevrofibromer og MPNSTer. Følgelig må det utvises stor forsiktighet for å fastslå at de immunhistokjemiske prosedyrene som skal brukes, er riktig optimalisert. Vår erfaring er at flere problemstillinger kan kompromittere diagnostisk immunhistokjemi. Det er kritisk viktig at etterforskeren utfører en fortynningsserie med et primært antistoff som de ikke har brukt før; I tillegg bør en fortynningsserie utføres ved bruk av en ny batch av et antistoff som tidligere er optimalisert33. Det må også tas hensyn til at ferske partier av reagenser er til stede. Vår erfaring er at hydrogenperoksid og DAB er spesielt utsatt for at de ikke fungerer som de skal, noe som kan føre til at etterforskeren feilaktig bestemmer at flekkene deres er negative.

De immunhistokjemiske profilene som vi beskriver for pleksiforme nevrofibromer, MPNST, og de forskjellige typer neoplasmer som vurderes i differensialdiagnosen av MPNST, er de som vi oftest har møtt 21,25,26,34. Men siden divergerende differensiering ikke er uvanlig ved MPNST og disse andre malignitetene, kan utprøver støte på fargeprofiler som avviker noe fra det vi beskriver her. Disse nyansene er grunnen til at vi sterkt anbefaler at teamet som karakteriserer en ny GEM-modell av tumorigenese, inkluderer en erfaren menneskelig eller veterinærpatolog. I denne protokollen har vi brukt WHO-gradering på GEM og humane MPNST-er. Vi foretrekker dette karaktersystemet fordi karakterkriteriene er relativt veldefinerte og enkle å sammenligne mellom menneske og mus MPNST 2,28. Vi vil imidlertid bemerke at WHOs graderingskriterier ikke er ensartet akseptert av patologer. Dette er fordi det ikke er klart at de tre WHO-karakterene som brukes på MPNST, er prediktive for kliniske utfall hos pasienter. På grunn av dette foretrekker mange patologer å klassifisere MPNST ganske enkelt som lavgradige eller høygradige maligniteter. Ved hjelp av denne tilnærmingen betraktes omtrent 85% av MPNST som høygradige maligniteter karakterisert ved rask mitotisk aktivitet, markert cellulær atypi og hyperkromasi som kan ledsages av tumornekrose. Lavgradige MPNST viser mindre cellularitet, hyperkromasi og mitotisk aktivitet.

Vi har funnet ut at allopoding av MPNST-celler med tidlig passasje er en enkel måte å verifisere tumorgenisiteten til disse kulturene. Noen problemstillinger bør imidlertid vurderes når cellene ikke etablerer allograft32. Vår erfaring er at mens det overveldende flertallet av MPNST-celler med tidlig passasje vil etablere et allotransplantat, har vi av og til støtt på tidlige passasjekulturer som ikke gjør det. Til tross for denne feilen viste array comparative genomic hybridization (aCGH) og whole exome sequencing at disse tidlige passasjekulturene hadde flere genomiske abnormiteter som var forenlige med at de var tumorceller25,26. Vi har også funnet kulturer med tidlig passasje som ikke er sunne, vanligvis fordi kulturene fikk lov til å bli sammenflytende før de ble høstet for poding. Celler skadet av grov håndtering (f.eks. inkubert altfor lenge med ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning pipettert opp og ned for mange ganger) fungerer også dårlig når de blir podet. Vi vil også bemerke at tidspunktene vi har angitt for etablering er et estimat basert på våre erfaringer. Noen ganger har vi støtt på kulturer med tidlig passasje som vil lykkes med å etablere allotransplantater, men det tar lengre tid å gjøre det.

Tilnærmingene som er skissert ovenfor gir et omfattende middel til å karakterisere viktige aspekter ved en nyutviklet GEM-modell av perifer nervesystem-neoplasi og riktig diagnostisere eventuelle nevrofibromer og MPNST som disse dyrene utvikler. Metodene som vi skisserer for å etablere tidlige passasje MPNST-kulturer og bruke disse kulturene for allografting, gir også klare bevis for tumorigenisiteten til neoplasmer identifisert i GEM-modeller. Vi vil understreke at vi ikke utfører utvelgelsen av individuelle kloner når vi etablerer tidlige passasjekulturer. Selv om vi erkjenner at noe utvalg er uunngåelig når man plasserer tumorceller i kulturer, tyder disse første funnene på at mutasjonene identifisert i tidlig passasje GEM MPNST-kulturer forblir svært like de som er tilstede i foreldretumoren. Ved bruk av aCGH har vi imidlertid også funnet ut at fortsatt å bære disse tidlige passasjekulturene for mer utvidede passasjer resulterer i genomiske endringer som begynner å avvike fra det som er sett i de tidligere passasjene i disse tumorcellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 og R01 NS109655 til SLC; R01 NS109655-03S1 til D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 til SLC) og Forsvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086 og W81XWH-12-1-0164 til SLC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Corning Falcon 353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) Vector Laboratories SK-400
6- well plates Corning Costar 3516
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) Invitrogen A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-500
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Caldesmon ABCAM  E89, ab32330
CD117 Cell Marque 117R-18-ASR
CD163 Leica NCL-L-CD163
CD31 ABCAM  ab29364
CD34 ABCAM  ab81289
CD86 ABCAM  ab53004
Cell Scraper Sarstedt 83.183
Cell Stripper Corning 25-056-CI
Circle Coverslip Fisher Scientific 12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) Decon Laboratories 5989-27-5
Critic Acid Fisher Scientific A104-500
Cytokeratin ABCAM  C-11, ab7753
Desmin Agilent Dako  clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution Vector Laboratories SK-4100
DMEM Corning 15-013-CV
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Fetal Calf Serum Omega Scientific FB-01
Forksolin Sigma-Aldrich F6886
Glycerol Sigma-Aldrich G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Hemacytometer Brightline-Hauser Scientific 1490
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific 327-500
Iba1 Wako Chemicals 019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse Vector Laboratories MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit Vector Laboratories MP-7401
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Isopropanol Fisher Scientific A415
Ki-67 Cell Signaling  12202
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015
Liquid Nitrogen
MART1 ABCAM  M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin Millipore  Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta In house Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin Santa Cruz Biotechnology  sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice Jackson Laboratory 5557
Nonfat Dry Milk Walmart Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice In house
Paraffin Wax Leica Paraplast 39601006
Parafilm M Sigma-Aldrich PM-999
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium) Fisher Scientific SP15-100
pH Meter Mettler Toldedo Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) Corning 20-031-CV
PMEL ABCAM  EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) Millipore Sigma 10981100ML
Rice Cooker Beech Hamilton
S100B Agilent Dako  Z0311  (now GA504)
SMA Ventana Medical Systems  clone 1A4
Sodium Chloride Fisher Scientific S640
Sodium Citrate (Dihydrate) Fisher Scientific BP327-1
Sox10 ABCAM  ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
TCF4/TCFL2  Cell Signaling  (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue ACROS Organics 348600050
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
TRIzol Invitrogen 15596026
Trypsin Corning 25-051-31

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 207
Identifisere, diagnostisere og gradere ondartede perifere nerveskjede svulster i genetisk utviklede musemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B.,… More

Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B., Fromm Longo, J., Carroll, S. L. Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models. J. Vis. Exp. (207), e65740, doi:10.3791/65740 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter