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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर की पहचान, निदान और ग्रेडिंग

Published: May 17, 2024 doi: 10.3791/65740
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

Summary

हमने यह आकलन करने के लिए एक पद्धति विकसित की है कि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों में तंत्रिका तंत्र नियोप्लाज्म अपने मानव समकक्षों के विकृति विज्ञान को सटीक रूप से पुन: व्यवस्थित करता है या नहीं। यहां, हम इन हिस्टोलॉजिक तकनीकों, परिभाषित पैथोलॉजिकल मानदंड, और संस्कृति पद्धतियों को न्यूरोफिब्रोमस और पी 0-जीजीएफ β 3 माउस मॉडल में उत्पन्न होने वाले घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर पर लागू करते हैं।

Abstract

ऑटोसोमल प्रमुख ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफाइब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) वाले मरीजों में आमतौर पर प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस (पीएन) विकसित होता है जो बाद में अत्यधिक आक्रामक घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (एमपीएनएसटी) में बदल जाता है। उस प्रक्रिया को समझना जिसके द्वारा एक पीएन एमपीएनएसटी में बदल जाता है, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल की उपलब्धता से सुविधा होगी जो एनएफ 1 के साथ मनुष्यों में देखी गई पीएन-एमपीएनएसटी प्रगति को सटीक रूप से दोहराती है। दुर्भाग्य से, Nf1 पृथक्करण वाले GEM मॉडल इस प्रक्रिया को पूरी तरह से पुन: व्यवस्थित नहीं करते हैं। इसने हमें P 0-GGFβ3 चूहों को विकसित करने के लिए प्रेरित किया, एक GEM मॉडल जिसमें श्वान कोशिकाओं में श्वान सेल मिटोजेन न्यूरेगुलिन -1 (NRG1) की अतिअभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप PNs का विकास होता है जो उच्च आवृत्ति के साथ MPNST बनने के लिए प्रगति करते हैं। हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए कि P 0-GGFβ3 चूहों में ट्यूमरजेनेसिस और नियोप्लास्टिक प्रगति NF1 रोगियों में देखी गई प्रक्रियाओं को सटीक रूप से मॉडल करती है, हमें पहले यह साबित करना था कि P0-GGFβ3 परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर की विकृति उनके मानव समकक्षों की विकृति को पुन: व्यवस्थित करती है।

यहां, हम P 0-GGFβ3 और P0-GGFβ3 का उपयोग करके GEM मॉडल में परिधीय तंत्रिका तंत्र नियोप्लाज्म का सटीक निदान और ग्रेड करने के लिए उपयोग की जाने वाली विशेष पद्धतियों का वर्णन करते हैं; एक उदाहरण के रूप में Trp53+/- चूहे। हम पीएन और एमपीएनएसटी के निदान के लिए उपयोग किए जाने वाले हिस्टोलॉजिक, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोकेमिकल तरीकों का वर्णन करते हैं, इन नियोप्लाज्म को अन्य ट्यूमर प्रकारों से कैसे अलग किया जाए जो उनकी पैथोलॉजी की नकल करते हैं, और इन नियोप्लाज्म को कैसे ग्रेड करें। हम जीईएम एमपीएनएसटी से प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों की स्थापना पर चर्चा करते हैं, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके इन संस्कृतियों को कैसे चिह्नित किया जाए, और एलोग्राफ्ट स्थापित करके उनकी ट्यूमरजेनिसिटी को कैसे सत्यापित किया जाए। सामूहिक रूप से, ये तकनीकें पीएन और एमपीएनएसटी की विकृति को चिह्नित करती हैं जो जीईएम मॉडल में उत्पन्न होती हैं और गंभीर रूप से इन म्यूरिन ट्यूमर की विकृति की तुलना उनके मानव समकक्षों से करती हैं।

Introduction

पिछले तीन दशकों में, कई प्रयोगशालाओं ने मानव कैंसर से जुड़े उत्परिवर्तन को माउस जीनोम में पेश करके या मानव कैंसर में अतिरंजित जीन उत्पाद को ओवरएक्सप्रेस करके मानव कैंसर के माउस मॉडल बनाने का प्रयास किया है। परिणामी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल का उपयोग विभिन्न उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है जैसे कि यह स्थापित करना कि नया शुरू किया गया जीनोमिक संशोधन ट्यूमरजेनेसिस शुरू करता है, अन्य बाद में होने वाले आनुवंशिक या एपिजेनेटिक परिवर्तनों की पहचान करता है जो ट्यूमर प्रगति में योगदान करते हैं, और प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों को परिभाषित करते हैं जो ट्यूमर दीक्षा और प्रगति को चलाते हैं। ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल के विपरीत, जो इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों के उपयोग पर भरोसा करते हैं, जीईएम कैंसर मॉडल में पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली होती है और इसलिए उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंटों के लिए अधिक सटीक मॉडल प्रतिक्रियाएं होती हैं। हालांकि, इन जैसे उद्देश्यों के लिए जीईएम कैंसर मॉडल का उपयोग करते समय, यह आवश्यक है कि जांचकर्ता पुष्टि करें कि जीईएम नियोप्लाज्म के साथ किए गए अवलोकन उनके मानव समकक्षों के लिए प्रासंगिक हैं। इस सत्यापन में जीईएम नियोप्लाज्म के विकृति विज्ञान का गहन मूल्यांकन और यह निर्धारित करना शामिल होना चाहिए कि क्या जीईएम नियोप्लाज्म की पैथोलॉजिकल विशेषताएं संबंधित मानव ट्यूमर प्रकार की विकृति को पुन: व्यवस्थित करती हैं।

ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफाइब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) मानव तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने वाली सबसे आम आनुवंशिक बीमारी है, जो प्रत्येक 3,000-3,500 जीवित जन्मों में लगभग 1 में होती है। एनएफ 1 से पीड़ित व्यक्ति कई सौम्य परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर विकसित करते हैं जिन्हें उनकी त्वचा (त्वचीय न्यूरोफिब्रोमास) और बड़ी नसों और तंत्रिका प्लेक्सस (प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास) में न्यूरोफिब्रोमस के रूप में जाना जाता है। जबकि त्वचीय और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस दोनों शारीरिक, व्यवहारिक और/या सामाजिक हानि पैदा करके रोगी के जीवन की गुणवत्ता को खराब करते हैं, प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस (पीएन) विशेष रूप से खतरनाक 4,5 हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि पीएन अक्सर घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (एमपीएनएसटी) में बदल जाते हैं, जो असाधारण रूप से कम जीवित रहने की दर 1,2 के साथ आक्रामक स्पिंडल सेल नियोप्लाज्म होते हैं। बड़े हिस्से में, यह कम जीवित रहने की दर इसलिए है क्योंकि रेडियो- और कीमोथेरेपी रेजिमेंस जो वर्तमान में एमपीएनएसटी के इलाज के लिए उपयोग किए जाते हैं, अप्रभावी हैं। हालांकि, नए, अधिक प्रभावी उपचार विकसित करना चुनौतीपूर्ण रहा है। ऐसा इसलिए है, क्योंकि एनएफ 1 रोगियों में आमतौर पर एमपीएनएसटी होने के बावजूद, वे अभी भी दुर्लभ नियोप्लाज्म हैं। नतीजतन, अध्ययन के लिए बड़ी संख्या में मानव ट्यूमर प्राप्त करना बहुत मुश्किल है; नैदानिक परीक्षणों के लिए एमपीएनएसटी के साथ पर्याप्त रोगियों की भर्ती करना भी चुनौतीपूर्ण है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, न्यूरोफिब्रोमा रोगजनन और पीएन-एमपीएनएसटी प्रगति को चलाने वाली असामान्यताओं में और अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंटों के साथ प्रीक्लिनिकल परीक्षणों की सुविधा के लक्ष्य के साथ कई जीईएम मॉडल तैयार किए गए हैं।

एनएफ 1 रोगियों में एनएफ 1 जीन की एक प्रति में निष्क्रिय उत्परिवर्तन होते हैं। न्यूरोफिब्रोमा रोगजनन तब ट्रिगर होता है जब शेष कार्यात्मक एनएफ 1 जीन में एक निष्क्रिय उत्परिवर्तन श्वान सेल वंश में एक सेल में होता है। हैरानी की बात है, हालांकि, जब चूहों को एनएफ 1 उत्परिवर्तन को निष्क्रिय करने वाले जर्मलाइन के साथ उत्पन्न किया गया था, तो उन्होंने न्यूरोफिब्रोमस 6,7 विकसित नहीं किया। बाद का प्रदर्शन कि Nf1-null Schwann कोशिकाओं और Nf1 haploinsufficiency के साथ चूहों अन्य सभी सेल प्रकारों में (Krox20-Cre;Nf1flox/- चूहों) विकसित plexiform neurofibromas ने सुझाव दिया कि अतिरिक्त सेल प्रकार में कम Nf1 जीन खुराक neurofibroma रोगजनन8 के लिए आवश्यक था. फिर भी, Krox20-Cre में plexiform neurofibromas; Nf1flox/- चूहों MPNST बनने के लिए प्रगति नहीं की और इसलिए केवल आंशिक रूप से उनके मानव समकक्षों के जीव विज्ञान की नकल की. एमपीएनएसटी रोगजनन तब हुआ जब एनएफ 1 उत्परिवर्तन को अतिरिक्त ट्यूमर शमन जीन जैसे टीआरपी 539 या सीडीकेएन 2 ए10 में उत्परिवर्तन के साथ भागीदारी की गई थी, लेकिन इन जीईएम मॉडल में एमपीएनएसटी ने डी नोवो या अनिश्चित जैविक क्षमता (एएनयूबीपी) 11,12 के एटिपिकल न्यूरोफाइब्रोमैटस नियोप्लाज्म से विकसित किया, बजाय पहले से मौजूद सौम्य प्लेक्सिफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस से (13,14 देखें इन मॉडलों की उत्कृष्ट समीक्षाओं के साथ-साथ अन्य मॉडलों के लिए जो सुज12 और पीटीईएन15 जैसे जीन में फ़ंक्शन म्यूटेशन के अतिरिक्त एमपीएनएसटी-जुड़े नुकसान को पेश करते हैं)।

ये माउस मॉडल एनएफ 1 से जुड़े परिधीय तंत्रिका तंत्र नियोप्लाज्म के रोगजनन में और उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंटों का परीक्षण करने वाले प्रीक्लिनिकल परीक्षणों के लिए एनएफ 1, टीपी 53, और सीडीकेएन 2 ए जैसे जीन की भूमिका स्थापित करने के लिए अमूल्य रहे हैं। हालांकि, हमें अभी भी उस प्रक्रिया की अधूरी समझ है जिसके द्वारा प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस अनिश्चित जैविक क्षमता (एएनयूबीपी16) और फिर एमपीएनएसटी के एटिपिकल न्यूरोफाइब्रोमैटस नियोप्लाज्म बनने के लिए प्रगति करता है। हाल ही में इस प्रक्रिया को समझने में कुछ प्रगति हुई है, हाल ही में रिपोर्ट के साथ कि एनएफ 1 और एआरएफ में विलोपन वाले चूहे एएनयूबीपी विकसित करते हैं जो एमपीएनएसटी11 बनने के लिए प्रगति करते हैं। हालांकि, एनएफ 1 उत्परिवर्तन-आधारित माउस मॉडल जो मनुष्यों में देखे गए प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा-एमपीएनएसटी प्रगति की प्रक्रिया को पूरी तरह से पुन: व्यवस्थित करते हैं, अभी तक मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, यह स्पष्ट नहीं है कि एमपीएनएसटी के विकास के लिए कई अलग-अलग रास्ते हैं या नहीं। इसे देखते हुए, यह संभव है कि ऊपर वर्णित जीईएम केवल कई अलग-अलग मार्गों का एक सबसेट मॉडल करते हैं जो न्यूरोफिब्रोमा-एमपीएनएसटी प्रगति और एमपीएनएसटी रोगजनन की ओर ले जाते हैं। इस बिंदु पर इस तथ्य पर जोर दिया जाता है कि एमपीएनएसटी भी छिटपुट रूप से होते हैं और कुछ छिटपुट एमपीएनएसटी में स्पष्ट रूप से एनएफ 1 उत्परिवर्तन17,18नहीं होता है।

हालांकि इस बाद के बिंदु को मैगोलोन-लोरेंज एट अल के हालिया सुझाव द्वारा चुनौती दी गई है कि एनएफ 1 म्यूटेशन की कमी वाले कम से कम कुछ छिटपुट एमपीएनएसटी मेलेनोमा या एक अलग प्रकार के सारकोमा19 हैं, हमने हाल ही में एक छिटपुट एमपीएनएसटी और इस ट्यूमर (2 एक्सएसबी कोशिकाओं) से प्राप्त एक सेल लाइन की सूचना दी है जो एनएफ 1 जंगली प्रकार20 था. माता-पिता ट्यूमर और 2XSB सेल लाइन के लक्षण वर्णन के दौरान, हमने व्यवस्थित रूप से वैकल्पिक नैदानिक संभावनाओं को खारिज कर दिया, जिसमें मेलेनोमा और कई अन्य सरकोमा प्रकार शामिल हैं जिन्हें नियमित रूप से छिटपुट घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर20 के विभेदक निदान में माना जाता है। इसके अलावा, हम ध्यान दें कि मैगोलोन-लोरेंज एट अल ने स्वीकार किया कि तीन छिटपुट एमपीएनएसटी सेल लाइनों में उनके निष्कर्षों का अध्ययन किया गया है कि यह इंगित करने के लिए सामान्यीकृत नहीं किया जा सकता है कि छिटपुट एमपीएनएसटी के रूप में पहचाने जाने वाले सभी ट्यूमर एमपीएनएसटी नहीं हैं।

एक जीईएम मॉडल का निर्माण करने के लिए जिसमें न्यूरोफिब्रोमा और एमपीएनएसटी रोगजनन आवश्यक रूप से विशिष्ट ट्यूमर शमन जीन उत्परिवर्तन पर निर्भर नहीं थे, हमने ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न किया जिसमें शक्तिशाली श्वान सेल माइटोजेन न्यूरेगुलिन -1 (एनआरजी 1) की अतिअभिव्यक्ति श्वान सेल-विशिष्ट माइलिन प्रोटीन शून्य (पी0) प्रमोटर (पी 0-जीजीएफβ3 चूहों)21 द्वारा संचालित की गई थी. हमने पहले दिखाया है कि मानव न्यूरोफिब्रोमास, एमपीएनएसटी, और एमपीएनएसटी सेल लाइनें कई एनआरजी 1 आइसोफॉर्म को एआरबीबी रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस (एआरबीबी 2, ईआरबी 3, और एआरबीबी 4) के साथ व्यक्त करती हैं जो एनआरजी 1 सिग्नलिंग में मध्यस्थता करती हैं और ये एआरबीबी रिसेप्टर्स संवैधानिक रूप सेसक्रिय होते हैं 22. हमने यह भी प्रदर्शित किया है कि एर्बीबी किनेसेस के फार्माकोलॉजिकल अवरोधक एमपीएनएसटी प्रसार22, उत्तरजीविता23 और प्रवासन24 को संभावित रूप से रोकते हैं। मनुष्यों में हमारी टिप्पणियों को ध्यान में रखते हुए, पी 0-जीजीएफβ3 चूहों ने प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस25 विकसित किया है जो उच्च आवृत्ति21,25 पर एमपीएनएसटी बनने के लिए प्रगति करता है। हमने दिखाया है कि पी 0-जीजीएफ β 3 एमपीएनएसटी, उनके मानव समकक्षों की तरह, आमतौर पर टीआरपी 53 और सीडीकेएन 2 ए के उत्परिवर्तन विकसित करते हैं, साथ ही साथ कई अन्य जीनोमिक असामान्यताएं जो संभावित रूप से ट्यूमरजेनेसिस25 में योगदान करती हैं। P 0-GGFβ3 चूहों में उत्पन्न होने वाले MPNSTs में Nf1 उत्परिवर्तन निष्क्रिय नहीं होते हैं। हालांकि, आनुवंशिक पूरकता का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि NRG1 P 0-GGFβ3 चूहों में ट्यूमरजेनेसिस को बढ़ावा देता है, मुख्य रूप से उसी सिग्नलिंग कैस्केड के माध्यम से जो Nf1 नुकसान26 द्वारा बदल दिया जाता है; यह निष्कर्ष हमारी खोज पर आधारित है कि Trp1 haploinsufficiency (P 0-GGFβ3;Trp53+/- चूहे) ऐसे जानवरों का उत्पादन करते हैं जिनमें MPNSTs नए सिरे से विकसित होते हैं, जैसा कि cis-Nf1+/- में देखा जाता है; Trp53+/- चूहे27.

यह और अन्य जानकारी प्राप्त करने के लिए कि P 0-GGFβ3 चूहों ने NF1 के साथ मनुष्यों में देखी जाने वाली न्यूरोफिब्रोमा रोगजनन और न्यूरोफिब्रोमा-MPNST प्रगति की प्रक्रियाओं को सटीक रूप से मॉडल किया है, हमने इन जानवरों से ऊतकों को संसाधित करने के लिए विशेष तरीके विकसित किए हैं, उनके ट्यूमर का सटीक निदान करना, इन चूहों में उत्पन्न होने वाले MPNSTs की ग्रेडिंग करना, प्रारंभिक मार्ग P0-GGFβ3 और P0-GGFβ3 की स्थापना और विशेषता करना; Trp53+/- MPNST संस्कृतियों और गंभीर रूप से P 0-GGFβ3 PNs और MPNSTs और P0-GGFβ3 की विकृति की तुलना; Trp53+/- MPNSTs उनके मानव समकक्षों के लिए। इनमें से कई पद्धतियां तंत्रिका तंत्र नियोप्लासिया के अन्य जीईएम मॉडल के लिए सामान्य हैं। इसके अतिरिक्त, इनमें से कई पद्धतियां जीईएम मॉडल पर अधिक व्यापक रूप से लागू होती हैं जिसमें अन्य अंग साइटों में नियोप्लाज्म उत्पन्न होते हैं। नतीजतन, यहां हम इन पद्धतियों का विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित प्रक्रियाओं को दक्षिण कैरोलिना के IACUC के मेडिकल यूनिवर्सिटी द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड और MUSC के संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया गया था।

1. पी 0-जीजीएफ β3 चूहों में ट्यूमर प्रवेश और अस्तित्व का निर्धारण करना और आगे के लक्षण वर्णन के लिए इन जानवरों में ट्यूमर की पहचान करना

  1. चूहों के पलटन उत्पन्न करें जिनका ट्यूमरजेनेसिस के लिए मूल्यांकन किया जाएगा। आवश्यक चूहों की संख्या ट्यूमर फेनोटाइप के प्रवेश पर निर्भर करती है। इस तरह के नुकसान की भरपाई के लिए, एक समूह से शुरू करें जो जानवरों की वांछित अंतिम संख्या से 10-15% अधिक है।
    नोट: हमने पी 0-जीजीएफβ3 चूहों में ट्यूमर पैठ को 50 चूहों के प्रारंभिक समूह में अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया (जिनमें से छह नियोप्लासिया (जैसे, लड़ाई)25से असंबंधित कारणों से खो गए थे।
  2. साप्ताहिक तीन बार जानवरों के स्वास्थ्य का आकलन करें और प्रत्येक परीक्षा में वजन और व्यवहार में परिवर्तन सहित शरीर की स्थिति के स्कोर रिकॉर्ड करें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु का उपयोग करके ट्यूमर-असर या मरणासन्न चूहों (नीचे नोट देखें) को समाप्त करें। दिनों में मृत्यु पर रिकॉर्ड उम्र। यदि ट्यूमर बाहरी रूप से दिखाई दे रहे हैं, तो ट्यूमर आयाम (लंबाई, चौड़ाई और ऊंचाई) रिकॉर्ड करें।
    नोट: यह आवश्यक है कि जानवरों को आईएसीयूसी अनुमोदित अधिकतम स्वीकार्य ट्यूमर आकार और / या मानवीय समापन बिंदु से आगे बढ़ने की अनुमति नहीं है।
  3. मृत्यु के समय उम्र का उपयोग करते हुए, मृत्यु की औसत आयु और जीवित रहने की सीमा निर्धारित करने के लिए एक कपलान-मीयर उत्तरजीविता वक्र स्थापित करें।
    नोट: पी 0-जीजीएफβ3 चूहों की मृत्यु पर औसत आयु 261.5 दिनों की थी, जिसमें 74-533 दिनों की सीमा थी; हमारे पलटन के 91% में कई न्यूरोफिब्रोमस थे और 71% में एमपीएनएसटी21 था।
  4. निर्धारित करें कि क्या मोटे तौर पर दिखाई देने वाले ट्यूमर मौजूद हैं और, यदि वे हैं, तो उन्हें बाँझ परिस्थितियों में विच्छेदन करें ताकि यह स्थापित किया जा सके कि ट्यूमर परिधीय तंत्रिका से जुड़ा हुआ है या नहीं और फिर ट्यूमर को एक्साइज करें। पी 0-जीजीएफβ3 और पी0-जीजीएफβ3 में; Trp53+/- चूहे, परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर सबसे अधिक ट्राइजेमिनल और कटिस्नायुशूल नसों में पाए जाते हैं। यहां तक कि अगर इन नसों के साथ मोटे तौर पर दिखाई देने वाले ट्यूमर नहीं देखे जाते हैं, तो इन नसों को ठीक करें और एम्बेड करें जैसा कि नीचे वर्णित है ताकि सूक्ष्म ट्यूमर की उपस्थिति के लिए उनकी जांच की जा सके। माइक्रो-ट्यूमर आमतौर पर इन नसों से जुड़े गैन्ग्लिया के भीतर होते हैं।
  5. मोटे तौर पर दिखाई देने वाले ट्यूमर को तीन टुकड़ों में काटें(चित्र 1ए)। ऊतक विज्ञान (पैराफिन अनुभाग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और हिस्टोकेमिस्ट्री) के लिए टुकड़ा 1 का उपयोग करें। प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए टुकड़ा 2 का उपयोग करें। स्नैप-फ्रीज टुकड़ा 3 (तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके) संभव भविष्य के प्रयोगों (जैसे, इम्यूनोब्लॉट्स, आरएनए और डीएनए अलगाव) के लिए।
  6. 4 ओसी पर फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में टुकड़ा 1 को ठीक करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पैराफॉर्मलाडेहाइड में विसर्जन द्वारा पशु के शरीर के शेष को ठीक करें।

2. पैराफिन-एम्बेडिंग स्थूल दिखाई देने वाले ट्यूमर और प्रारंभिक नैदानिक मूल्यांकन के लिए हेमटोक्सिलिन और ईोसिन-सना हुआ वर्गों की तैयारी

  1. पैराफिन एम्बेडिंग स्थूल रूप से दिखाई देने वाले ट्यूमर
    1. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रात भर ट्यूमर टुकड़ा 1 को ठीक करने के बाद, ऊतक को पीबीएस की मात्रा में रखकर कुल्ला जो 15 मिनट के लिए ऊतक की मात्रा से कम से कम 10x अधिक है; बाद के सभी रिन्स के लिए समान मात्रा का उपयोग करें। दोहराएँ दो और 15 मिनट पीबीएस rinses, प्रत्येक कुल्ला के लिए पीबीएस की एक ताजा मात्रा का उपयोग.
    2. ट्यूमर टुकड़ा 1 से 70% इथेनॉल स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में ऊतक पकड़ो। यदि वांछित है, तो इन शर्तों के तहत ऊतक को लंबे समय तक स्टोर करें।
      नोट: 2.1.7 के माध्यम से 2.1.1 कदम जांचकर्ताओं जो एक वाणिज्यिक ऊतक प्रसंस्करण मशीन के लिए उपयोग नहीं है के लाभ के लिए प्रदान की जाती हैं. अन्वेषक एक ऊतक प्रोसेसर के लिए उपयोग किया है, ऊतक क्रमादेशित साधन प्रोटोकॉल के अनुसार वर्गीकृत इथेनॉल और xylenes के माध्यम से संसाधित किया जाएगा.
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूमर टुकड़ा 1 से 80% इथेनॉल स्थानांतरण. 80% इथेनॉल की एक ताजा मात्रा में एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए इनक्यूबेशन दोहराएँ.
    4. कमरे के तापमान पर 75 मिनट के लिए ट्यूमर टुकड़ा 1 से 95% इथेनॉल स्थानांतरण। इनक्यूबेशन को दो बार और दोहराएं, हर बार 95% इथेनॉल की ताजा मात्रा में अतिरिक्त 75 मिनट के लिए।
    5. ट्यूमर टुकड़ा 1 से 100% इथेनॉल स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 60 मिनट इनक्यूबेशन को दो बार और दोहराएं, हर बार 100% इथेनॉल की ताजा मात्रा का उपयोग करके।
    6. ट्यूमर टुकड़ा 1 को डी-लिमोनेन-आधारित विलायक में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूमर टुकड़ा 1 को डी-लिमोनेन-आधारित विलायक की एक ताजा मात्रा में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर अतिरिक्त 30-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 1:1 पैराफिन/डी-लिमोनेन-आधारित विलायक त्यागें और ट्यूमर टुकड़ा 1 से 60 ओ सी पैराफिन और 60 ओ सीपैराफिन पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 20 मिनट के लिए 60 ओ सी पर ट्यूमर टुकड़ा 1 को इनक्यूबेशन स्थानांतरित करें। 60 ओसी पर रात भर पैराफिन में ट्यूमर टुकड़ा 1 सेते हैं।
    8. एक स्टील ऊतक विज्ञान मोल्ड में पैराफिन की एक आधार परत डालो और इसे जमने दें। ट्यूमर टुकड़ा 1 को बेस पैराफिन की सतह पर स्थानांतरित करें और स्थिति के तुरंत बाद, ऊतक को 60 ओसी पैराफिन के साथ कवर करें और ऊतक कैसेट को पिघला हुआ पैराफिन के ऊपर और संपर्क में रखें। मोल्ड को एम्बेडिंग स्टेशन के ठंडे पक्ष में स्थानांतरित करें और इसे 10-15 मिनट के लिए जमने दें।
    9. मोल्ड से संलग्न ऊतक कैसेट के साथ पैराफिन ब्लॉक निकालें। सेक्शनिंग के दौरान माइक्रोटोम में ब्लॉक को जकड़ने के लिए संलग्न ऊतक कैसेट का उपयोग करें।
      नोट: पैराफिन ब्लॉक अब कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. हेमेटोक्सिलिन और मोटे तौर पर दिखाई देने वाले ट्यूमर के ईोसिन-दाग वाले वर्गों को तैयार करें।
    1. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके ट्यूमर ऊतक के 4-5 माइक्रोन वर्गों को काटें और उन्हें सकारात्मक चार्ज ग्लास स्लाइड पर माउंट करें।
    2. हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डी-लिमोनेन-आधारित विलायक में स्लाइड को इनक्यूबेट करके ऊतक वर्गों को डिपैराफिनाइज करें। 10 मिनट के लिए डी-लिमोनेन-आधारित विलायक की एक ताजा मात्रा में इनक्यूबेशन दोहराएं।
    3. स्लाइड को 100% इथेनॉल में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। स्लाइड को 100% इथेनॉल की एक ताजा मात्रा में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर एक और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. स्लाइड को 95% इथेनॉल में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। स्लाइड को 95% इथेनॉल की एक ताजा मात्रा में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर एक और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. स्लाइड को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, 50% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    6. आसुत जल के लिए स्लाइड स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हेमटोक्सिलिन में उन्हें डुबोकर स्लाइड को दाग दें। 1-2 मिनट के लिए नल के पानी से कुल्ला. 70% इथेनॉल में 0.5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड में स्लाइड 2-5x डुबकी द्वारा अंतर करें। 1-2 मिनट के लिए एक चल नल के पानी के स्नान में कुल्ला. 10 एस के लिए 0.5% एसिटिक एसिड के साथ 95% इथेनॉल में स्लाइड रखें।
    8. कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए ईोसिन-वाई के साथ स्लाइड को दाग दें और फिर स्लाइड को 5 मिन के लिए 100% इथेनॉल में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए एक डी-लिमोनेन आधारित विलायक में नमूने साफ़ करें।
    9. माउंट एक जाइलीन-आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवरस्लिप करता है, जबकि स्लाइड अभी भी डी-लिमोनेन-आधारित विलायक के साथ गीला है। बढ़ते माध्यम को रात भर सेट होने दें।
      नोट: पानी आधारित माउंटिंग माध्यम का उपयोग न करें।
  3. plexiform neurofibromas और micro-MPNSTs की पहचान करने के लिए सकल दिखाई ट्यूमर के बिना ऊतकों को तैयार करें. ऊतकों को पैराफिन में एम्बेड करें, हिस्टोलॉजिक सेक्शन तैयार करें, और इन वर्गों को हेमटोक्सिलिन और ईोसिन के साथ दाग दें।
    1. आंतरिक अंगों को निकालें और एच एंड ई-दाग वाले वर्गों को तैयार करने के लिए पैराफिन में प्रत्येक अंग के प्रतिनिधि भागों को एम्बेड करें जिनकी ट्यूमर के सूक्ष्म प्रमाण(चित्रा 1बी)के लिए जांच की जाएगी। सिर, forelimbs, hindlimbs, और पूंछ (चित्रा 1C) निकालें. तंत्रिका जड़ ट्यूमर के सबूत के लिए सीटू में रीढ़ की हड्डी और तंत्रिका जड़ों की जांच करने के लिए, कशेरुक स्तंभ और संबंधित पसलियों और नरम ऊतक को 0.3 एम ईडीटीए / 4% पैराफॉर्मलडेहे (पीएच 8.0) में 48-72 घंटे के लिए 4 ओसी पर विसर्जन द्वारा डिकैल्सीफाई करें; फिर, 1x पीबीएस के साथ नमूने कुल्ला. डीकैल्सीफिकेशन के अंत में, सुनिश्चित करें कि एक सुई के साथ कशेरुक स्तंभ को छेदने का प्रयास करके डीकैल्सीफिकेशन पूरा हो गया है। डीकैल्सीफिकेशन सफल होता है यदि सुई आसानी से क्रंचिंग के बिना हड्डी में प्रवेश करती है।
    2. डिकैल्सीफाइड कशेरुक स्तंभ और संबंधित संरचनाओं को ब्लॉक में काटें जो एक ऊतक कैसेट में फिट होंगे। चरण 2.1.2-2.1.7 में वर्णित डी-लिमोनेन-आधारित विलायक के बाद वर्गीकृत इथेनॉल के माध्यम से निर्जलीकरण। पैराफिन में एम्बेड करें और चरण 2.1.7-2.2.1 में वर्णित 4-5 माइक्रोन अनुभाग तैयार करें। एच एंड ई दाग प्रदर्शन के रूप में चरणों 2.2.2-2.2.9 में वर्णित है; बढ़ते माध्यम को रात भर सेट होने दें।

3. संभावित plexiform neurofibromas की पहचान करें और निदान की पुष्टि करने के लिए विशेष दाग प्रदर्शन

नोट: हम दृढ़ता से एच एंड ई के मूल्यांकन में एक अनुभवी मानव या पशु रोग विशेषज्ञ और जीईएम ट्यूमर वर्गों के विशेष दाग सहित अनुशंसा करते हैं।

  1. संभावित परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर की पहचान करने के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ऊपर वर्णित के रूप में तैयार एच एंड ई दाग स्लाइड की जांच करें। चूंकि न्यूरोफिब्रोमस और एमपीएनएसटी परिधीय नसों के भीतर उत्पन्न होते हैं, इसलिए यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि सूक्ष्म ट्यूमर परिधीय तंत्रिका से जुड़े हैं या नहीं। संभावित परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर के साथ ब्लॉक की पहचान करें ताकि निदान की पुष्टि या खंडन करने के लिए इम्यूनोस्टेन और अन्य विशेष दाग किए जा सकें।
  2. एच एंड ई-दाग वर्गों के ब्राइटफील्ड परीक्षा के दौरान देखी गई हिस्टोलॉजिक विशेषताओं के आधार पर एमपीएनएसटी/अन्य उच्च श्रेणी के नियोप्लाज्म से संभावित पीएन को अलग करें। मानव पीएन हल्के से हाइपरसेलुलर नियोप्लाज्म होते हैं जो मुख्य रूप से लम्बी, अक्सर लहराती नाभिक वाली कोशिकाओं से बने होते हैं। कई क्षेत्रों में, कोशिकाओं को शिथिल रूप से पैक किया जाता है और मायक्सॉइड बाह्य सामग्री द्वारा अलग किया जा सकता है; P 0-GGFβ3 चूहों में PNs की उपस्थिति समान होती है। माइटोज आमतौर पर मौजूद नहीं होते हैं; यदि वे हैं और ट्यूमर मध्यम से अत्यधिक हाइपरसेल्युलर है, तो ट्यूमर एक एमपीएनएसटी या किसी अन्य प्रकार का उच्च श्रेणी का नियोप्लाज्म है (नीचे देखें)।
  3. पीएन नियोप्लास्टिक श्वान कोशिकाओं और अन्य गैर-नियोप्लास्टिक सेल प्रकारों जैसे मस्तूल कोशिकाओं के मिश्रण से बने होते हैं। पीएन की पहचान की पुष्टि करने के लिए, एच एंड ई परीक्षा में पहचाने गए संभावित पीएन वाले ब्लॉकों से वर्गों पर श्वान सेल मार्कर S100β और Sox10 और मास्ट सेल मार्कर CD117 (सी-किट) के लिए इम्यूनोस्टेन करें (वैकल्पिक मस्तूल सेल मार्कर धुंधला विकल्पों के लिए अनुभाग 3.4 देखें)। कम प्रसार दर की पुष्टि करने के लिए Ki67 इम्युनोस्टेन करें।
    नोट: तालिका 1 जीईएम प्लेक्सिफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस (एस 100 डिग्री, सॉक्स 10, सीडी 117, केआई 67) की नियमित पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीजन मार्करों को सूचीबद्ध करता है, एमपीएनएसटी का निदान, और न्यूरोफिब्रोमस में मौजूद अन्य सेल प्रकारों के पूर्ण मूल्यांकन के लिए; हम इन बाद के एंटीजन के लिए केवल तभी दाग लगाते हैं जब पहली बार एक नए जीईएम मॉडल का वर्णन करते हैं। अनुशंसित स्थितियों के लिए एंटीबॉडी निर्माता की डेटाशीट से परामर्श करें। ध्यान दें कि क्या एंटीबॉडी निर्माता का इंसर्ट एंटीजन पुनर्प्राप्ति की सिफारिश करता है; सभी एंटीजन को पता लगाने योग्य होने के लिए पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं होती है।
    1. चयनित पैराफिन ब्लॉकों से 4-5 माइक्रोन वर्गों को तैयार करें और उन्हें सकारात्मक चार्ज स्लाइड पर माउंट करें। चरण 2.2.2-2.2.6 में वर्णित अनुभागों को हटा दें।
    2. 3-5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों कुल्ला.
    3. यदि एंटीबॉडी निर्माता एंटीजन पुनर्प्राप्ति की सिफारिश करता है, तो साइट्रेट बफर तैयार करें। साइट्रिक एसिड समाधान के 9 एमएल (आसुत जल के 500 एमएल में साइट्रिक एसिड के 10.5 ग्राम) और सोडियम साइट्रेट समाधान के 41 एमएल (आसुत जल के 500 एमएल में सोडियम साइट्रेट के 14.7 ग्राम) मिलाएं।
    4. एक गर्म चावल कुकर में 20 मिनट के लिए साइट्रेट बफर में स्लाइड रखकर एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन.
    5. ऊतक में पेरोक्सीडेज गतिविधि को खत्म करने के लिए 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड/1x पीबीएस में स्लाइड स्थानांतरित करें।
      नोट: इस घोल को हर बार ताजा बनाएं और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्टॉक समाधान का उपयोग न करें यदि यह 3-4 महीने से अधिक पुराना है।
    6. 1x पीबीएस में वर्गों कुल्ला.
    7. 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर (2% बीएसए, 0.1% ट्राइटन एक्स -100 1x पीबीएस में) का उपयोग करके अनुभागों को ब्लॉक करें। 1x पीबीएस में संक्षेप में स्लाइड कुल्ला.
    8. ऊतक वर्गों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. पतला अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। 37 ओसी पर 2 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं या 4 ओसी पर रात भर.
    9. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड धो लें।
    10. 1-2 घंटे के लिए biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक सेते हैं.
    11. निर्माता के प्रोटोकॉल के आधार पर डायमिनोबेंजिडाइन (डीएबी) समाधान तैयार करें और 2-10 मिनट के लिए समाधान में स्लाइड विसर्जित करें। 5 मिनट के लिए पानी में स्लाइड धो लें.
    12. उन्हें 10-15 मिनट के लिए hematoxylin में विसर्जित करके वर्गों counterstain. बहते पानी को तब तक उजागर करें जब तक कि वह साफ न हो जाए। जल्दी से शराब में स्लाइड डुबकी और पानी में स्लाइड कुल्ला.
    13. जल्दी से स्लाइड सूई द्वारा वर्गीकृत इथेनॉल में निर्जलीकरण स्लाइड, 4-5x प्रति समाधान, 70% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, और फिर 100% इथेनॉल में। 2 मिनट के लिए एक डी-लिमोनेन आधारित विलायक में स्लाइड सेते हैं. 2 मिनट के लिए डी-लिमोनेन-आधारित विलायक के दूसरे बैच में स्लाइड सेते हैं।
    14. माउंट स्लाइड एक xylene-आधारित बढ़ते माध्यम के साथ.
    15. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा स्लाइड की जांच करें।
    16. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, चरण 3.3.10-3.3.15 को छोड़ दें। इसके बजाय, प्रजाति-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक को इनक्यूबेट करें जो 1-2 घंटे के लिए बफर को अवरुद्ध करने में पतला होता है।
    17. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड कुल्ला. 3x दोहराएँ.
    18. 1x पीबीएस/ग्लिसरॉल का उपयोग करके माउंट स्लाइड।
    19. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर स्लाइड की जांच करें.
  4. मस्तूल कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए वैकल्पिक विधि: टोल्यूइडीन नीला धुंधला हो जाना
    1. 70% इथेनॉल के 100% एमएल में टोल्यूइडीन ब्लू ओ के 1 ग्राम को भंग करके टोल्यूइडीन ब्लू स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. आसुत जल के 50 एमएल में 0.5 ग्राम छंब्स घोलकर 1% सोडियम क्लोराइड (छंब्स) विलयन तैयार कीजिए। घुलने के लिए मिलाएं। एचसीएल का उपयोग करके पीएच को लगभग 2.0-2.5 तक समायोजित करें।
      नोट: इस NaCl समाधान ताजा हर बार दाग प्रदर्शन कर रहे हैं बनाया जाना चाहिए.
    3. 1% NaCl समाधान के 45 एमएल में टोल्यूइडीन ब्लू स्टॉक समाधान के 5 एमएल जोड़कर टोल्यूइडीन ब्लू वर्किंग समाधान तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं और सुनिश्चित करें कि पीएच लगभग 2.3 है।
      नोट: 2.5 से अधिक पीएच कम मेटाक्रोमेशिया के साथ धुंधला हो जाएगा। इस समाधान ताजा हर बार धुंधला प्रदर्शन किया जाता है.
    4. Deparaffinize 4-5 माइक्रोन वर्गों सकारात्मक चार्ज स्लाइड पर घुड़सवार के रूप में कदम 2.2.2-2.2.6 में वर्णित है. 2 मिनट के लिए बहते पानी में deparaffinized वर्गों धो लें.
    5. 2-3 मिनट के लिए टोल्यूइडीन नीले काम कर समाधान में दाग अनुभागों. 2 मिनट के लिए आसुत जल में धो लें.
    6. 95% इथेनॉल में 10x डुबकी लगाकर वर्गों को निर्जलित करें। 100% इथेनॉल 10x में डुबकी स्लाइड। ताजा 100% इथेनॉल में डुबकी स्लाइड 10 बार अधिक।
    7. 2 मिनट के लिए एक डी-लिमोनेन आधारित विलायक में स्लाइड सेते हैं. 2 मिनट के लिए डी-लिमोनेन-आधारित विलायक के दूसरे बैच में स्लाइड सेते हैं।
    8. माउंट एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग coverslips जबकि स्लाइड अभी भी एक d-limonene आधारित विलायक के साथ गीला है.
      नोट: पानी आधारित माउंटिंग माध्यम का उपयोग न करें।
    9. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा स्लाइड की जांच करें। उनके साइटोप्लाज्म में गहरे बैंगनी कणिकाओं की उपस्थिति से मस्तूल कोशिकाओं की पहचान करें। अन्य सेल प्रकार हल्के नीले रंग के दाग वाले होते हैं।

4. एमपीएनएसटी का निदान करने और वैकल्पिक निदान का पता लगाने के लिए विशेष दाग

  1. मानव एमपीएनएसटी की हिस्टोलॉजिक उपस्थिति अत्यधिक परिवर्तनशील है और कई अलग-अलग ट्यूमर प्रकारों में एमपीएनएसटी28 के समान उपस्थिति होती है। चूंकि एमपीएनएसटी श्वान सेल वंश से प्राप्त होते हैं, इसलिए यह निर्धारित करें कि ट्यूमर एक परिधीय तंत्रिका से या मौजूदा सौम्य पीएन के भीतर सकल परीक्षा या एच एंड ई-दाग वाले वर्गों की ब्राइटफील्ड सूक्ष्म परीक्षा से उत्पन्न होता है या नहीं। हालांकि एमपीएनएसटी कभी-कभी परिधीय तंत्रिका या पीएन के साथ सहयोग में नहीं पाए जाते हैं (आमतौर पर विच्छेदन के दौरान तंत्रिका से अनजाने में अलग होने के कारण, एमपीएनएसटी अतिवृद्धि के माध्यम से पहले से मौजूद पीएन का विनाश, या क्योंकि घाव मेटास्टैटिक है), एक तंत्रिका या पीएन के साथ ट्यूमर के सहयोग की तलाश करें क्योंकि निदान कम संभावना है यदि ट्यूमर तंत्रिका या पीएन से जुड़ा नहीं है।
  2. संभावित एमपीएनएसटी वाले पैराफिन ब्लॉक से 4-5 माइक्रोन अनुभाग तैयार करें और उन्हें चरण 2.2.1 में वर्णित सकारात्मक चार्ज स्लाइड पर माउंट करें। चरण 2.2.2-2.2.6 में वर्णित अनुभागों को हटा दें।
  3. चरण 3.3.1-3.3.15 में वर्णित तालिका 2 में इंगित एंटीबॉडी के पैनल के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करें।
  4. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा immunostains की जांच. चूंकि MPNSTs schwannian भेदभाव प्रदर्शित करते हैं, S100β, नेस्टिन और Sox10 के लिए एक समान या पैची इम्यूनोएक्टिविटी की तलाश करें। यदि ट्यूमर इन तीन मार्करों के लिए सकारात्मक नहीं हैं, तो निदान स्थापित करने के लिए तालिका 2 देखें।
    नोट: मानव और माउस एमपीएनएसटी अलग-अलग भेदभाव प्रदर्शित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कुछ मानव एमपीएनएसटी फोकल रबडोमायोब्लास्टिक भेदभाव प्रदर्शित करते हैं (इन वेरिएंट को घातक ट्राइटन ट्यूमर के रूप में जाना जाता है); यद्यपि ये नियोप्लाज्म श्वानियन मार्करों के लिए दाग देंगे, वे मांसपेशी मार्करों जैसे डेस्मिन, मायोडी 1 और मायोजेनिन को भी व्यक्त करते हैं। इन बाद के मार्करों के लिए इम्यूनोएक्टिविटी को शोधकर्ताओं को एमपीएनएसटी के रूप में ट्यूमर का निदान करने से नहीं रोकना चाहिए। हालांकि SS18-SSX संलयन जीन को सशर्त रूप से व्यक्त करने वाले कई माउस मॉडल को श्लेष सारकोमा रोगजनन29 मॉडल के लिए स्थापित किया गया है, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, श्लेष सारकोमा मॉडल जो अनायास समकक्ष संलयन प्रतिलेख उत्पन्न करते हैं, ज्ञात नहीं हैं। नतीजतन, हम जीईएम ट्यूमर में एसएस 18-एसएसएक्स संलयन टेप की तलाश नहीं करते हैं और इसके बजाय इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोफाइल पर भरोसा करते हैं।

5. एमपीएनएसटी की ग्रेडिंग

  1. निर्धारित करें कि क्या ट्यूमर परिगलन, डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी की एक बानगी मौजूद है। ग्रेड IV एमपीएनएसटी के लिए, प्रमुख हाइपरसेल्युलरिटी, तेज माइटोटिक गतिविधि (≥10 उच्च शक्ति (40x) क्षेत्रों में 4 माइटोज), और साइटोलॉजिकल एटिपिया की तलाश करें।
    1. यदि परिगलन मौजूद नहीं है, तो यह निर्धारित करने के लिए ट्यूमर का आकलन करें कि क्या हाइपरसेल्युलरिटी, तेज माइटोटिक गतिविधि और साइटोलॉजिकल एटिपिया मौजूद हैं। यदि ये विशेषताएं परिगलन की अनुपस्थिति में मौजूद हैं, तो ट्यूमर को डब्ल्यूएचओ ग्रेड III एमपीएनएसटी के रूप में ग्रेड करें।
    2. डब्ल्यूएचओ ग्रेड II ट्यूमर को सेल्युलरिटी की विशेषता है जो बढ़ जाती है, लेकिन डब्ल्यूएचओ ग्रेड III और IV एमपीएनएसटी की तुलना में कम डिग्री तक। डब्ल्यूएचओ ग्रेड II एमपीएनएसटी में ट्यूमर कोशिकाओं के नाभिक बढ़े हुए आकार (न्यूरोफिब्रोमस में ट्यूमर सेल नाभिक के आकार के 3x से अधिक) और हाइपरक्रोमेशिया प्रदर्शित करते हैं। बढ़ी हुई माइटोटिक गतिविधि (<10 उच्च शक्ति क्षेत्रों में 4 माइटोज) डब्ल्यूएचओ ग्रेड II ट्यूमर के साथ जुड़ी हुई है, लेकिन इसकी आवश्यकता नहीं है।
      नोट: चूंकि उच्च-श्रेणी के ट्यूमर आमतौर पर निचले ग्रेड से प्रगति करते हैं, निम्न-ग्रेड और उच्च-ग्रेड क्षेत्र एक ही एमपीएनएसटी में मौजूद हो सकते हैं। इस परिस्थिति में, ट्यूमर का ग्रेड मौजूद उच्चतम श्रेणी के क्षेत्र द्वारा निर्धारित किया जाता है।
      नोट: मानव रोगविज्ञानियों के बीच विवाद है कि क्या ऊपर वर्णित डब्ल्यूएचओ ग्रेडिंग प्रणाली रोगी परिणामों की भविष्यवाणी है और इनमें से कुछ रोगविज्ञानी एमपीएनएसटी को निम्न ग्रेड या उच्च ग्रेड के रूप में वर्गीकृत करने के बजाय पसंद करते हैं। इस योजना के तहत, उच्च श्रेणी के एमपीएनएसटी में प्रमुख साइटोलॉजिक एटिपिया, तेज माइटोटिक गतिविधि (>10 उच्च शक्ति क्षेत्रों में 5 माइटोज) हैं, और नेक्रोसिस के साथ या बिना हाइपरसेल्युलरिटी चिह्नित है। निम्न-श्रेणी के एमपीएनएसटी में परिगलन की कमी होती है, लेकिन माइटोटिक गतिविधि, साइटोलॉजिक एटिपिया और सेल्युलरिटी दिखाते हैं जो एक उच्च ग्रेड एमपीएनएसटी और अज्ञात जैविक क्षमता (एएनयूबीपी) के साथ एक एटिपिकल न्यूरोफाइब्रोमैटस नियोप्लाज्म के बीच मध्यवर्ती है। हम ऊपर वर्णित प्रणाली को पसंद करते हैं क्योंकि ANNUBP और निम्न-श्रेणी के MPNST के बीच अंतर करना उन जांचकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है जिनके पास इन संस्थाओं के साथ लंबा अनुभव नहीं है।

6. प्रारंभिक मार्ग पी 0-जीजीएफ β3 एमपीएनएसटी कोशिकाओं की संस्कृतियों की तैयारी

  1. संस्कृति प्रारंभिक मार्ग पी 0-जीजीएफ β3 ताजा ट्यूमर टुकड़ा 2 (चरण 1.5, चित्रा 1 ए) से ट्यूमर कोशिकाओं। इस बिंदु से आगे बाँझ स्थिति बनाए रखें।
    1. ट्यूमर को छोटे (2-4 मिमी) टुकड़ों में काटकर और DMEM10 (Dulbecco का न्यूनतम आवश्यक माध्यम) में कीमा बनाकर अलग करें जिसमें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 μmol/L forskolin, और 10 nmol/L neuregulin 1β (NRG1β) 100 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन हों।
    2. कोशिकाओं कीमा बनाया हुआ ऊतक टुकड़े से बाहर विकसित करने के लिए 5% सीओ2 में 37 ओसी से बाहर बढ़ने के लिए जब तक प्लेटें संगम कर रहे हैं. हर 3-4 दिन में मीडिया बदलें।
    3. सेल संस्कृति को विभाजित करें। 100 मिमी डिश से मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें; कीमा बनाया हुआ ऊतक निकालें और त्यागें। पीबीएस निकालें और कमरे के तापमान पर 2-5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के 1 एमएल जोड़ें। सेल टुकड़ी को बढ़ावा देने के लिए, धीरे थाली नल और एक प्रकाश खुर्दबीन का उपयोग टुकड़ी के लिए की जाँच करें; आवश्यकतानुसार ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन का विस्तार करें।
    4. DMEM10 के 2 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें। सेल निलंबन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और गोली कोशिकाओं को 5 मिन के लिए 500 × ग्राम पर स्थानांतरित करें। मीडिया निकालें और गोली के लिए ताजा DMEM10 के 5 एमएल जोड़ें.
    5. डीएमईएम10युक्त दो से चार 100 मिमी व्यंजन में सेल निलंबन वितरित करें। कोशिकाओं को पांच से अधिक मार्ग (चरण 6.1.3 और 6.1.4) के लिए विभाजित न करें और उन्हें forskolin और NRG1β के बिना DMEM में बनाए रखें। भविष्य में उपयोग के लिए मार्ग 2 पर कोशिकाओं को फ्रीज करना याद रखें।

7. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि करना

  1. 6-अच्छी तरह से बाँझ टिशू संस्कृति व्यंजन के कुओं में बाँझ 18 मिमी # 1.5 गोल ग्लास coverslips रखें.
    1. कवरस्लिप को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में कुओं में पॉली-एल-लाइसिन/लेमिनिन समाधान रखें। वाष्पीकरण को कम करने के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ प्लेट को सील करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. अगली सुबह, बाँझ पीबीएस के साथ coverslips 3x धो लें.
      नोट: हमने अनकोटेड कवरस्लिप पर प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी कोशिकाओं को प्लेट करने का प्रयास किया है और पाया है कि कोशिकाएं पॉली-एल-लाइसिन / लैमिनिन कोटिंग की अनुपस्थिति में अच्छी तरह से पालन नहीं करती हैं।
    2. कवरस्लिप पर प्लेट 10,000 कोशिकाओं को धीरे-धीरे कवरस्लिप युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से विकास मीडिया में सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़कर कवरस्लिप पर प्लेट करें। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    3. अगली सुबह, पीबीएस के साथ 2 एक्स 5 मिनट के लिए coverslips कुल्ला.
    4. कमरे के तापमान पर 18 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    5. पीबीएस के साथ कवरस्लिप 3 एक्स 5 मिनट कुल्ला. यदि वांछित है, तो प्लास्टिक की फिल्म का उपयोग करके प्लेट को सील करें और इसे इस बिंदु पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. पीबीएस में ताजा 50 एमएम एनएच4सीएल बनाएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 50 एमएम एनएच4सीएल में कवरस्लिप इनक्यूबेट करके एल्डिहाइड बुझाना।
    7. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.3% ट्राइटन एक्स -100 में coverslips इनक्यूबेट द्वारा कोशिकाओं permeabilize. पीबीएस के साथ 3 एक्स 5 मिनट के लिए कवरस्लिप धो लें।
    8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बफर (1x पीबीएस युक्त 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 0.2% नॉनफैट सूखा दूध, और 0.3% ट्राइटन एक्स -100) को अवरुद्ध करने में कवरस्लिप को इनक्यूबेट करके गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को ब्लॉक करें।
    9. अवरुद्ध बफर निकालें और मूल ट्यूमर (आमतौर पर S100β, Nestin, और Sox10) में मौजूद MPNST मार्करों को पहचानने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, जो अवरुद्ध बफर में पूर्व निर्धारित इष्टतम कमजोर पड़ने के लिए पतला होता है। प्लास्टिक की फिल्म के साथ प्लेट लपेटें और एक आर्द्र कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    10. अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट धोएं। फ्लोरोसेंटली लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी बफर अवरुद्ध में पतला जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. प्रकाश से बचाएं।
    11. पीबीएस के साथ 3 एक्स 5 मिनट धो लें. 10 मिनट के लिए Hoechst डाई के 1-5 μg में coverslips सेते हैं. प्रकाश से बचाने के लिए जारी रखें.
    12. 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ coverslips धो लें. 1:1 1x पीबीएस/ग्लिसरॉल का उपयोग करके स्लाइड माउंट करें। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवि।

8. tumorigenicity प्रदर्शित करने के लिए प्रारंभिक मार्ग ट्यूमर कोशिकाओं के allograft

  1. DMEM10 से 80% संगम में प्रारंभिक मार्ग P 0-GGFβ3 MPNST कोशिकाओं को उगाएं। कमरे के तापमान हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला। सब्सट्रेट से उन्हें हटाने के लिए एक गैर एंजाइमी सेल पृथक्करण समाधान के साथ 30 एस से 1 मिनट के लिए कोशिकाओं का इलाज करें। एक गैर एंजाइमी सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल प्रति DMEM10 के 5 एमएल जोड़ें.
    नोट: सेलुलर पृथक्करण में 10-20 मिनट तक बहुत अधिक समय लग सकता है। कृपया निर्माता का प्रोटोकॉल देखें।
    नोट: संगम के लिए कोशिकाओं को विकसित न करें क्योंकि यह ग्राफ्ट प्रभावशीलता को कम कर देगा।
    1. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 5 मिन के लिए 5 × ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें और उन्हें डीएमईएम10के 100 माइक्रोन प्रति 1-2 ×10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता पर फिर से निलंबित करें। इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
    2. एनेस्थेटाइज NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) चूहों को आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र के इंडक्शन चैंबर में। अपने पेट पर पशु रखें और 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट बाँझ. इंजेक्शन से पहले साइट को हवा में सूखने दें। इंजेक्शन से पहले, कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर आने की अनुमति दें।
    3. सही पार्श्व में चमड़े के नीचे 1-2 एक्स 106 कोशिकाओं इंजेक्षन. माउस को अकेले बिस्तर मुक्त पिंजरे में रखें और इसे ठीक करने की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए पिंजरे का केवल एक हिस्सा हीटिंग पैड पर है। यह एक ज़ोन प्रदान करता है जिसे माउस ज़्यादा गरम होने पर स्थानांतरित कर सकता है।
      नोट: हम प्रत्येक प्रारंभिक मार्ग संस्कृति के साथ तीन चूहों की एक न्यूनतम ग्राफ्ट के रूप में कुछ grafts नहीं ले सकता है.
    4. ग्राफ्ट को 15-60 दिनों तक बढ़ने दें; पशु स्वास्थ्य 3x साप्ताहिक का आकलन करें और प्रत्येक परीक्षा में वजन और व्यवहार में परिवर्तन सहित शरीर की स्थिति के स्कोर रिकॉर्ड करें। चूहों को समाप्त करें जो अधिकतम स्वीकार्य ग्राफ्ट आकार या मरणासन्न चूहों तक पहुंच गए हैं, कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु का उपयोग करके गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद। दिनों में मृत्यु पर रिकॉर्ड उम्र। जैसे ही ट्यूमर बाहरी रूप से दिखाई देते हैं, ट्यूमर आयाम (लंबाई, चौड़ाई और ऊंचाई) रिकॉर्ड करते हैं।
      नोट: हमारे अनुभव में, अलग-अलग प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी संस्कृतियां अलग-अलग दक्षता के साथ ग्राफ्ट करती हैं और ग्राफ्ट विकास के लिए आवश्यक समय में भिन्न होती हैं। जानवरों को IACUC द्वारा अनुमोदित अधिकतम स्वीकार्य ट्यूमर आकार और/या मानवीय समापन बिंदु से आगे बढ़ने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।
  2. ट्यूमर की कटाई करें, इसे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें, इसे पैराफिन में एम्बेड करें, और एच एंड ई दाग का प्रदर्शन करें जैसा कि 2.1-2.2.9 वर्गों में वर्णित है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि एलोग्राफ्ट एक प्रतिक्रियाशील ऊतक के बजाय एक ट्यूमर है। यदि आवश्यक हो, तो माता-पिता ट्यूमर में मौजूद मार्करों के लिए ग्राफ्ट को इम्यूनोस्टेन करें।

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Representative Results

चित्रा 2 पी 0-जीजीएफ β3 चूहों में उत्पन्न होने वाले सकल स्पष्ट नियोप्लाज्म के उदाहरणों को दिखाता है। ट्यूमर है कि आसानी से नग्न आंखों के साथ पहचाने जाते हैं चित्रा 2 ए (तीर) में दिखाया के रूप में शरीर क्षेत्रों distenending जन के रूप में देखा जा सकता है. यह निर्धारित करते समय कि क्या नियोप्लाज्म संभावित रूप से एक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर है, यह स्थापित करना आवश्यक है कि ट्यूमर एक परिधीय तंत्रिका से जुड़ा हुआ है। इस उदाहरण में, एक एमआरआई स्कैन (चित्रा 2 बी) दर्शाता है कि ट्यूमर कटिस्नायुशूल तंत्रिका (तीरहेड) से जुड़ा हुआ है; माउस को इच्छामृत्यु और ट्यूमर को विदारक करने के बाद इस एसोसिएशन की पुष्टि की गई थी। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक बड़ा आकार जरूरी संकेत नहीं देता है कि ट्यूमर घातक है। इस मामले में, ट्यूमर (चित्रा 2 सी) की एक हिस्टोलॉजिक परीक्षा से पता चला कि यह एक न्यूरोफिब्रोमा था। आमतौर पर, हालांकि, माउस के नेक्रोप्सी करने तक मोटे तौर पर स्पष्ट ट्यूमर की पहचान नहीं की जाती है। चित्रा 2 डी एक बड़े, मांसल एमपीएनएसटी को दिखाता है जो इस जानवर के ब्रेकियल प्लेक्सस के भीतर उत्पन्न हुआ था।

चित्रा 3 प्रोटोकॉल खंड 1 में उल्लिखित प्रक्रियाओं के अनुसार तैयार पी 0-जीजीएफ β3 चूहों से एमपीएनएसटी और न्यूरोफिब्रोमस के प्रतिनिधि उदाहरणों को दिखाता है। चित्रा 3 ए-जे हमारे पी 0-जीजीएफ β 3 माउस कॉलोनी से स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी के दस उदाहरणों को दिखाता है। ध्यान दें कि एमपीएनएसटी की हिस्टोलॉजिक उपस्थिति अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती है, यहां तक कि एक ही जानवर में स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी के बीच भी। यह हिस्टोलॉजिक परिवर्तनशीलता बताती है कि हम नियमित रूप से इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग के साथ पी 0-जीजीएफ β 3 एमपीएनएसटी के निदान की पुष्टि क्यों करते हैं। हम यह भी इंगित करेंगे कि अन्य, जाहिरा तौर पर असंबंधित ट्यूमर प्रकार कुछ जन्मजात माउस उपभेदों में कम आवृत्ति पर छिटपुट रूप से होते हैं (उदाहरण के लिए, हमने कई बार पी 0-जीजीएफ β 3 चूहों में लिम्फोमा का सामना किया है जो ट्रांसजीन को ले जा रहे हैं C57BL/6J पृष्ठभूमि), ट्यूमर निदान की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करने के महत्व पर और जोर देना। उनके हिस्टोलॉजिक उपस्थिति की परिवर्तनशीलता के बावजूद, चित्रा 3ए-जे में सचित्र सभी दस ट्यूमर S100β और नेस्टिन के लिए इम्यूनोएक्टिव थे और अन्य ट्यूमर प्रकारों के मार्करों के लिए नकारात्मक थे। चित्रा 3K एक ठीक से decalcified कशेरुक स्तंभ और संबंधित ऊतकों की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है. ध्यान दें कि रीढ़ की हड्डी, तंत्रिका जड़ें, कशेरुक शरीर और कंकाल की मांसपेशी सभी एक दूसरे के साथ अपने उचित शारीरिक संबंध बनाए रखते हैं। चित्रा 3 एल कशेरुक शरीर और रीढ़ की हड्डी के ऊपर की एक उच्च शक्ति छवि है। चूंकि इस ऊतक को ठीक से डीकैल्सीफाइड किया जाता है, हड्डी बिना कतरन या तह के आसानी से कट जाती है, और अस्थि मज्जा मज्जा रिक्त स्थान में आसानी से पहचाना जा सकता है। यदि ऊतक को ठीक से विघटित नहीं किया गया होता, तो यह माइक्रोटोम ब्लेड पर पकड़ा जाता और आसन्न ऊतकों (रीढ़ की हड्डी, रीढ़ की हड्डी की जड़ों और कंकाल की मांसपेशी) को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचाते हुए खंड से बाहर निकल जाता। चित्रा 3M एक पी 0-GGFβ3 माउस में पृष्ठीय तंत्रिका जड़ के भीतर उत्पन्न होने वाली एक न्यूरोफिब्रोमा की एक प्रतिनिधि छवि प्रस्तुत करता है। ध्यान दें कि यह ट्यूमर चित्रा 3 ए-जे में दिखाए गए एमपीएनएसटी की तुलना में कम सेलुलर है। न्यूरोफिब्रोमस के लिए महत्वपूर्ण निदान यह है कि वे नियोप्लास्टिक श्वान कोशिकाओं और गैर-नियोप्लास्टिक मस्तूल कोशिकाओं, मैक्रोफेज, फाइब्रोब्लास्ट्स और पेरिन्यूरियल जैसे तत्वों के एक जटिल मिश्रण से बने होते हैं जो तंत्रिका में घुसपैठ करते हैं और अक्षतंतु को अलग फैलाते हैं।

चित्रा 4 दाग है कि एक plexiform neurofibroma की प्रारंभिक पहचान के लिए सबसे उपयोगी होते हैं और एक plexiform neurofibroma और एक MPNST के बीच भेद के उदाहरण दिखाता है. चित्रा 4A एक पी 0-GGFβ3 plexiform न्यूरोफिब्रोमा में S100β immunoreactivity दिखाता है। ध्यान दें कि S100β immunoreactivity केवल कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या में स्पष्ट है, जो इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए है कि न्यूरोफिब्रोमस नियोप्लास्टिक श्वान कोशिकाओं और अन्य गैर-नियोप्लास्टिक तत्वों (फाइब्रोब्लास्ट्स, मस्तूल कोशिकाओं, मैक्रोफेज, पेरिन्यूरियल-जैसी कोशिकाओं, एक खराब परिभाषित CD34-immunoreactive सेलुलर आबादी, और वाहिका) के मिश्रण से बना है। दुर्भाग्य से, पैची S100β धुंधला plexiform neurofibromas और MPNSTs के बीच अंतर नहीं करता है क्योंकि S100β धुंधला MPNSTs में पैची हो सकता है (एच एंड ई धुंधला इस उद्देश्य के लिए उपयोगी है; हालांकि, चूंकि MPNSTs आमतौर पर plexiform neurofibromas की तुलना में अधिक सेलुलर होते हैं [चित्र 3 देखें])। नियोप्लास्टिक श्वान कोशिकाएं मध्यवर्ती फिलामेंट नेस्टिन के लिए भी इम्यूनोएक्टिव हैं जैसा कि चित्रा 4बी में प्रस्तुत पी 0-जीजीएफβ3 एमपीएनएसटी में दिखाया गया है। नियोप्लास्टिक श्वान कोशिकाएं भी अक्सर प्रतिलेखन कारक सॉक्स 10 के लिए परमाणु इम्यूनोरिएक्टिविटी प्रदर्शित करती हैं, जैसा कि चित्रा 4 सी में एमपीएनएसटी में दिखाया गया है। plexiform neurofibromas और MPNSTs के बीच भेद करने के लिए उपयोगी विशेषताएं Ki67 प्रसार मार्कर के लिए मस्तूल कोशिकाओं और प्रमुख immunoreactivity की उपस्थिति हैं. चित्रा 4 डी मस्तूल कोशिकाओं की उपस्थिति को उजागर करने के लिए पी 0-जीजीएफ β3 प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा पर किए गए एक उन्ना दाग को दिखाता है, जो उनके साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं के प्रमुख मेटाक्रोमैटिक वायलेट धुंधला द्वारा आसानी से पहचाने जा सकते हैं। एमपीएनएसटी में मस्तूल कोशिकाएं मौजूद नहीं हैं। इसके विपरीत, Ki67 immunoreactivity plexiform neurofibromas में लगभग न के बराबर है जैसा कि चित्रा 4E में दिखाए गए P 0-GGFβ3 ट्यूमर में देखा गया है। परमाणु Ki67 लेबलिंग आम तौर पर ट्यूमर कोशिकाओं के एक बहुत ही उच्च अंश में मौजूद है जैसा कि पी 0-जीजीएफβ3 माउस (चित्रा 4एफ)के ट्राइजेमिनल नाड़ीग्रन्थि में उत्पन्न होने वाले सूक्ष्म एमपीएनएसटी में देखा गया है।

चित्रा 5 दाग है कि हम पूरी तरह से एक नव विकसित जीईएम मॉडल में neurofibromas की सेलुलर संरचना विशेषता के प्रदर्शन के उदाहरण दिखाता है. यद्यपि इस आकृति में दिखाए गए दाग मानव त्वचीय न्यूरोफिब्रोमस में प्राप्त किए गए थे, लेकिन वे दिखने में समान हैं जो हमने जीईएम ट्यूमर में देखा है। सीडी 117 (सी-किट) के लिए इम्यूनोरिएक्टिविटी न्यूरोफिब्रोमस के भीतर मस्तूल कोशिकाओं में मौजूद है और इस प्रकार, उन्ना दाग के साथ जो देखा जाता है उसके समान वितरण होता है (चित्र 3 ए देखें)। मैक्रोफेज भी न्यूरोफिब्रोमस में बिखरे हुए मौजूद हैं, जैसा कि पैन-मैक्रोफेज मार्कर इबा 1 के साथ देखा गया है ( चित्र 5 डी देखें); इसमें मैक्रोफेज के उपवर्ग शामिल हैं जो सीडी 163 और सीडी 86 के लिए इम्यूनोएक्टिव हैं (क्रमशः चित्रा 5 बी और चित्रा 5 सी देखें)। न्यूरोफिब्रोमस में श्वानियन तत्व का एक अंश भी Sox10 के लिए परमाणु immunoreactivity प्रदर्शित करता है. फाइब्रोब्लास्ट्स को टीसीएफ 4 के लिए उनकी इम्यूनोरिएक्टिविटी द्वारा हाइलाइट किया जा सकता है। चित्रा 5 जी में, सीडी 31 न्यूरोफिब्रोमा के भीतर संवहनी तत्वों को लेबल करता है, जबकि सीडी 34, चित्रा 5 एच में दिखाया गया है, कोशिकाओं की एक गूढ़ डेंड्राइटिक आबादी को लेबल करता है जिसे या तो निवासी ऊतक मैक्रोफेज30 की उप-जनसंख्या या तंत्रिका म्यान कोशिकाओं की एक उपन्यास आबादी होने का सुझाव दिया गया है जो न तो श्वान कोशिकाएं हैं और न ही फाइब्रोब्लास्ट31।

चित्रा 6 पी 0-जीजीएफ β 3 चूहों में देखे गए ट्यूमर के लिए मानव प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस और एमपीएनएसटी की तुलना को सक्षम करने और एमपीएनएसटी के साथ भ्रमित हो सकने वाले कुछ मानव ट्यूमर प्रकारों के प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करने के लिए शामिल किया गया है। चित्रा 6 ए एक प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा दिखाता है जो एनएफ 1 रोगी के ब्रेकियल प्लेक्सस में उत्पन्न होता है, जबकि चित्रा 6 बी डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी प्रस्तुत करता है जो इसी प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा के भीतर उत्पन्न हुआ था। चित्रा 6 बी डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी की कुछ विशिष्ट विशेषताओं को दर्शाता है, जिसमें चिह्नित हाइपरसेल्युलैरिटी और सेलुलर एटिपिया, तेज माइटोटिक गतिविधि और ट्यूमर नेक्रोसिस शामिल हैं। तुलना के लिए, चित्रा 6 सी एक डब्ल्यूएचओ ग्रेड द्वितीय एमपीएनएसटी दिखाता है जिसमें महत्वपूर्ण सेलुलर एटिपिया है लेकिन ग्रेड IV एमपीएनएसटी की तुलना में कम हाइपरसेलुलर है और, हालांकि मिटोस मौजूद हैं, कम माइटोटिक गतिविधि प्रदर्शित करता है। चित्रा 6 डी ट्यूमर कोशिकाओं के इंटरविविंग शीथ की अपनी विशेषता "हेरिंगबोन" पैटर्न के साथ एक फाइब्रोसारकोमा दिखाता है। यह पैटर्न आवश्यक रूप से फाइब्रोसारकोमा और एमपीएनएसटी के बीच अंतर नहीं करता है, हालांकि, क्योंकि कुछ एमपीएनएसटी में एक समान पैटर्न होगा। इसके अलावा, चित्रा 6E में प्रस्तुत उच्च-शक्ति दृश्य सेलुलर आकृति विज्ञान दिखाता है जो चित्रा 6 बी में प्रस्तुत डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी में देखा गया है। चित्रा 6 एफ एक लेयोमायोसारकोमा दिखाता है। अधिकांश एमपीएनएसटी के विपरीत, लेयोमायोसार्कोमा मांसपेशियों के मार्करों जैसे चिकनी मांसपेशी एक्टिन और डेस्मिन के लिए इम्यूनोरिएक्टिव हैं। चिकनी मांसपेशी एक्टिन इम्यूनोएक्टिविटी ट्यूमर से ट्यूमर तक परिवर्तनशील हो सकती है, हालांकि, कुछ ट्यूमर तीव्र वर्दी इम्यूनोएक्टिविटी (चित्रा 6जी) का प्रदर्शन करते हैं और अन्य इम्यूनोएक्टिविटी दिखाते हैं जो ट्यूमर (चित्रा 6एच) के भीतर सेलुलर परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। डेस्मिन इम्यूनोएक्टिविटी भी लेयोमायोसार्कोमा (चित्रा 6आई) में पैची हो सकती है। मेलेनोमा आकृति विज्ञान में अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, कुछ ट्यूमर बहुभुज कोशिकाओं (चित्रा 6 जे) से बने होते हैं और अन्य स्पिंडल कोशिकाओं से बने होते हैं जो एमपीएनएसटी कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की नकल कर सकते हैं। मेलेनोमा को एमपीएनएसटी से मेलेनोसोम मार्करों जैसे मार्ट1(चित्रा 6के)के लिए इम्यूनोरिएक्टिविटी द्वारा अलग किया जा सकता है। हालांकि, एमपीएनएसटी की तरह मेलेनोमा, अक्सर एस 100 डिग्री और सॉक्स 10 (चित्रा 6 एल) के लिए सकारात्मक होते हैं।

चित्रा 7 डब्ल्यूएचओ ग्रेड II, III, और IV MPNSTs P0-GGFβ3 चूहों से अलग की रोग संबंधी विशेषताओं को दिखाता है। चित्रा 8 कम (चित्रा 7 ए) और उच्च (चित्रा 7 बी) शक्ति पर प्रारंभिक मार्ग पी 0-जीजीएफ β3 एमपीएनएसटी कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है। इन कोशिकाओं की tumorigenicity दोनों कालोनियों फार्म जब नरम अगर (चित्रा 7C) में निलंबित कर दिया और grafts फार्म जब immunodeficiency चूहों (चित्रा 7D) में चमड़े के नीचे allografted बनाने के द्वारा प्रदर्शित किया है.

Figure 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो पी 0-GGFβ3 चूहों से ट्यूमर और अन्य ऊतकों को संसाधित करने के लिए इस्तेमाल किया. (ए) मोटे तौर पर दिखाई देने वाले ट्यूमर को काटा जाता है और 1 के लिए तीन भागों में विभाजित किया जाता है) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और हिस्टोकेमिस्ट्री के बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में निर्धारण, 2) प्रारंभिक मार्ग ट्यूमर सेल संस्कृति और / या जीनोमिक विश्लेषण की स्थापना, और 3) प्रोटीन, डीएनए या आरएनए अलगाव के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके स्नैप-फ्रीजिंग। (बी) ट्यूमर के छांटने के बाद, माउस का शरीर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय हो जाता है और आंतरिक अंगों को हटा दिया जाता है। इन अंगों को हिस्टोलॉजिक परीक्षा के लिए नमूना लिया जाता है जो नियोप्लाज्म और अन्य रोग प्रक्रियाओं के सूक्ष्म साक्ष्य की पहचान करने के लिए किया जाता है। (सी) आंतरिक अंगों को हटाने के बाद, शव से चरम सीमाओं (सिर, अंग, पूंछ) और त्वचा को हटा दिया जाता है। कशेरुक स्तंभ, आसन्न पसलियों, और आसन्न कंकाल की मांसपेशी 0.3 एम EDTA/4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएच 8.0) का उपयोग करके विघटित होती है। डिकैल्सीफाइड ऊतक तब पैराफिन-एम्बेडेड होते हैं और ऊतकों के वर्गों को इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोकेमिकल परीक्षा के लिए तैयार किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पी 0-जीजीएफβ3 चूहों में सकल रूप से स्पष्ट न्यूरोफिब्रोमस और एमपीएनएसटी की प्रतिनिधि छवियां। (ए) पी0-जीजीएफβ3 माउस दाएं फ्लैंक (तीर) पर एक बड़े स्थूल स्पष्ट ट्यूमर के साथ। (बी) इस माउस के एक एमआरआई स्कैन से पता चलता है कि ट्यूमर कटिस्नायुशूल तंत्रिका (तीरहेड) से जुड़ा हुआ है और यह चमड़े के नीचे (तीर, थोक ट्यूमर द्रव्यमान) के भीतर विस्तार करने के लिए अतिव्यापी प्रावरणी के माध्यम से उगाया गया है। (सी) इस ट्यूमर की सूक्ष्म परीक्षा से पता चलता है कि, इसके बड़े आकार के बावजूद, ट्यूमर एक न्यूरोफिब्रोमा है। (डी) बड़े मांसल एमपीएनएसटी जो पी 0-जीजीएफβ3 माउस के ब्रेकियल प्लेक्सस में उत्पन्न हुए। स्केल बार = 100 माइक्रोन (सी)। संक्षिप्ताक्षर: एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर; एमआरआई = चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमपीएनएसटी, डीकैल्सीफाइड कशेरुक कॉलम और न्यूरोफिब्रोमस की प्रतिनिधि छवियां प्रोटोकॉल सेक्शन 1 में वर्णित के रूप में तैयार की गईं। (ए-जे) Excised और H&E-सना हुआ P 0-GGFβ3 MPNSTs हिस्टोलॉजिक परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। सभी छवियां स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी हैं। इस हिस्टोलॉजिक परिवर्तनशीलता के बावजूद, इन ट्यूमर ने तालिका 1में इंगित एमपीएनएसटी मार्करों के लिए उपयुक्त लेबलिंग दिखाई। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (के) डीकैल्सीफाइड कशेरुक स्तंभ के एच एंड ई-दाग वाले क्रॉस-सेक्शन की प्रतिनिधि छवि। इस छवि में निम्नलिखित संरचनाओं को आसानी से देखा जाता है: रीढ़ की हड्डी; कशेरुक हड्डी; पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी तंत्रिका जड़ पर पृष्ठीय जड़ गैन्ग्लिया; और पैरावर्टेब्रल कंकाल की मांसपेशी। आवर्धन 4x. (एल) K में दिखाया रीढ़ की हड्डी और कशेरुका की एक उच्च शक्ति छवि इस पद्धति के साथ decalcification के बाद हड्डी की उचित उपस्थिति को दर्शाता है. आवर्धन 10x. (एम) एक पी 0-GGFβ3 माउस में एक पृष्ठीय तंत्रिका जड़ neurofibroma की प्रतिनिधि छवि. आवर्धन 40x। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर; H&E = hematoxylin और eosin। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नैदानिक दाग plexiform neurofibromas और MPNSTs से उनके भेद की प्रारंभिक पहचान के लिए इस्तेमाल किया. (ए) एक पी 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma में S100β के लिए immunostains. ध्यान दें कि इस एंटीजन के लिए तीव्र भूरे रंग का धुंधला केवल इस ट्यूमर में कोशिकाओं के सबसेट में मौजूद है, इस तथ्य के अनुरूप है कि न्यूरोफिब्रोमस नियोप्लास्टिक श्वान कोशिकाओं और कई अन्य गैर-नियोप्लास्टिक सेल प्रकारों से बना है। (बी)मध्यवर्ती फिलामेंट नेस्टिन (लाल) के लिए दाग पी 0-जीजीएफβ3 एमपीएनएसटी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि और बिस्बेंज़िमाइड (नीला, परमाणु दाग) के साथ मुकाबला किया गया। (सी) एमपीएनएसटी प्रतिलेखन कारक Sox10 के लिए दाग दिया। तीव्र immunoreactivity (भूरा) ट्यूमर कोशिकाओं के एक सबसेट के नाभिक में स्पष्ट है. (डी) एक उन्ना दाग के बाद एक पी 0-जीजीएफ β 3 प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा का उच्च शक्ति दृश्य। यह दाग मस्तूल कोशिकाओं में कणिकाओं के मेटाक्रोमैटिक (बैंगनी) धुंधला पैदा करता है। प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस को एमपीएनएसटी से अलग किया जा सकता है क्योंकि बाद में मस्तूल कोशिकाओं की कमी होती है। (ई, एफ) Ki67 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (E) A P 0-GGFβ3 plexiform न्यूरोफिब्रोमा और (F) a P0-GGFβ3 MPNST में। दोनों वर्गों hematoxylin के साथ counterstained किया गया है (नीले परमाणु धुंधला), Ki67 immunoreactivity इन immunoperoxidase दाग में भूरे रंग के परमाणु धुंधला के रूप में स्पष्ट किया जा रहा है. ध्यान दें कि प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा में कोई भूरा परमाणु धुंधला स्पष्ट नहीं है, जबकि अधिकांश ट्यूमर सेल नाभिक एमपीएनएसटी में सकारात्मक हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: MPNST = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: न्यूरोफिब्रोमस की रचना करने वाली कोशिकाओं की उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोस्टेन की प्रतिनिधि छवियां। मानव त्वचीय न्यूरोफिब्रोमा से इन इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियों को (ए) सीडी 117 (सी-किट; मस्तूल कोशिकाओं का एक मार्कर), (बी) सीडी 163 (एम 2 मैक्रोफेज), (सी) सीडी 86 (एम 1 मैक्रोफेज), (डी) आईबीए 1 (पैन-मैक्रोफेज मार्कर), (ई) सॉक्स 10 (श्वान सेल मार्कर), (एफ) टीसीएफ 4 (फाइब्रोब्लास्ट मार्कर), (जी) सीडी 31 (वाहिका का मार्कर), और (एच) सीडी 34 (न्यूरोफिब्रोमस में कोशिकाओं की एक विशिष्ट, खराब समझी गई उप-जनसंख्या को चिह्नित करता है)। आवर्धन 60x, स्केल बार = 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास, एमपीएनएसटी, और कुछ अन्य मानव ट्यूमर प्रकारों की प्रतिनिधि छवियां जिन्हें एमपीएनएसटी के विभेदक निदान में माना जाता है। (ए) एनएफ 1 रोगी के ब्रेकियल प्लेक्सस में उत्पन्न होने वाले प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा, इस नियोप्लाज्म की समग्र निचली सेल्युलरिटी और सौम्य उपस्थिति दिखाते हैं। हालांकि एच एंड ई दाग वर्गों में आसानी से कल्पना नहीं की जाती है, सेल प्रकारों का एक जटिल मिश्रण मौजूद है। माइटोज नहीं देखे जाते हैं। आवर्धन: 40x। (बी) एक डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी जो ए में सचित्र प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा से उत्पन्न हुआ। सेल्युलरता की बहुत अधिक डिग्री पर ध्यान दें। तीर एक माइटोटिक आकृति को इंगित करता है, और तारांकन इस सूक्ष्म क्षेत्र के ऊपरी दाएं हिस्से में ट्यूमर नेक्रोसिस के एक क्षेत्र को दर्शाता है। आवर्धन: 40x. (सी) एक डब्ल्यूएचओ ग्रेड द्वितीय एमपीएनएसटी। इस ट्यूमर में बी में सचित्र डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी की तुलना में सेल्युलरिटी की कम डिग्री है। हालांकि, ए में सचित्र प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा में स्पष्ट होने की तुलना में अधिक परमाणु एटिपिया और हाइपरक्रोमेशिया है। तीर सामयिक माइटोटिक आंकड़ों में से एक को इंगित करता है जो इस नियोप्लाज्म में सामने आए थे। आवर्धन: 63x। (डी) एक वयस्क-प्रकार के फाइब्रोसारकोमा का एक कम-शक्ति दृश्य जो "हेरिंगबोन" पैटर्न (ट्यूमर कोशिकाओं के इंटरविविंग म्यान) को दर्शाता है जो आमतौर पर इस ट्यूमर प्रकार में देखा जाता है। दुर्भाग्य से, कुछ मानव एमपीएनएसटी में हेरिंगबोन आर्किटेक्चर का भी सामना करना पड़ता है और इसलिए इसका उपयोग फाइब्रोसारकोमा और एमपीएनएसटी के बीच अंतर करने के लिए नहीं किया जा सकता है। आवर्धन: 20x। (ई) डी में सचित्र फाइब्रोसारकोमा का एक उच्च-शक्ति दृश्य। इस फाइब्रोसारकोमा में सेलुलर आकृति विज्ञान और बी में दिखाए गए डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी में स्पष्ट सेलुलर आकृति विज्ञान के बीच समानता पर ध्यान दें। आवर्धन: 40x। (एफ) एक लेयोमायोसार्कोमा की उच्च-शक्ति छवि, सेलुलर आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती है जो एमपीएनएसटी में देखी गई भिन्नता की सीमा के भीतर आती है। बढ़ाई: 40x। (जी) एफ में सचित्र लेयोमायोसार्कोमा में चिकनी मांसपेशी एक्टिन के लिए इम्यूनोस्टेन्स। ध्यान दें कि ट्यूमर कोशिकाएं इस एंटीजन के लिए एक समान तीव्र इम्युनोएक्टिविटी दिखाती हैं। आवर्धन: 40x. (एच) एक अलग leiomyosarcoma में चिकनी मांसपेशी actin के लिए immunostains. इस ट्यूमर में, इम्यूनोएक्टिविटी की डिग्री में अधिक परिवर्तनशीलता होती है, कुछ कोशिकाएं दूसरों की तुलना में अधिक तीव्रता से धुंधली होती हैं। एक ही एंटीजन के लिए इम्यूनोएक्टिविटी के लिए एक ट्यूमर में समान रूप से मौजूद होना और केवल एक अलग नियोप्लाज्म में ट्यूमर कोशिकाओं के सबसेट में मौजूद होना असामान्य नहीं है। आवर्धन: 40x। (I) तीसरे लेयोमायोसारकोमा में डेस्मिन के लिए इम्यूनोस्टेन। इस ट्यूमर में, ट्यूमर कोशिकाओं का केवल एक सबसेट इस एंटीजन के लिए तीव्रता से प्रतिरक्षात्मक है। (जे) मेटास्टैटिक मेलेनोमा। मेलेनोमा अत्यधिक परिवर्तनशील आकृति विज्ञान के लिए कुख्यात हैं जो क्यूबाइडल से स्पिंडल तक हो सकते हैं; उत्तरार्द्ध आकृति विज्ञान के साथ ट्यूमर सबसे अधिक MPNSTs के साथ भ्रमित होने की संभावना है, विशेष रूप से यह देखते हुए कि मेलेनोमा और MPNSTs दोनों S100β और Sox10 immunoreactivity प्रदर्शित कर सकते हैं. आवर्धन: 40x। (K) J में सचित्र ट्यूमर में मेलेनोमा मार्कर MART1 के लिए इम्यूनोरिएक्टिविटी। आवर्धन: 40x. (एल) जे में दिखाए गए मेलेनोमा में प्रतिलेखन कारक Sox10 के लिए परमाणु इम्यूनोरिएक्टिविटी। बढ़ाई: 40x, स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्तीकरण: MPNST = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: डब्ल्यूएचओ ग्रेड II-IV P 0-GGFβ3 MPNSTs की प्रतिनिधि छवियां। (ए) डब्ल्यूएचओ ग्रेड II एमपीएनएसटी के निम्न- और (बी) उच्च-शक्ति फोटोमाइक्रोग्राफ। ध्यान दें कि सेल्युलरिटी पैनल सी में सचित्र डब्ल्यूएचओ ग्रेड III एमपीएनएसटी से कम है और डी में ट्यूमर कोशिकाओं के नाभिक पैनल बी में देखे गए लोगों की तुलना में अधिक हाइपरक्रोमैटिक (गहरा) हैं। (सी) डब्ल्यूएचओ ग्रेड III एमपीएनएसटी के निम्न और (डी) उच्च शक्ति फोटोमाइक्रोग्राफ। इस ट्यूमर ने प्रति 10 उच्च-शक्ति क्षेत्रों में >4 माइटोटिक आंकड़े प्रदर्शित किए, जिसमें कोशिकाएं अधिक घनी और अधिक हाइपरक्रोमैटिक, एटिपिकल नाभिक थीं। (ई) डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV एमपीएनएसटी के निम्न- और (एफ) उच्च-शक्ति विचार। पैनल एफ के निचले केंद्र भाग में परिगलन के फोकस पर ध्यान दें। कम शक्ति = 20x। उच्च शक्ति = 40x, स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: प्रारंभिक मार्ग पी 0-जीजीएफ β3 एमपीएनएसटी कोशिकाओं और उनके ट्यूमरजेनेसिटी की प्रतिनिधि छवियां जैसा कि नरम अगर में वृद्धि और एलोग्राफ्ट के रूप में बढ़ने की उनकी क्षमता द्वारा प्रदर्शित किया गया है। (ए) कम- और (बी) प्रारंभिक मार्ग पी0-जीजीएफ β3 एमपीएनएसटी कोशिकाओं की उच्च शक्ति चरण विपरीत छवियां। (सी) पी 0-जीजीएफ β3 एमपीएनएसटी कोशिकाएं नरम अगर में उगाई जाती हैं और सूडान काले रंग से दागती हैं; कॉलोनियों को अगर में काले पंक्टा के रूप में स्पष्ट किया जाता है। (डी)हेमटोक्सिलिन और एक ट्यूमर की ईोसिन-दाग वाली छवि जो पी 0-जीजीएफβ3 एमपीएनएसटी कोशिकाओं के बाद बनी थी, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस में चमड़े के नीचे आवंटित की गई थी। (ई)प्रारंभिक मार्ग पी 0-जीजीएफ β3 एमपीएनएसटी कोशिकाओं का प्रसार 5 दिन की अवधि में जैसा कि सेलिगो इमेज साइटोमीटर द्वारा निर्धारित किया गया है। कम शक्ति = 10x, उच्च शक्ति = 40x; स्केल बार = सभी पैनलों के लिए 100 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम उपयोग प्रजाति प्रतिक्रियाशीलता/वर्ग
सीडी117 प्रीडाइल्यूटेड खरगोश मोनोक्लोनल
सीडी163 1:200 माउस मोनोक्लोनल
सीडी31 1:50 खरगोश पॉलीक्लोनल
सीडी34 1:2000 खरगोश मोनोक्लोनल
सीडी86 1:1000 खरगोश मोनोक्लोनल
साइटोकैटिन 1 माइक्रोग्राम/एमएल माउस मोनोक्लोनल
डेसमिन 1:50 माउस मोनोक्लोनल
आईबीए1 1:500 पॉलीक्लोनल खरगोश
की-67 1:50 खरगोश मोनोक्लोनल
मार्ट1 1 माइक्रोग्राम/एमएल माउस मोनोक्लोनल
नेस्टिन 1:1,000 माउस मोनोक्लोनल
पीएमईएल 1:100 रब्बोट मोनोक्लोनल
एस100बी 1:200 खरगोश पॉलीक्लोनल
एसएमए 1:100 माउस मोनोक्लोनल
सॉक्स10 1:10 माउस मोनोक्लोनल
टीसीएफ4/टीसीएफएल2 1:100 खरगोश मोनोक्लोनल

तालिका 1: plexiform neurofibroma और घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर के निदान के लिए इस्तेमाल एंटीबॉडी . जीईएम प्लेक्सिफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस (S100β, Sox10, CD117, Ki67) की नियमित पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी, MPNSTs का निदान, और न्यूरोफिब्रोमस में मौजूद अन्य सेल प्रकारों का पूरा मूल्यांकन। संक्षिप्तीकरण: MPNST = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर।

एस100β नेस्टिन सॉक्स10 मार्ट1 पीएमईएल डेसमिन चिकनी मांसपेशी एक्टिन साइटोकैटिन SS18-SSX फ्यूजन
एमपीएनएसटी 50-90%, आमतौर पर फोकल सकारात्मक1 ~30% नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव
फाइब्रोसारकोमा नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव
लेयोमायोसार्कोमा विरल नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव 50-100% पॉज़िटीव ~40% नेगटिव
एपिथेलॉयड सरकोमा नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव पॉज़िटीव नेगटिव
मिलैनोमा पॉज़िटीव पॉज़िटीव 85% पॉज़िटीव पॉज़िटीव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव
मोनोफैसिक श्लेष सारकोमा ~30% नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव नेगटिव पॉज़िटीव पॉज़िटीव

तालिका 2: मार्करों मनुष्यों में ट्यूमर पहचान स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया. ये इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोकेमिकल मार्कर, ट्यूमर माइक्रोस्कोपिक आकृति विज्ञान के आकलन के साथ, एमपीएनएसटी को अन्य नियोप्लाज्म से अलग करने के लिए उपयोग किए जाते हैं जो उनकी नकल करते हैं। आमतौर पर मानव एमपीएनएसटी के लिए विचार किए जाने वाले विभेदक निदान में वयस्क-प्रकार के फाइब्रोसारकोमा, एपिथेलॉयड सार्कोमा, लेयोमायोसार्कोमा, मोनोफैसिक श्लेष सार्कोमा और मेलेनोमा शामिल हैं। वयस्क-प्रकार के फाइब्रोसारकोमा में हेरिंगबोन पैटर्न सूक्ष्म रूप से होता है और विमेंटिन के लिए दाग होता है, लेकिन S100β नहीं। Leiomyosarcomas, लेकिन MPNSTs नहीं, desmin के लिए immunoreactive हैं; Leiomyosarcomas में एक विशेष रूप से कुंद-समाप्त आकृति विज्ञान के साथ नाभिक भी होता है। एपिथेलॉइड सार्कोमा, लेकिन एमपीएनएसटी नहीं, साइटोकैटिन के लिए इम्यूनोएक्टिव हैं। एमपीएनएसटी की तरह मेलेनोमा, एस 100 डिग्री पॉजिटिव हो सकता है, लेकिन मार्ट -1 और पीएमईएल के लिए भी इम्यूनोएक्टिव है। संक्षिप्तीकरण: MPNST = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर। 1S100β और नेस्टिन का संयोजन MPNST का अत्यधिक पूर्वानुमानित।

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Discussion

यहां प्रस्तुत हिस्टोलॉजिकल और जैव रासायनिक तरीके न्यूरोफिब्रोमा और एमपीएनएसटी रोगजनन के जीईएम मॉडल के निदान और विशेषता के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं। इन वर्षों में, हम इन पद्धतियों जीईएम मॉडल 21,25,26में उत्पन्न होने वाली परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर के विकृति का आकलन करने के लिए काफी उपयोगी हो पाया है. हालांकि, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने के लिए उपयोगी हैं कि जीईएम मॉडल में ट्यूमर अपने मानव समकक्षों की विकृति को कैसे पुन: व्यवस्थित करते हैं, इन रणनीतियों की कुछ सीमाएं हैं जिनकी सराहना की जानी चाहिए। शुरू करने के लिए, पी 0-जीजीएफβ3 चूहों ने अपने ट्यूमर फेनोटाइप की लगभग पूरी पैठ दिखाई, जो न्यूरोफिब्रोमस और एमपीएनएसटी 21,25,26 के साथ बड़ी संख्या में चूहों को प्राप्त करना अपेक्षाकृत आसान बनाता है जिनका उपयोग जीनोमिक अध्ययन और जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल में फेनोटाइप की उच्च पैठ भी पी 0-जीजीएफ β3 चूहों को प्रीक्लिनिकल परीक्षणों के लिए काफी उपयोगी बनाती है। हालांकि, यह माना जाना चाहिए कि यह सभी जीईएम कैंसर मॉडल के लिए मामला नहीं होगा। यही कारण है कि हमने जानवरों के अंश को निर्धारित करने के महत्व पर जोर दिया है जिन्हें ट्यूमर विकसित करने के लिए भविष्यवाणी की जा सकती है। एक पशु मॉडल के साथ काम करते समय जो कम सामान्यतः ट्यूमर विकसित करता है, हमने इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करना फायदेमंद पाया है जैसे कि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग या पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी निश्चित रूप से ट्यूमर ले जाने वाले जानवरों की पहचान करने के लिए जिन्हें प्रीक्लिनिकल परीक्षणों या अन्य अध्ययनों में दर्ज किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हो सकता है, हालांकि, यदि बार-बार स्कैन की आवश्यकता होती है। यही कारण है कि हमने ब्याज26-समझ के जीईएम मॉडल के औसत अस्तित्व के समय को स्थापित करने के महत्व पर भी जोर दिया, जब एक जानवर को ट्यूमर विकसित करने की उम्मीद की जा सकती है, तो वांछित फेनोटाइप और संबंधित लागतों के साथ जानवरों की पहचान करने के लिए आवश्यक स्कैन की संख्या कम हो जाती है।

यह भी एक माउस में एक बड़ा ट्यूमर अभी भी वास्तव में ऊतक की एक छोटी राशि है कि पहचानने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक ऐसी प्रक्रिया की अनुशंसा करते हैं जिसमें ट्यूमर ऊतक को तिहाई में विभाजित किया जाता है, जिसमें ऊतक विज्ञान / इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए समर्पित भाग होते हैं, प्रारंभिक मार्ग सेल संस्कृतियों की स्थापना, और ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स (प्रोटीन, आरएनए, डीएनए) का अलगाव। हालांकि, ट्यूमर का आकार अलग-अलग होगा और यदि ट्यूमर काफी छोटा है, तो यह इस फैशन में विभाजित करने के लिए पर्याप्त ऊतक होने से रोक सकता है। उस मामले में, अन्वेषक ट्यूमर निदान या ट्यूमर ऊतक का एक और उपयोग32 प्राथमिकता दी है कि क्या निर्धारित करना होगा. उन परिस्थितियों में, हमारा पूर्वाग्रह यह है कि अन्य प्रयोगों को शुरू करने से पहले हम यह समझने के लिए उचित निदान होना चाहिए कि हम क्या काम कर रहे हैं। हमने पाया है कि ट्यूमर निदान आमतौर पर नियोप्लाज्म के एक तिहाई से भी कम का उपयोग करके आसानी से स्थापित किया जा सकता है। छोटे ट्यूमर से निपटने के दौरान, हम इसके बजाय आम तौर पर ट्यूमर ऊतक के एक छोटे से टुकड़े को हटा देंगे, इसे ऊतक ऊतक ऊतक में लपेटेंगे और यह सुनिश्चित करने के लिए ऊतक कैसेट में रखेंगे कि प्रसंस्करण के दौरान ऊतक खो नहीं गया है। इस दृष्टिकोण का नुकसान यह है कि यह अन्वेषक को नियोप्लाज्म को कम करने का कारण बन सकता है यदि डब्ल्यूएचओ ग्रेडिंग वांछित है; ऐसा इसलिए है क्योंकि निम्न और उच्च-श्रेणी के क्षेत्र आमतौर पर कैंसर में सह-अस्तित्व में होते हैं और, यदि बहुत छोटा नमूना लिया जाता है, तो प्राप्त ग्रेड इस बात पर निर्भर करेगा कि ट्यूमर का नमूना कहां से लिया गया था।

परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर पहचान स्थापित करने के लिए हम जिन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, वे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं। हालांकि कभी-कभी वैकल्पिक दृष्टिकोण होते हैं जिनका उपयोग कुछ सेल प्रकारों के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, मस्तूल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उन्ना दाग का प्रदर्शन करना), यह न्यूरोफिब्रोमस और एमपीएनएसटी में मौजूद अधिकांश सेल प्रकारों के लिए समान रूप से सच नहीं है। नतीजतन, यह स्थापित करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए कि जिन इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाएगा, उन्हें ठीक से अनुकूलित किया गया है। हमारे अनुभव में, कई मुद्दे नैदानिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से समझौता कर सकते हैं। यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि अन्वेषक एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला का प्रदर्शन करता है जिसका उन्होंने पहले उपयोग नहीं किया है; इसके अलावा, एक कमजोर पड़ने श्रृंखला पहले33 अनुकूलित किया गया है कि एक एंटीबॉडी का एक नया बैच का उपयोग करते समय प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यह सुनिश्चित करने के लिए भी देखभाल की जानी चाहिए कि अभिकर्मकों के नए बैच हाथ में हैं। हमारे अनुभव में, जब वे उम्र देते हैं, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और डीएबी विशेष रूप से ठीक से प्रदर्शन नहीं करने के लिए प्रवण होते हैं, जो अन्वेषक को अनुचित रूप से निर्णय लेने के लिए प्रेरित कर सकते हैं कि उनके दाग नकारात्मक हैं।

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोफाइल जो हम प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास, एमपीएनएसटी, और एमपीएनएसटी के विभेदक निदान में माने जाने वाले विभिन्न प्रकार के नियोप्लाज्म के लिए वर्णन करते हैं, वे हैं जिन्हें हमने आमतौर पर 21,25,26,34का सामना किया है। हालांकि, एमपीएनएसटी और इन अन्य विकृतियों में अलग-अलग भेदभाव असामान्य नहीं है, अन्वेषक धुंधला प्रोफाइल का सामना कर सकता है जो हम यहां वर्णित से कुछ अलग हैं। इन बारीकियों के कारण हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि ट्यूमरजेनेसिस के एक नए जीईएम मॉडल की विशेषता वाली टीम में एक अनुभवी मानव या पशु रोग विशेषज्ञ शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में, हमने WHO ग्रेडिंग को GEM और मानव MPNST पर लागू किया है। हम इस ग्रेडिंग प्रणाली को पसंद करते हैं क्योंकि ग्रेडिंग मानदंड अपेक्षाकृत अच्छी तरह से परिभाषित हैं और मानव और माउस एमपीएनएसटी 2,28 के बीच तुलना करना आसान है। हालांकि, हम ध्यान देंगे कि डब्ल्यूएचओ ग्रेडिंग मानदंड पैथोलॉजिस्ट द्वारा समान रूप से स्वीकार नहीं किए जाते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि यह स्पष्ट नहीं है कि एमपीएनएसटी पर लागू होने वाले तीन डब्ल्यूएचओ ग्रेड रोगियों में नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी कर रहे हैं। उसके कारण, कई रोगविज्ञानी एमपीएनएसटी को केवल निम्न-श्रेणी या उच्च-श्रेणी की विकृतियों के रूप में वर्गीकृत करना पसंद करते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, लगभग 85% एमपीएनएसटी को उच्च श्रेणी की दुर्दमताओं के रूप में माना जाता है जो तेज माइटोटिक गतिविधि, चिह्नित सेलुलर एटिपिया और हाइपरक्रोमेशिया की विशेषता है जो ट्यूमर नेक्रोसिस के साथ हो सकते हैं। निम्न-श्रेणी के एमपीएनएसटी कम सेलुलैरिटी, हाइपरक्रोमेशिया और माइटोटिक गतिविधि दिखाते हैं।

हमने पाया है कि प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी कोशिकाओं को आवंटित करना इन संस्कृतियों की ट्यूमरजेनिसिटी की पुष्टि करने का एक सीधा साधन है। हालांकि, कुछ मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए जब कोशिकाओं एक एलोग्राफ्ट32 स्थापित नहीं करते. हमारे अनुभव में, जबकि प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी कोशिकाओं का भारी बहुमत एक एलोग्राफ्ट स्थापित करेगा, हमने कभी-कभी प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों का सामना किया है जो नहीं करते हैं। इस विफलता के बावजूद, सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (एसीजीएच) और पूरे एक्सोम अनुक्रमण ने प्रदर्शित किया कि इन प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों में ट्यूमर कोशिकाओं 25,26होने के अनुरूप कई जीनोमिक असामान्यताएं थीं। हमने प्रारंभिक-मार्ग संस्कृतियों को भी पाया है जो स्वस्थ नहीं हैं, आमतौर पर क्योंकि संस्कृतियों को ग्राफ्टिंग के लिए कटाई से पहले संगम बनने की अनुमति दी गई थी। किसी न किसी हैंडलिंग से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं (जैसे, गैर-एंजाइमी सेल पृथक्करण समाधान के साथ अत्यधिक लंबे समय तक ऊष्मायन ऊपर और नीचे कई बार) ग्राफ्ट किए जाने पर भी खराब प्रदर्शन करते हैं। हम यह भी नोट करेंगे कि हमने भ्रष्टाचार की स्थापना के लिए जो समय इंगित किया है, वह हमारे अनुभव के आधार पर एक अनुमान है। इस अवसर पर, हमने प्रारंभिक-मार्ग संस्कृतियों का सामना किया है जो सफलतापूर्वक एलोग्राफ्ट स्थापित करेंगे लेकिन ऐसा करने में अधिक समय लगेगा।

ऊपर उल्लिखित दृष्टिकोण परिधीय तंत्रिका तंत्र नियोप्लासिया के एक नव विकसित जीईएम मॉडल के प्रमुख पहलुओं को चिह्नित करने और इन जानवरों को विकसित करने वाले किसी भी न्यूरोफिब्रोमस और एमपीएनएसटी का ठीक से निदान करने का एक व्यापक साधन प्रदान करते हैं। प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी संस्कृतियों की स्थापना और एलोग्राफ्टिंग के लिए इन संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए हम जिन तरीकों की रूपरेखा तैयार करते हैं, वे जीईएम मॉडल में पहचाने गए नियोप्लाज्म की ट्यूमरजेनिसिटी के लिए स्पष्ट प्रमाण भी प्रदान करते हैं। हम इस बात पर जोर देंगे कि प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों की स्थापना करते समय हम व्यक्तिगत क्लोन का चयन नहीं कर रहे हैं। यद्यपि हम मानते हैं कि संस्कृतियों में ट्यूमर कोशिकाओं को रखते समय कुछ चयन अपरिहार्य है, इन प्रारंभिक निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रारंभिक मार्ग जीईएम एमपीएनएसटी संस्कृतियों में पहचाने गए उत्परिवर्तन माता-पिता ट्यूमर में मौजूद लोगों की तरह अत्यधिक रहते हैं। हालांकि, एसीजीएच का उपयोग करते हुए, हमने यह भी पाया है कि अधिक विस्तारित मार्ग के लिए इन प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों को जारी रखने के परिणामस्वरूप जीनोमिक परिवर्तन होते हैं जो इन ट्यूमर कोशिकाओं के पहले के मार्ग में जो देखा जाता है उससे अलग होने लगते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक (R01 NS048353 और R01 NS109655 से एसएलसी को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; R01 NS109655-03S1 से D.P.J.), राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01 CA122804 से SLC) और रक्षा विभाग (X81XWH-09-1-0086 और W81XWH-12-1-0164 से SLC)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Corning Falcon 353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) Vector Laboratories SK-400
6- well plates Corning Costar 3516
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) Invitrogen A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-500
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Caldesmon ABCAM  E89, ab32330
CD117 Cell Marque 117R-18-ASR
CD163 Leica NCL-L-CD163
CD31 ABCAM  ab29364
CD34 ABCAM  ab81289
CD86 ABCAM  ab53004
Cell Scraper Sarstedt 83.183
Cell Stripper Corning 25-056-CI
Circle Coverslip Fisher Scientific 12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) Decon Laboratories 5989-27-5
Critic Acid Fisher Scientific A104-500
Cytokeratin ABCAM  C-11, ab7753
Desmin Agilent Dako  clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution Vector Laboratories SK-4100
DMEM Corning 15-013-CV
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Fetal Calf Serum Omega Scientific FB-01
Forksolin Sigma-Aldrich F6886
Glycerol Sigma-Aldrich G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Hemacytometer Brightline-Hauser Scientific 1490
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific 327-500
Iba1 Wako Chemicals 019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse Vector Laboratories MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit Vector Laboratories MP-7401
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Isopropanol Fisher Scientific A415
Ki-67 Cell Signaling  12202
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015
Liquid Nitrogen
MART1 ABCAM  M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin Millipore  Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta In house Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin Santa Cruz Biotechnology  sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice Jackson Laboratory 5557
Nonfat Dry Milk Walmart Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice In house
Paraffin Wax Leica Paraplast 39601006
Parafilm M Sigma-Aldrich PM-999
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium) Fisher Scientific SP15-100
pH Meter Mettler Toldedo Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) Corning 20-031-CV
PMEL ABCAM  EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) Millipore Sigma 10981100ML
Rice Cooker Beech Hamilton
S100B Agilent Dako  Z0311  (now GA504)
SMA Ventana Medical Systems  clone 1A4
Sodium Chloride Fisher Scientific S640
Sodium Citrate (Dihydrate) Fisher Scientific BP327-1
Sox10 ABCAM  ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
TCF4/TCFL2  Cell Signaling  (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue ACROS Organics 348600050
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
TRIzol Invitrogen 15596026
Trypsin Corning 25-051-31

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References

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Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B., Fromm Longo, J., Carroll, S. L. Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models. J. Vis. Exp. (207), e65740, doi:10.3791/65740 (2024).

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