Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Identificere, diagnosticere og klassificere maligne perifere nerveskedetumorer i genetisk manipulerede musemodeller

Published: May 17, 2024 doi: 10.3791/65740
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

Summary

Vi har udviklet en metode til at vurdere, om nervesystemets neoplasmer i gensplejsede mus præcist rekapitulerer patologien hos deres menneskelige modstykker. Her anvender vi disse histologiske teknikker, definerede patologiske kriterier og kulturmetoder til neurofibromer og ondartede perifere nerveskedetumorer, der opstår i P 0-GGFβ3-musemodellen.

Abstract

Patienter med autosomal dominant tumor susceptibility syndrom neurofibromatosis type 1 (NF1) almindeligvis udvikle plexiform neurofibromer (PNs), der efterfølgende omdannes til meget aggressive maligne perifere nerveskede tumorer (MPNSTs). Forståelse af den proces, hvormed en PN omdannes til en MPNST, ville blive lettet af tilgængeligheden af genetisk manipulerede mus (GEM) modeller, der nøjagtigt replikerer PN-MPNST-progressionen, der ses hos mennesker med NF1. Desværre rekapitulerer GEM-modeller med Nf1-ablation ikke denne proces fuldt ud. Dette førte os til at udvikle P 0-GGFβ3-mus, en GEM-model, hvor overekspression af Schwann-cellens mitogenneuregulin-1 (NRG1) i Schwann-celler resulterer i udvikling af PN'er, der udvikler sig til at blive MPNST'er med høj frekvens. For at afgøre, om tumorigenese og neoplastisk progression i P 0-GGFβ3-mus nøjagtigt modellerer de processer, der ses hos NF1-patienter, måtte vi først bevise, at patologien for P0-GGFβ3 perifere nervekappetumorer rekapitulerer patologien hos deres menneskelige kolleger.

Her beskriver vi de specialiserede metoder, der anvendes til nøjagtigt at diagnosticere og klassificere neoplasmer i perifert nervesystem i GEM-modeller ved hjælp af P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus som eksempel. Vi beskriver de histologiske, immunohistokemiske og histokemiske metoder, der anvendes til at diagnosticere PN'er og MPNST'er, hvordan man skelner disse neoplasmer fra andre tumortyper, der efterligner deres patologi, og hvordan man klassificerer disse neoplasmer. Vi diskuterer etablering af tidlige passagekulturer fra GEM MPNST'er, hvordan man karakteriserer disse kulturer ved hjælp af immuncytokemi, og hvordan man verificerer deres tumorigenicitet ved at etablere allotransplantater. Samlet set karakteriserer disse teknikker patologien af PN'er og MPNST'er, der opstår i GEM-modeller og sammenligner kritisk patologien af disse murintumorer med deres menneskelige modstykker.

Introduction

I løbet af de sidste tre årtier har adskillige laboratorier forsøgt at skabe musemodeller af humane kræftformer ved at indføre humane kræftassocierede mutationer i musegenomet eller ved at overudtrykke et genprodukt, der er overudtrykt i humane kræftformer. De resulterende genetisk manipulerede mus (GEM) modeller kan anvendes til en række formål, såsom at fastslå, at den nyligt introducerede genomiske modifikation initierer tumorgenese, identificere andre efterfølgende forekommende genetiske eller epigenetiske ændringer, der bidrager til tumorprogression, og definere de vigtigste signalveje, der driver tumorinitiering og progression. I modsætning til ortopiske xenograftmodeller, der er afhængige af brugen af immundefekte mus, har GEM-kræftmodeller et fuldt funktionelt immunsystem og så mere præcist modelresponser på kandidatterapeutiske midler. Men når man bruger GEM-kræftmodeller til formål som disse, er det vigtigt, at efterforskere bekræfter, at observationer foretaget med GEM-neoplasmer er relevante for deres menneskelige modstykker. Denne validering bør omfatte en grundig vurdering af GEM-neoplasmernes patologi og en bestemmelse af, om de patologiske træk ved GEM-neoplasmerne rekapitulerer patologien af den tilsvarende humane tumortype.

Tumorfølsomhedssyndromet neurofibromatosis type 1 (NF1) er den mest almindelige genetiske sygdom, der påvirker det menneskelige nervesystem, der forekommer hos ca. 1 ud af hver 3.000-3.500 levendefødte 1,2,3. Personer ramt af NF1 udvikle flere godartede perifere nerveskede tumorer kendt som neurofibromer i deres hud (dermale neurofibromer) og i store nerver og nerveplexuser (plexiform neurofibromer). Mens både dermale og plexiforme neurofibromer forværrer patientens livskvalitet ved at producere fysisk, adfærdsmæssig og / eller social svækkelse, er plexiforme neurofibromer (PN'er) særligt farlige 4,5. Dette skyldes, at PN'er ofte omdannes til ondartede perifere nerveskedetumorer (MPNST'er), som er aggressive spindelcelleneoplasmer med en usædvanlig lav overlevelsesrate 1,2. I vid udstrækning skyldes denne lave overlevelsesrate, at de radio- og kemoterapeutiske regimer, der i øjeblikket anvendes til behandling af MPNST'er, er ineffektive. Det har dog været udfordrende at udvikle nye, mere effektive terapier. Dette skyldes, at på trods af hvor ofte MPNST'er forekommer hos NF1-patienter, er de stadig sjældne neoplasmer. Som følge heraf er det meget vanskeligt at opnå et stort antal humane tumorer til undersøgelse; Det er også en udfordring at rekruttere nok patienter med MPNST'er til kliniske forsøg. For at overvinde disse begrænsninger er der genereret flere GEM-modeller med det formål at få yderligere indsigt i abnormiteterne, der driver neurofibromapatogenese og PN-MPNST-progression og for at lette prækliniske forsøg med terapeutiske kandidatmidler.

NF1-patienter har inaktiverende mutationer i en kopi af NF1-genet. Neurofibroma patogenese udløses, når en inaktiverende mutation i det resterende funktionelle NF1-gen forekommer i en celle i Schwann-celleafstamningen. Overraskende nok, da mus blev genereret med kimlinjeinaktiverende Nf1-mutationer, udviklede de imidlertid ikke neurofibromer 6,7. Den efterfølgende demonstration af, at mus med Nf1-null Schwann-celler og Nf1-haploinsufficiens i alle andre celletyper (Krox20-Cre;Nf1floks / - mus) udviklede plexiform neurofibromer foreslog, at reduceret Nf1 gendosering i yderligere celletyper var nødvendig for neurofibroma patogenese8. Selv da plexiform neurofibromer i Krox20-Cre; Nf1floks / - mus udviklede sig ikke til at blive MPNST'er og efterlignede derfor kun delvist biologien hos deres menneskelige kolleger. MPNST-patogenese forekom, når Nf1-mutationer blev parret med mutationer i yderligere tumorsuppressorgener såsom Trp539 eller Cdkn2a10, men MPNST'er i disse GEM-modeller udviklede de novo eller fra atypiske neurofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potentiale (ANNUBP'er)11,12 snarere end fra allerede eksisterende godartede plexiforme neurofibromer (se13,14 for fremragende anmeldelser af disse modeller samt andre modeller, der introducerer yderligere MPNST-associeret tab af funktionsmutationer i gener som Suz12 og Pten15).

Disse musemodeller har været uvurderlige for at fastslå den rolle, som gener som NF1, TP53 og CDKN2A spiller i patogenesen af NF1-associerede neoplasmer i det perifere nervesystem og til prækliniske forsøg, der tester kandidatterapeutiske midler. Vi har dog stadig en ufuldstændig forståelse af den proces, hvormed plexiforme neurofibromer udvikler sig til at blive atypiske neurofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potentiale (ANNUBPs16) og derefter MPNST'er. Der er for nylig gjort visse fremskridt med at forstå denne proces med den nylige rapport om, at mus med sletninger i Nf1 og ARF udvikler ANNUBP'er, der udvikler sig til at blive MPNST'er11. Imidlertid eksisterer Nf1-mutationsbaserede musemodeller, der fuldt ud rekapitulerer processen med plexiform neurofibroma-MPNST-progression, der ses hos mennesker, endnu ikke. Derudover er det ikke klart, om der er flere forskellige veje, der fører til udvikling af MPNST'er. I betragtning af dette er det muligt, at de ovenfor beskrevne GEM'er kun modellerer en delmængde af flere forskellige veje, der fører til neurofibroma-MPNST-progression og MPNST-patogenese. Dette punkt understreges af, at MPNST'er også forekommer sporadisk, og at nogle sporadiske MPNST'er tilsyneladende ikke har NF1-mutationer 17,18.

Selvom sidstnævnte punkt er blevet udfordret af Magollon-Lorenz et al.'s nylige forslag om, at i det mindste nogle sporadiske MPNST'er, der mangler NF1-mutationer , er melanomer eller en anden type sarkom19, har vi for nylig rapporteret en sporadisk MPNST og en cellelinje afledt af denne tumor (2XSB-celler), der var NF1 vildtype20. Under karakteriseringen af modertumoren og 2XSB-cellelinjen udelukkede vi systematisk alternative diagnostiske muligheder, herunder melanom og de mange andre sarkomtyper, der rutinemæssigt overvejes i differentialdiagnosen af en sporadisk malign perifer nervekappetumor20. Derudover bemærker vi, at Magollon-Lorenz et al. erkendte, at deres fund i de tre sporadiske MPNST-cellelinjer, som de studerede, ikke kunne generaliseres for at indikere, at alle tumorer identificeret som sporadiske MPNST'er ikke er MPNST'er.

For at konstruere en GEM-model, hvor neurofibroma og MPNST-patogenese ikke nødvendigvis var afhængige af specifikke tumorsuppressorgenmutationer, genererede vi transgene mus, hvor overekspression af den potente Schwann-cellemitogenneuregulin-1 (NRG1) blev drevet af Schwann-cellespecifik myelinproteinnul (P0) promotor (P 0-GGFβ3-mus)21. Vi har tidligere vist, at humane neurofibromer, MPNST'er og MPNST-cellelinjer udtrykker flere NRG1-isoformer sammen med erbB-receptortyrosinkinaserne (erbB2, erbB3 og erbB4), der medierer NRG1-signalering, og at disse erbB-receptorer er konstitutivt aktiveret22. Vi har også vist, at farmakologiske hæmmere af erbB-kinaserne kraftigt hæmmer MPNST-proliferation22, overlevelse23 og migration24. I overensstemmelse med vores observationer hos mennesker udvikler P 0-GGFβ3-mus plexiforme neurofibromer25, der udvikler sig til at blive MPNST'er med en høj frekvens21,25. Vi har vist, at P 0-GGFβ3 MPNST'er, ligesom deres menneskelige kolleger, almindeligvis udvikler mutationer af Trp53 og Cdkn2a samt adskillige andre genomiske abnormiteter, der potentielt bidrager til tumorigenese25. MPNST'er, der opstår i P 0-GGFβ3-mus, har ikke inaktiverende Nf1-mutationer. Ved hjælp af genetisk komplementaritet viste vi imidlertid, at NRG1 fremmer tumorigenese hos P 0-GGFβ3-mus overvejende gennem de samme signalkaskader, der ændres af Nf1-tab 26; denne konklusion er baseret på vores konstatering af, at erstatning af NRG1-overekspression med Nf1-tab i nærvær af Trp53-haploinsufficiens (P 0-GGFβ3;Trp53+/- mus) producerer dyr, hvor MPNST'er udvikler de novo, som det ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus27.

For at opnå denne og andre oplysninger, der viser, at P 0-GGFβ3-mus nøjagtigt modellerer processerne for neurofibromapatogenese og neurofibroma-MPNST-progression set hos mennesker med NF1, har vi udviklet specialiserede metoder til behandling af væv fra disse dyr, nøjagtigt diagnosticeret deres tumorer, klassificering af MPNST'erne, der opstår i disse mus, etablering og karakterisering af tidlig passage P0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST-kulturer og kritisk sammenligning af patologien for P 0-GGFβ3 PN'er og MPNST'er og P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST'er til deres menneskelige modstykker. Mange af disse metoder kan generaliseres til andre GEM-modeller af nervesystemets neoplasi. Derudover er flere af disse metoder mere bredt anvendelige til GEM-modeller, hvor neoplasmer opstår i andre organsteder. Derfor præsenterer vi her en detaljeret beskrivelse af disse metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Medical University of South Carolina's IACUC og blev udført af korrekt uddannet personale i overensstemmelse med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs institutionelle retningslinjer for dyrepleje.

1. Bestemmelse af tumorpenetrans og overlevelse i P 0-GGFβ3 mus og identifikation af tumorer i disse dyr til yderligere karakterisering

  1. Generer kohorten af mus, der vil blive vurderet for tumorgenese. Antallet af mus, der kræves, afhænger af penetransen af tumorfænotypen. For at kompensere for tab som disse skal du starte med en kohorte, der er 10-15% højere end det ønskede endelige antal dyr.
    BEMÆRK: Vi bestemte tumorpenetrans hos P 0-GGFβ3-mus empirisk i en indledende kohorte på 50 mus (hvoraf seks gik tabt af årsager, der ikke var relateret til neoplasi (f.eks. Kamp))25.
  2. Vurder dyrenes sundhed tre gange ugentligt og registrer kropstilstandsscore, herunder vægt og adfærdsændringer ved hver undersøgelse. Afslut tumorbærende eller døende mus (se note nedenfor) ved hjælp af kuldioxid eutanasi efterfulgt af cervikal dislokation. Optag alder ved døden i dage. Hvis tumorer er eksternt synlige, registrere tumor dimensioner (længde, bredde, og højde).
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at dyr ikke får lov til at fortsætte forbi den IACUC-godkendte maksimalt tilladte tumorstørrelse og / eller humane endepunkt.
  3. Brug dødsalderen til at etablere en Kaplan-Meier-overlevelseskurve for at bestemme gennemsnitsalderen ved døden og overlevelsesområdet.
    BEMÆRK: P 0-GGFβ3 mus havde en gennemsnitsalder ved død på 261,5 dage, med et interval på 74-533 dage; 91% af vores kohorte havde flere neurofibromer og 71% havde MPNST'er21.
  4. Bestem, om groft synlige tumorer er til stede, og hvis de er, dissekere dem under sterile forhold for at fastslå, om tumoren er forbundet med en perifer nerve og derefter punktafgifter tumoren. I P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus, perifere nerveskede tumorer findes oftest i trigeminus- og iskiasnerverne. Selvom groft synlige tumorer ikke ses i forbindelse med disse nerver, skal du rette og indlejre disse nerver som beskrevet nedenfor, så de kan undersøges for tilstedeværelsen af mikrotumorer. Mikrotumorer forekommer typisk i ganglierne forbundet med disse nerver.
  5. Skær groft synlige tumorer i tre stykker (figur 1A). Brug stykke 1 til histologi (paraffinsektioner, immunhistokemi og histokemi). Brug stykke 2 til at etablere tidlige overgangskulturer. Snap-freeze stykke 3 (ved hjælp af flydende nitrogen) til mulige fremtidige eksperimenter (f.eks. Immunoblots, RNA og DNA-isolering).
  6. Stykke 1 fikseres i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvand (PBS) natten over ved 4 oC. Resten af dyrets krop fastgøres ved nedsænkning i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 °C.

2. Paraffinindlejring af groft synlige tumorer og fremstilling af hæmatoxylin og eosinfarvede sektioner til indledende diagnostisk vurdering

  1. Paraffinindlejring af groft synlige tumorer
    1. Efter fastgørelse af tumorstykke 1 natten over i 4% paraformaldehyd, skylles vævet ved at placere det i et volumen PBS, der er mindst 10x større end vævets volumen i 15 minutter; Brug det samme volumen til alle efterfølgende skylninger. Gentag yderligere to 15 minutters PBS-skylninger med en frisk mængde PBS for hver skylning.
    2. Overfør tumorstykke 1 til 70% ethanol. Hold vævet i 70% ethanol i 24 timer ved 4 °C. Opbevar om ønsket vævet på lang sigt under disse forhold.
      BEMÆRK: Trin 2.1.1 til 2.1.7 er tilvejebragt til gavn for investigatorer, der ikke har adgang til en kommerciel vævsbehandlingsmaskine. Hvis investigator har adgang til en vævsprocessor, vil vævet blive behandlet gennem klassificerede ethanoler og xylener i henhold til den programmerede instrumentprotokol.
    3. Overfør tumorstykke 1 til 80% ethanol i 30 minutter ved stuetemperatur. Inkubationen gentages i yderligere 30 minutter i et frisk volumen på 80% ethanol.
    4. Overfør tumorstykke 1 til 95% ethanol i 75 minutter ved stuetemperatur. Inkubationen gentages to gange mere, hver gang i yderligere 75 minutter i et frisk volumen på 95% ethanol.
    5. Overfør tumorstykke 1 til 100% ethanol og inkuber i 60 minutter ved stuetemperatur. 60 minutters inkubation gentages to gange mere, hver gang med et nyt volumen 100% ethanol.
    6. Overfør tumorstykke 1 til et d-limonenbaseret opløsningsmiddel og inkuber i 30-60 minutter ved stuetemperatur. Overfør tumorstykke 1 til et frisk volumen af det d-limonenbaserede opløsningsmiddel og inkuber i yderligere 30-60 minutter ved stuetemperatur.
    7. Overfør tumorstykke 1 til 1: 1 paraffin/d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 1 time ved 60 oC. Kassér 1: 1 paraffin/d-limonen-baseret opløsningsmiddel og overfør tumorstykke 1 til 60 oC paraffin og inkuber i 20 minutter ved 60 oC. Inkubationen gentages i et frisk volumen på 60 oC paraffin igen i 20 minutter. Inkubere tumor stykke 1 i paraffin natten over ved 60 oC.
    8. Hæld et basislag af paraffin i en stålhistologiform og lad det størkne. Overfør tumorstykke 1 til overfladen af baseparaffinen, og umiddelbart efter positionering dækkes vævet med 60 oC paraffin og placeres vævskassetten oven på og i kontakt med den smeltede paraffin. Overfør formen til den kolde side af indlejringsstationen og lad den størkne i 10-15 min.
    9. Fjern paraffinblokken med den vedhæftede vævskassett fra formen. Brug den vedhæftede vævskassette til at klemme blokken ind i mikrotomet under sektionering.
      BEMÆRK: Paraffinblokken kan nu opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur.
  2. Forbered hæmatoxylin og eosinfarvede sektioner af groft synlige tumorer.
    1. Skær 4-5 μm sektioner af tumorvæv ved hjælp af et mikrotomt og monter dem på positivt ladede glasglas.
    2. For at udføre hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning afparaffiniserer vævssektionerne ved at inkubere diasene i et d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 10 minutter ved stuetemperatur. Inkubationen gentages i et nyt volumen d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 10 minutter.
    3. Overfør diasene til 100% ethanol og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør diasene til et frisk volumen 100% ethanol og inkuber i yderligere 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Overfør diasene til 95% ethanol og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør diasene til et frisk volumen på 95% ethanol og inkuber i yderligere 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Overfør diasene til 70% ethanol og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør derefter til 50% ethanol og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
    6. Overfør diasene til destilleret vand og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
    7. Plet diasene ved at nedsænke dem i hæmatoxylin i 5 minutter ved stuetemperatur. Skyl med rindende postevand i 1-2 min. Differentier ved at dyppe dias 2-5x i 0,5% saltsyre i 70% ethanol. Skyl i et rindende vandbad fra hanen i 1-2 min. Placer diasene i 95% ethanol med 0,5% eddikesyre i 10 s.
    8. Plet diasene med eosin-Y i 30 s ved stuetemperatur, og overfør derefter diasene til 100% ethanol i 5 min. Prøverne klares i et d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 5 min.
    9. Monter dæksler ved hjælp af et xylenbaseret monteringsmedium, mens glideren stadig er våd med det d-limonenbaserede opløsningsmiddel. Lad monteringsmediet sætte sig natten over.
      BEMÆRK: Brug ikke et vandbaseret monteringsmedium.
  3. Forbered væv uden groft synlige tumorer for at identificere plexiforme neurofibromer og mikro-MPNST'er. Integrer vævene i paraffin, forbered histologiske sektioner og pletter disse sektioner med hæmatoxylin og eosin.
    1. Fjern de indre organer og indlejr repræsentative dele af hvert organ i paraffin for at forberede H & E-farvede sektioner, der vil blive undersøgt for mikroskopiske tegn på tumorer (figur 1B). Fjern hoved, forben, bagben og hale (figur 1C). For at undersøge rygmarven og nerverødderne in situ for tegn på nerverodstumorer, afkalkes rygsøjlen og tilhørende ribben og blødt væv ved nedsænkning i 0,3 M EDTA / 4% paraformaldehye (pH 8,0) i 48-72 timer ved 4 oC; Skyl derefter prøverne med 1x PBS. Ved afslutningen af afkalkningen skal du sikre dig, at afkalkningen er afsluttet ved at forsøge at gennembore rygsøjlen med en nål. Afkalkning er vellykket, hvis nålen let trænger ind i knoglen uden at knuse.
    2. Skær den afkalkede rygsøjle og tilhørende strukturer i blokke, der passer ind i en vævskassette. Dehydrering gennem klassificerede ethanoler efterfulgt af et opløsningsmiddel baseret på d-limonen som beskrevet i trin 2.1.2-2.1.7. Der indlejres paraffin, og der klargøres 4-5 μm sektioner som beskrevet i trin 2.1.7-2.2.1. Udfør H&E pletter som beskrevet i trin 2.2.2-2.2.9; Lad monteringsmediet sætte sig natten over.

3. Identificer potentielle plexiforme neurofibromer og udfør specielle pletter for at bekræfte diagnoser

BEMÆRK: Vi anbefaler kraftigt at inkludere en erfaren human eller veterinær patolog i evalueringen af H &E og specielle pletter af GEM-tumorsektioner.

  1. Undersøg de H&E-farvede dias, der er fremstillet som beskrevet ovenfor ved hjælp af brightfieldmikroskopi for at identificere potentielle perifere nerveskedetumorer. Da neurofibromer og MPNST'er opstår inden for perifere nerver, er det vigtigt at afgøre, om mikroskopiske tumorer er forbundet med en perifer nerve. Identificer blokke med potentielle perifere nervekappetumorer, så immunopletter og andre specielle pletter kan udføres for at bekræfte eller afvise diagnoser.
  2. Skelne potentielle PN'er fra MPNST'er / andre højkvalitets neoplasmer baseret på histologiske træk set under brightfield-undersøgelse af H&E-farvede sektioner. Humane PN'er er mildt hypercellulære neoplasmer, der overvejende består af celler med aflange, ofte bølgede kerner. I mange områder er cellerne løst pakket og kan adskilles af myxoid ekstracellulært materiale; PN'er i P 0-GGFβ3-mus har et lignende udseende. Mitoser er typisk ikke til stede; hvis de er, og tumoren er moderat til stærkt hypercellulær, er tumoren en MPNST eller en anden type højkvalitets neoplasma (se nedenfor).
  3. PN'er består af en blanding af neoplastiske Schwann-celler og andre ikke-neoplastiske celletyper såsom mastceller. For at bekræfte identiteten af en PN skal du udføre immunpletter for Schwann-cellemarkørerne S100β og Sox10 og mastcellemarkøren CD117 (c-Kit) på sektioner fra blokke, der indeholder potentielle PN'er, der er identificeret ved H&E-undersøgelse (se afsnit 3.4 for alternative mastcellemarkørfarvningsmuligheder). Udfør Ki67-immunpletter for at bekræfte lave spredningshastigheder.
    BEMÆRK: Tabel 1 viser de antigenmarkører, der anvendes til rutinemæssig identifikation af GEM plexiforme neurofibromer (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnosen MPNST'er og til en fuldstændig vurdering af andre celletyper, der er til stede i neurofibromer; vi pletter kun for disse sidstnævnte antigener, når vi først beskriver en ny GEM-model. Se antistofproducentens datablad for anbefalede forhold. Bemærk, om antistofproducentens indsats anbefaler antigenudtagning; Ikke alle antigener kræver hentning for at kunne påvises.
    1. Forbered 4-5 μm sektioner fra de valgte paraffinblokke og monter dem på positivt ladede dias. Afparaffiniser afsnit som beskrevet i trin 2.2.2-2.2.6.
    2. Skyl sektionerne med 1x PBS i 3-5 min.
    3. Hvis antistofproducenten anbefaler antigenhentning, skal du forberede citratbuffer. Kombiner 9 ml citronsyreopløsning (10,5 g citronsyre i 500 ml destilleret vand) og 41 ml natriumcitratopløsning (14,7 g natriumcitrat i 500 ml destilleret vand).
    4. Udfør antigenhentning ved at placere dias i citratbuffer i 20 minutter i en opvarmet riskoger.
    5. Overfør dias til 3% hydrogenperoxid/1x PBS i 10 minutter for at eliminere peroxidaseaktivitet i vævet.
      BEMÆRK: Gør denne opløsning frisk hver gang, og brug ikke stamopløsningen af hydrogenperoxid, hvis den er ældre end 3-4 måneder.
    6. Skyl sektioner i 1x PBS.
    7. Bloker sektioner ved hjælp af blokerende buffer (2% BSA, 0,1% Triton X-100 i 1x PBS) i 1 time. Skyl dias kort i 1x PBS.
    8. Tilsæt primært antistof til vævssektioner. Forbered primære antistoffer i fortyndet blokerende buffer. Der inkuberes dias i 2 timer ved 37 oC eller natten over ved 4 oC.
    9. Vask rutsjebaner i 1x PBS i 5 min. Gentag 3x.
    10. Inkuber væv med biotinyleret sekundært antistof i 1-2 timer.
    11. Forbered diaminobenzidin (DAB) opløsning baseret på producentens protokol og nedsænk dias i opløsningen i 2-10 min. Vask rutsjebaner i vand i 5 min.
    12. Modvirker pletsektioner ved at nedsænke dem i hæmatoxylin i 10-15 min. Udsæt for rindende vand, indtil det løber klart. Dyp hurtigt dias i alkohol og skyl dias i vand.
    13. Dehydrat dias i graduerede ethanoler ved hurtigt at dyppe dias, 4-5x pr. opløsning, i 70% ethanol, 95% ethanol og derefter 100% ethanol. Inkuber dias i et d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 2 min. Inkuber dias i en anden batch af d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 2 min.
    14. Monter dias med et xylenbaseret monteringsmedium.
    15. Undersøg dias ved hjælp af brightfield-mikroskopi.
    16. For immunfluorescens udelades trin 3.3.10-3.3.15. Inkuber i stedet væv med artsspecifikt sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer i 1-2 timer.
    17. Skyl dias i 1x PBS i 5 min. Gentag 3x.
    18. Monter glideglas ved hjælp af 1x PBS / glycerol.
    19. Undersøg dias ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
  4. Alternativ metode til farvning af mastceller: toluidinblå farvning
    1. Toluidin blå stamopløsning fremstilles ved at opløse 1 g toluidinblåt O i 100 ml 70% ethanol.
    2. Forbered 1% natriumchlorid (NaCl) opløsning ved at opløse 0,5 g NaCl i 50 ml destilleret vand. Bland for at opløse. Juster pH til ca. 2,0-2,5 ved hjælp af HCI.
      BEMÆRK: Denne NaCl-opløsning skal gøres frisk, hver gang der udføres pletter.
    3. Forbered toluidinblåt arbejdsopløsning ved at tilsætte 5 ml toluidinblå stamopløsning til 45 ml af 1% NaCl-opløsningen. Bland godt og sørg for, at pH-værdien er ca. 2,3.
      BEMÆRK: En pH-værdi højere end 2,5 vil resultere i farvning med mindre metakromasi. Gør denne opløsning frisk hver gang farvning udføres.
    4. Afparaffiniser 4-5 μm sektioner monteret på positivt ladede dias som beskrevet i trin 2.2.2-2.2.6. Vask afparaffiniserede sektioner i rindende vand i 2 min.
    5. Plettesektioner i toluidinblå arbejdsløsning i 2-3 min. Vask i destilleret vand i 2 min.
    6. Dehydrer sektioner ved at dyppe 10x i 95% ethanol. Dyp dias i 100% ethanol 10x. Dyp dias i frisk 100% ethanol 10 gange mere.
    7. Inkuber dias i et d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 2 min. Inkuber dias i en anden batch af d-limonenbaseret opløsningsmiddel i 2 min.
    8. Monter dæksler ved hjælp af et xylenbaseret monteringsmedium, mens glideren stadig er våd med et d-limonenbaseret opløsningsmiddel.
      BEMÆRK: Brug ikke et vandbaseret monteringsmedium.
    9. Undersøg dias ved hjælp af brightfield-mikroskopi. Identificer mastceller ved tilstedeværelsen af mørke lilla granulater i deres cytoplasma. Andre celletyper er farvet lyseblå.

4. Særlige pletter til diagnosticering af MPNST'er og udelukkelse af alternative diagnoser

  1. Det histologiske udseende af humane MPNST'er er meget variabelt, og flere forskellige tumortyper har et udseende, der ligner MPNSTs28. Da MPNST'er er afledt af Schwann-celleafstamningen, skal du bestemme, om tumoren stammer fra en perifer nerve eller inden for en eksisterende godartet PN ved grov undersøgelse eller brightfield mikroskopisk undersøgelse af H & E-farvede sektioner. Selvom MPNST'er lejlighedsvis ikke findes i forbindelse med en perifer nerve eller PN (normalt på grund af utilsigtet adskillelse fra nerven under dissektion, ødelæggelse af den allerede eksisterende PN via MPNST-overvækst, eller fordi læsionen er metastatisk), skal du kigge efter tumorens tilknytning til en nerve eller PN, da diagnosen er mindre sandsynlig, hvis tumoren ikke er forbundet med en nerve eller PN.
  2. Forbered 4-5 μm sektioner fra paraffinblokke, der indeholder potentielle MPNST'er, og monter dem på positivt ladede dias som beskrevet i trin 2.2.1. Afparaffiniser afsnit som beskrevet i trin 2.2.2-2.2.6.
  3. Der udføres immunhistokemi med panelet af antistoffer angivet i tabel 2 som beskrevet i trin 3.3.1-3.3.15.
  4. Immunpletterne undersøges ved brightfieldmikroskopi. Da MPNST'er demonstrerer schwannisk differentiering, skal du kigge efter ensartet eller ujævn immunreaktivitet for S100β, nestin og Sox10. Hvis tumorerne ikke er positive for disse tre markører, henvises til tabel 2 for at etablere diagnosen.
    BEMÆRK: MPNST'er til mennesker og mus kan udvise divergerende differentiering. For eksempel viser nogle humane MPNST'er fokal rhabdomyoblastisk differentiering (disse varianter er kendt som maligne Triton-tumorer); selvom disse neoplasmer vil plette for Schwannian markørerne, udtrykker de også muskelmarkører som desmin, MyoD1 og myogenin. Immunoreaktivitet for disse sidstnævnte markører bør ikke afholde forskere fra at diagnosticere tumoren som en MPNST. Selvom flere musemodeller, der betinget udtrykker SS18-SSX-fusionsgenet, er blevet etableret for at modellere synovial sarkompatogenese29, er synoviale sarkommodeller, der spontant genererer det ækvivalente fusionstranskript, efter vores bedste overbevisning ikke kendt. Derfor leder vi ikke efter SS18-SSX-fusionstranskripter i GEM-tumorer og stoler i stedet på immunhistokemiske profiler.

5. Klassificering af MPNST'erne

  1. Bestem, om tumornekrose, et kendetegn ved WHO klasse IV MPNST'er, er til stede. For klasse IV MPNST'er skal du kigge efter fremtrædende hypercellularitet, livlig mitotisk aktivitet (≥4 mitoser pr. 10 felter med høj effekt (40x)) og cytologisk atypi.
    1. Hvis nekrose ikke er til stede, vurdere tumoren for at afgøre, om hypercellularitet, rask mitotisk aktivitet, og cytologisk atypi er til stede. Hvis disse funktioner alle er til stede i fravær af nekrose, klassificere tumoren som en WHO klasse III MPNST.
    2. WHO klasse II tumorer er karakteriseret ved cellularitet, der øges, men i mindre grad end WHO klasse III og IV MPNST'er. Kernerne i tumorceller i en WHO klasse II MPNST viser øget størrelse (mere end 3x størrelsen af tumorcellekernerne i neurofibromer) og hyperkromasi. Øget mitotisk aktivitet (<4 mitoser pr. 10 højeffektfelter) er forbundet med, men ikke et krav til, WHO klasse II tumorer.
      BEMÆRK: Da tumorer af højere kvalitet typisk udvikler sig fra lavere kvaliteter, kan regioner af lav kvalitet og høj kvalitet være til stede i samme MPNST. Under denne omstændighed bestemmes tumorens karakter af den højeste klasse region til stede.
      BEMÆRK: Der er kontrovers blandt menneskelige patologer om, hvorvidt WHO-klassificeringssystemet beskrevet ovenfor er prædiktivt for patientresultater, og nogle af disse patologer foretrækker i stedet blot at klassificere MPNST'er som lav kvalitet eller høj kvalitet. Under denne ordning har højkvalitets MPNST'er fremtrædende cytologisk atypi, livlig mitotisk aktivitet (>5 mitoser pr. 10 højeffektfelter) og markant hypercellularitet med eller uden nekrose. Lavkvalitets MPNST'er mangler nekrose, men viser mitotisk aktivitet, cytologisk atypi og cellularitet, der er mellemliggende mellem en højkvalitets MPNST og en atypisk neurofibromatøs neoplasma med ukendt biologisk potentiale (ANNUBP). Vi foretrækker det ovenfor beskrevne system, fordi det kan være udfordrende for efterforskere at skelne mellem en ANNUBP og en MPNST af lav kvalitet.

6. Forberedelse af kulturer med tidlig passage P 0-GGFβ3 MPNST-celler

  1. Kultur tidlig passage P 0-GGFβ3 tumorceller fra frisk tumor stykke 2 (trin 1.5, figur 1A). Oprethold sterile forhold fra dette tidspunkt fremad.
    1. Dissocier tumoren ved at skære den i små (2-4 mm) stykker og hakke i DMEM10 (Dulbeccos minimale essentielle medium) indeholdende 10% føtalt kalveserum, 2 μmol / L forskolin og 10 nmol / L neuregulin 1β (NRG1β) i 100 mm vævskulturskåle.
    2. Lad celler vokse ud fra de hakkede vævsfragmenter ved 37 oC i 5% CO2 , indtil pladerne er sammenflydende. Skift medie hver 3-4 dage.
    3. Opdel cellekulturen. Fjern mediet fra 100 mm skålen og vask cellerne med PBS; Fjern og kassér hakket væv. Fjern PBS og tilsæt 1 ml 0,25% trypsin i 2-5 minutter ved stuetemperatur. For at fremme cellefrigørelse skal du forsigtigt trykke på pladen og kontrollere for løsrivelse ved hjælp af et lysmikroskop; forlænge trypsinkubation efter behov.
    4. Neutraliser trypsin ved at tilføje 2 ml DMEM10. Cellesuspensionen overføres til et centrifugerør og pilleceller ved 500 × g i 5 min. Fjern mediet og tilsæt 5 ml frisk DMEM10 til pelleten.
    5. Cellesuspensionen fordeles i to til fire 100 mm skåle indeholdende DMEM10. Opdel ikke cellerne i mere end fem passager (trin 6.1.3 og 6.1.4) og vedligehold dem i DMEM uden forskolin og NRG1β. Husk at fryse celler ned ved passage 2 til fremtidig brug.

7. Verifikation af identiteten af MPNST-celler med tidlig passage ved immuncytokemi

  1. Anbring sterile 18 mm #1,5 runde glasdæksler i brøndene i 6-brønds sterile vævskulturskåle.
    1. Poly-L-lysin/lamininopløsning anbringes i hullerne i et volumen, der er tilstrækkeligt til at dække dæksedlen. Forsegl pladen med plastfolie for at minimere fordampning. Der inkuberes ved 4 °C natten over. Næste morgen vaskes dækslerne 3x med steril PBS.
      BEMÆRK: Vi har forsøgt at plade MPNST-celler med tidlig passage på ubelagte dæksedler og har fundet ud af, at cellerne ikke klæber godt i fravær af poly-L-lysin / lamininbelægning.
    2. Plade 10.000 celler på dæksedlen ved forsigtigt at tilsætte 2 ml af cellesuspensionen i vækstmedier i hvert hul, der indeholder dæksedlen. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C med 5% CO2 i en vævskulturkuvøse.
    3. Næste morgen skylles dæksedlerne i 2 x 5 minutter med PBS.
    4. Fastgør celler med 4% paraformaldehyd i PBS i 18 minutter ved stuetemperatur.
    5. Skyl dæksedlerne 3 x 5 min med PBS. Hvis det ønskes, forsegles pladen med plastfolie og opbevares ved 4 °C på dette tidspunkt.
    6. Lav frisk 50 mM NH4Cl i PBS. Aldehyder slukkes ved at inkubere dæksedler i 50 mM NH4Cl i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
    7. Permeabiliser cellerne ved at inkubere dæksedler i 0,3% Triton X-100 i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask dæksler i 3 x 5 min med PBS.
    8. Bloker ikke-specifik binding ved at inkubere dæksedler i blokerende buffer (1x PBS indeholdende 1% bovin serumalbumin, 0,2% fedtfri tør mælk og 0,3% Triton X-100) i 1 time ved stuetemperatur.
    9. Fjern blokeringsbufferen og tilsæt primære antistoffer, der genkender MPNST-markørerne, der er til stede i modertumoren (typisk S100β, Nestin og Sox10) fortyndet til den forudbestemte optimale fortynding i blokeringsbufferen. Pladen pakkes ind med plastfolie og inkuberes ved 4 °C natten over i et befugtet kammer.
    10. Vask 3 x 5 min med PBS for at fjerne ubundet primært antistof. Tilsæt fluorescerende mærket sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Beskyt mod lys.
    11. Vask 3 x 5 min med PBS. Der inkuberes dæksedler i 1-5 μg Hoechst-farvestof i 10 min. Fortsæt med at beskytte mod lys.
    12. Vask dæksler med PBS i 5 min. Monter glideglas ved hjælp af 1:1 1x PBS/glycerol. Billede med et fluorescerende mikroskop.

8. Allograft af tumorceller i tidlig passage for at demonstrere tumorigenicitet

  1. Dyrk tidlig passage P 0-GGFβ3 MPNST-celler i DMEM10 til 80% sammenløb. Skyl cellerne en gang med stuetemperatur Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS). Behandl celler i 30 s til 1 min med en ikke-enzymatisk celledissociationsopløsning for at fjerne dem fra substratet. Der tilsættes 5 ml DMEM10 pr. 1 ml af et ikke-enzymatisk celledissociationsreagens.
    BEMÆRK: Cellulær dissociation kan tage meget længere tid, op til 10-20 min. Se producentens protokol.
    BEMÆRK: Dyrk ikke celler til sammenløb, da dette reducerer transplantateffektiviteten.
    1. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer. Spin celler ned ved 5 × g i 5 minutter og resuspender dem i en koncentration på 1-2 × 106 celler pr. 100 μL DMEM10. Opbevar cellerne på is, indtil de er klar til injektion.
    2. Bedøv NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) mus i induktionskammeret i en isofluranfordamper. Placer dyret på maven og steriliser injektionsstedet med 70% ethanol. Lad stedet lufttørre før injektion. Før injektion skal cellerne have stuetemperatur.
    3. Injicer 1-2 x 106 celler subkutant i højre flanke. Placer musen alene i et strøelsesfrit bur, og lad den komme sig. Sørg for, at kun en del af buret er på en varmepude for at forhindre hypotermi. Dette giver en zone, som musen kan bevæge sig til, hvis den bliver overophedet.
      BEMÆRK: Vi poder mindst tre mus med hver tidlig passagekultur, som nogle transplantater muligvis ikke tager.
    4. Lad transplantatet vokse i 15-60 dage; Vurder dyresundhed 3x ugentligt og registrer kropstilstandsscore, herunder vægt og adfærdsændringer ved hver undersøgelse. Afslut mus, der har nået maksimalt tilladt transplantatstørrelse eller døende mus ved hjælp af kuldioxid eutanasi efterfulgt af cervikal dislokation. Optag alder ved døden i dage. Som tumorer bliver eksternt synlige, registrere tumor dimensioner (længde, bredde, og højde).
      BEMÆRK: Det er vores erfaring, at forskellige MPNST-kulturer i tidlig passage podes med varierende effektivitet og varierer i den tid, der kræves til transplantatvækst. Dyr må ikke fortsætte forbi den IACUC-godkendte maksimalt tilladte tumorstørrelse og/eller humane endepunkt.
  2. Høst tumoren, fastgør den i 4% paraformaldehyd, indlejr den i paraffin, og udfør H&E-pletter som beskrevet i afsnit 2.1-2.2.9 for at kontrollere, at allotransplantatet er en tumor snarere end et reaktivt væv. Om nødvendigt immunoplet transplantatet for de markører, der var til stede i modertumoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerer eksempler på groft tydelige neoplasmer, der forekommer i P 0-GGFβ3-mus. Tumorer, der let kan identificeres med det blotte øje, kan ses som masser, der udspiler kropsområder som vist i figur 2A (pil). Ved bestemmelse af, om neoplasma potentielt er en perifer nervekappetumor, er det vigtigt at fastslå, at tumoren er forbundet med en perifer nerve. I dette tilfælde viser en MR-scanning (figur 2B), at tumoren er forbundet med iskiasnerven (pilespids); Denne forening blev bekræftet efter euthanisering af musen og dissekering af tumoren. Det skal bemærkes, at en stor størrelse ikke nødvendigvis indikerer, at tumoren er ondartet. I dette tilfælde viste en histologisk undersøgelse af tumoren (figur 2C), at det var et neurofibroma. Mest almindeligt er dog, groft tydelige tumorer ikke identificeret, før udfører obduktion af musen. Figur 2D illustrerer en stor, kødfuld MPNST, der opstod inden for dette dyrs brachiale plexus.

Figur 3 illustrerer repræsentative eksempler på MPNST'er og neurofibromer fra P 0-GGFβ3-mus fremstillet i henhold til procedurerne beskrevet i protokolafsnit 1. Figur 3A-J illustrerer ti eksempler på uafhængigt opståede MPNST'er fra vores P0-GGFβ3 musekoloni. Bemærk, at MPNST'ernes histologiske udseende kan variere meget, selv mellem MPNST'er, der opstår uafhængigt i det samme dyr. Denne histologiske variabilitet illustrerer, hvorfor vi rutinemæssigt bekræfter diagnosen P 0-GGFβ3 MPNST'er med immunohistokemiske pletter. Vi vil også påpege, at andre, tilsyneladende uafhængige tumortyper forekommer sporadisk med lav frekvens i nogle indavlede musestammer (f.eks. Vi har flere gange stødt på lymfomer i P 0-GGFβ3-mus, der bærer transgenet på en C57BL/6J-baggrund), hvilket yderligere understreger vigtigheden af at bruge immunhistokemi til at bekræfte tumordiagnoser. På trods af variabiliteten af deres histologiske udseende var alle ti tumorer illustreret i figur 3A-J immunoreaktive for S100β og nestin og negative for markører for andre tumortyper. Figur 3K illustrerer et repræsentativt billede af en korrekt afkalket rygsøjle og tilhørende væv. Bemærk, at rygmarven, nerverødderne, rygsøjlen og skeletmuskulaturen alle opretholder deres rette anatomiske forhold til hinanden. Figur 3L er et billede med højere effekt af rygsøjlen og den overliggende rygmarv. Da dette væv er korrekt afkalket, har knoglen skåret let uden makulering eller foldning, og knoglemarv er let identificerbar i marvsrummene. Hvis vævet ikke var blevet afkalket ordentligt, ville det have fanget på mikrotombladet og været revet ud af sektionen, hvilket gjorde betydelig skade på tilstødende væv (rygmarv, rygmarvsnerverødder og skeletmuskulatur. Figur 3M viser et repræsentativt billede af et neurofibroma, der opstår i en dorsal nerverod i en P 0-GGFβ3-mus. Bemærk, at denne tumor er mindre cellulær end MPNST'erne vist i figur 3A-J. Den vigtigste diagnostik for neurofibromer er, at de består af en kompleks blanding af neoplastiske Schwann-celler og ikke-neoplastiske mastceller, makrofager, fibroblaster og perineuriallignende elementer, der infiltrerer nerven og spreder axoner fra hinanden.

Figur 4 illustrerer eksempler på de pletter, der er mest nyttige til den første identifikation af et plexiformt neurofibroma og skelner mellem et plexiform neurofibroma og en MPNST. Figur 4A illustrerer S100β immunreaktivitet i en P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma. Bemærk, at S100β immunoreaktivitet kun er tydelig i en underpopulation af celler, hvilket er i overensstemmelse med det faktum, at neurofibromer består af en blanding af neoplastiske Schwann-celler og andre ikke-neoplastiske elementer (fibroblaster, mastceller, makrofager, perineuriallignende celler, en dårligt defineret CD34-immunoreaktiv cellulær population og vaskulatur). Desværre skelner ujævn S100β-farvning ikke mellem plexiforme neurofibromer og MPNST'er, da S100β-farvning kan være ujævn i MPNST'er (H&E-farvning er nyttig til dette formål; da MPNST'er typisk er mere cellulære end plexiforme neurofibromer [se figur 3]). Neoplastiske Schwann-celler er også immunreaktive for det mellemliggende filamentnestin som demonstreret i P 0-GGFβ3 MPNST præsenteret i figur 4B. Neoplastiske Schwann-celler viser også ofte nuklear immunreaktivitet for transkriptionsfaktoren Sox10, som vist i en MPNST i figur 4C. Funktioner, der er nyttige til at skelne mellem plexiforme neurofibromer og MPNST'er, er tilstedeværelsen af mastceller og fremtrædende immunreaktivitet for Ki67-proliferationsmarkøren. Figur 4D illustrerer en Unna-plet udført på et P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma for at fremhæve tilstedeværelsen af mastceller, som let kan identificeres ved den fremtrædende metakromatiske violette farvning af deres cytoplasmatiske granulater. Mastceller er ikke til stede i MPNST'er. I modsætning hertil er Ki67 immunreaktivitet praktisk talt ikke-eksisterende i plexiforme neurofibromer som set i P 0-GGFβ3 tumoren vist i figur 4E. Nuklear Ki67-mærkning er typisk til stede i en meget høj brøkdel af tumorceller, som det ses i den mikroskopiske MPNST, der opstår i trigeminusganglionen hos en P 0-GGFβ3-mus (figur 4F).

Figur 5 illustrerer eksempler på de pletter, som vi udfører for fuldt ud at karakterisere den cellulære sammensætning af neurofibromer i en nyudviklet GEM-model. Selvom pletterne vist i denne figur blev opnået i humane dermale neurofibromer, er de identiske i udseende med det, vi har set i GEM-tumorer. Immunoreaktivitet for CD117 (c-Kit) er til stede i mastceller i neurofibromer og har således en fordeling, der ligner meget det, der ses med Unna-pletter (se figur 3A). Makrofager er også til stede spredt over neurofibromer, som det ses med pan-makrofagmarkøren Iba1 (se figur 5D); dette omfatter underklasser af makrofager, der er immunreaktive for CD163 og CD86 (se henholdsvis figur 5B og figur 5C). En brøkdel af det Schwanniske element i neurofibromer demonstrerer også nuklear immunreaktivitet for Sox10. Fibroblaster kan fremhæves ved deres immunreaktivitet for TCF4. I figur 5G mærker CD31 de vaskulære elementer i neurofibromet, mens CD34, demonstreret i figur 5H, mærker en gådefuld dendritisk population af celler, der er blevet foreslået at være enten en underpopulation af residente vævsmakrofager30 eller en ny population af nervekappeceller, der hverken er Schwann-celler eller fibroblaster31.

Figur 6 er inkluderet for at muliggøre sammenligning af humane plexiforme neurofibromer og MPNST'er med tumorerne set i P 0-GGFβ3-mus og for at give repræsentative eksempler på nogle af de humane tumortyper, der kan forveksles med MPNST'er. Figur 6A illustrerer et plexiform neurofibrom, der opstod i brachial plexus hos en NF1-patient, mens figur 6B viser WHO grad IV MPNST, der opstod inden for det samme plexiforme neurofibroma. Figur 6B viser nogle af de karakteristiske træk ved en WHO grad IV MPNST, herunder markant hypercellularitet og cellulær atypi, livlig mitotisk aktivitet og tumornekrose. Til sammenligning viser figur 6C en WHO klasse II MPNST, der har signifikant cellulær atypi, men er mindre hypercellulær end grad IV MPNST, og selvom mitoser er til stede, viser mindre mitotisk aktivitet. Figur 6D illustrerer en fibrosarkom med sit karakteristiske "sildeben" mønster af sammenvævede skeder af tumorceller. Dette mønster skelner ikke nødvendigvis mellem fibrosarkomer og MPNST'er, fordi nogle MPNST'er vil have et lignende mønster. Endvidere viser billedet med højere effekt, der er vist i figur 6E, cellulær morfologi, der ligner den, der ses i WHO's klasse IV MPNST præsenteret i figur 6B. Figur 6F illustrerer en leiomyosarkom. I modsætning til de fleste MPNST'er er leiomyosarkomer immunoreaktive for muskelmarkører såsom glat muskelaktin og desmin. Glat muskelaktinimmunoreaktivitet kan dog variere fra tumor til tumor, hvor nogle tumorer viser intens ensartet immunreaktivitet (figur 6G) og andre viser immunreaktivitet, der viser cellulær variabilitet i tumoren (figur 6H). Desmin immunreaktivitet kan også være ujævn i leiomyosarkomer (figur 6I). Melanomer er meget variable i morfologi, hvor nogle tumorer består af polygonale celler (figur 6J) og andre består af spindelceller, der kan efterligne MPNST-cellernes morfologi. Melanomer kan skelnes fra MPNST'er ved immunoreaktivitet for melanosommarkører såsom MART1 (figur 6K). Imidlertid er melanomer, ligesom MPNST'er, ofte positive for S100β og Sox10 (figur 6L).

Figur 7 illustrerer de patologiske træk ved WHO klasse II, III og IV MPNST'er isoleret fra P0-GGFβ3-mus. Figur 8 viser repræsentative billeder af P0-GGFβ3 MPNST-celler ved lav (figur 7A) og høj (figur 7B) effekt. Disse cellers tumorigenicitet demonstreres både ved deres evne til at danne kolonier, når de suspenderes i blød agar (figur 7C), og til at danne transplantater, når de allokpoderes subkutant i immundefekte mus (figur 7D).

Figure 1
Figur 1: Arbejdsproces brugt til at behandle tumor og andet væv fra P 0-GGFβ3 mus. (A) Groft synlige tumorer høstes og segmenteres i tre portioner til 1) fiksering i 4% paraformaldehyd efterfulgt af immunhistokemi og histokemi, 2) etablering af tumorcellekultur og / eller genomiske analyser og 3) snapfrysning ved hjælp af flydende nitrogen til protein-, DNA- eller RNA-isolering. (B) Efter udskæringen af tumoren fastgøres musens krop i 4% paraformaldehyd, og de indre organer fjernes. Disse organer udtages prøver til histologisk undersøgelse udført for at identificere mikroskopiske tegn på neoplasma og andre patologiske processer. C) Efter fjernelse af indre organer fjernes ekstremiteterne (hoved, lemmer, hale) og hud fra slagtekroppen. Rygsøjlen, tilstødende ribben og tilstødende skeletmuskulatur afkalkes ved hjælp af 0,3 M EDTA / 4% paraformaldehyd (pH 8,0). Det afkalkede væv paraffinindlejres derefter, og sektioner af vævene forberedes til immunohistokemisk og histokemisk undersøgelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af groft tydelige neurofibromer og MPNST'er i P 0-GGFβ3 mus. (A) P 0-GGFβ3 mus med en stor groft tydelig tumor på højre flanke (pil). (B) En MR-scanning af denne mus viser, at tumoren er forbundet med iskiasnerven (pilespids), og at den er vokset gennem den overliggende fascia for at udvide sig inden for den subkutane (pil, bulktumormasse). (C) Mikroskopisk undersøgelse af denne tumor viser, at tumoren på trods af sin store størrelse er et neurofibroma. (D) Stor kødfuld MPNST, der opstod i brachial plexus af en P 0-GGFβ3 mus. Skalabjælke = 100 μm. (C). Forkortelser: MPNST'er = maligne perifere nerveskedetumorer; MR = magnetisk resonansbilleddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af MPNST'er, afkalkede rygsøjle og neurofibromer fremstillet som beskrevet i protokolafsnit 1. (A-J) Udskårne og H&E-farvede P 0-GGFβ3 MPNST'er viser histologisk variation. Alle billeder er uafhængigt opståede MPNST'er. På trods af denne histologiske variabilitet viste disse tumorer alle passende mærkning for MPNST-markørerne angivet i tabel 1. Skalastænger = 200 μm. (K) Repræsentativt billede af et H&E-farvet tværsnit af den afkalkede rygsøjle. I dette billede visualiseres følgende strukturer let: rygmarven; hvirveldyr; dorsale rodganglier på dorsal rygmarvsnerverod; og paravertebral skeletmuskulatur. Forstørrelse 4x. (L) Et billede med højere effekt af rygmarven og ryghvirvlen vist i K viser knoglens korrekte udseende efter afkalkning med denne metode. Forstørrelse 10x. (M) Repræsentativt billede af en dorsal nerverod neurofibroma i en P 0-GGFβ3 mus. Forstørrelse 40x. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: MPNST'er = maligne perifere nerveskedetumorer; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Diagnostisk plet anvendt til den første identifikation af plexiforme neurofibromer og deres sondring fra MPNST'er. (A) Immunostains for S100β i en P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma. Bemærk, at intens brunfarvning for dette antigen kun er til stede i en delmængde af celler i denne tumor, i overensstemmelse med det faktum, at neurofibromer består af neoplastiske Schwann-celler og flere andre ikke-neoplastiske celletyper. B) Immunofluorescensbillede af en P 0-GGFβ3 MPNST farvet til intermediærfilamentnestin (rød) og modfarvet med bisbenzimid (blå, kernefarve). C) MPNST farvet for transkriptionsfaktoren Sox10. Intens immunreaktivitet (brun) er tydelig i kernerne i en delmængde af tumorceller. (D) Højeffektbillede af et P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma efter en Unna-plet. Denne plet producerer metakromatisk (violet) farvning af granulaterne i mastceller. Plexiform neurofibromer kan skelnes fra MPNST'er, fordi sidstnævnte mangler mastceller. (E,F) Ki67 immunhistokemi i (E) a P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma og (F) a P0-GGFβ3 MPNST. Begge sektioner er blevet modfarvet med hæmatoxylin (blå nuklear farvning), hvor Ki67-immunreaktivitet er tydelig som brun nuklear farvning i disse immunoperoxidasepletter. Bemærk, at ingen brun nuklear farvning er tydelig i plexiform neurofibroma, mens de fleste tumorcellekerner er positive i MPNST. Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: MPNST = malign perifer nerveskede tumor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative billeder af immunpletter, der anvendes til at identificere subpopulationerne af celler, der udgør neurofibromer. Disse immunfluorescerende billeder fra en human dermal neurofibroma er blevet farvet for (A) CD117 (c-Kit; en markør for mastceller), (B) CD163 (M2 makrofager), (C) CD86 (M1 makrofager), (D) Iba1 (pan-makrofagmarkør), (E) Sox10 (Schwann-cellemarkør), (F) TCF4 (fibroblastmarkør), (G) CD31 (markør for vaskulatur) og (H) CD34 (markerer en tydelig, dårligt forstået subpopulation af celler i neurofibromer). Forstørrelse 60x, skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative billeder af plexiforme neurofibromer, MPNST'er og nogle andre humane tumortyper, der overvejes i differentialdiagnosen af en MPNST. (A) Plexiform neurofibroma, der opstår i brachial plexus hos en NF1-patient, der viser den samlede lavere cellularitet og godartede udseende af denne neoplasma. Selvom det ikke let visualiseres i H&E-farvede sektioner, er en kompleks blanding af celletyper til stede. Mitoser ses ikke. Forstørrelse: 40x. (B) A WHO grad IV MPNST, der opstod fra plexiform neurofibroma illustreret i A. Bemærk den meget højere grad af cellularitet. Pilen angiver en mitotisk figur, og stjernen angiver en region med tumornekrose i øverste højre del af dette mikroskopiske felt. Forstørrelse: 40x. (C) A WHO klasse II MPNST. Denne tumor har en lavere grad af cellularitet end WHO grad IV MPNST illustreret i B. Der er imidlertid mere nuklear atypi og hyperkromasi end det er tydeligt i plexiform neurofibroma illustreret i A. Pilen angiver en af de lejlighedsvise mitotiske figurer, der blev stødt på i denne neoplasma. Forstørrelse: 63x. (D) Et billede med lav effekt af en fibrosarkom af voksentype, der illustrerer "sildeben" -mønsteret (de sammenvævede skeder af tumorceller), der typisk ses i denne tumortype. Desværre findes sildebensarkitektur også i nogle menneskelige MPNST'er og kan derfor ikke bruges til at skelne mellem fibrosarkomer og MPNST'er. Forstørrelse: 20x. (E) Et billede med højere effekt af fibrosarkom illustreret i D. Bemærk ligheden mellem den cellulære morfologi i denne fibrosarkom og den cellulære morfologi, der er tydelig i WHO grad IV MPNST vist i B. Forstørrelse: 40x. (F) Højeffektbillede af en leiomyosarkom, der demonstrerer cellulær morfologi, der falder inden for variationsområdet set i MPNST'er. Forstørrelse: 40x. (G) Immunopletter til glat muskelaktin i leiomyosarkom illustreret i F. Bemærk, at tumorcellerne viser ensartet intens immunreaktivitet for dette antigen. Forstørrelse: 40x. (H) Immunopletter til glat muskulatur actin i en anden leiomyosarcoma. I denne tumor er der større variation i graden af immunreaktivitet, hvor nogle celler farver mere intenst end andre. Det er ikke ualmindeligt, at immunoreaktivitet for det samme antigen er ensartet til stede i en tumor og kun er til stede i en delmængde af tumorceller i en anden neoplasma. Forstørrelse: 40x. (I) Immunostain for desmin i en tredje leiomyosarkom. I denne tumor er kun en delmængde af tumorceller intenst immunreaktiv for dette antigen. J) metastatisk melanom. Melanomer er berygtede for at have meget variabel morfologi, der kan variere fra kuboid til spindel; tumorer med sidstnævnte morfologi er mest tilbøjelige til at blive forvekslet med MPNST'er, især i betragtning af at både melanomer og MPNST'er kan demonstrere S100β og Sox10 immunreaktivitet. Forstørrelse: 40x. (K) Immunoreaktivitet for melanommarkøren MART1 i tumoren illustreret i J. Forstørrelse: 40x. (L) Nuklear immunreaktivitet for transkriptionsfaktoren Sox10 i melanom vist i J. Forstørrelse: 40x, skalabjælker = 100 μm. Forkortelse: MPNST = malign perifer nerveskede tumor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative billeder af WHO klasse II-IV P 0-GGFβ3 MPNST'er. (A) Lav- og (B) højeffektfotomikrografier af en WHO klasse II MPNST. Bemærk, at cellulariteten er lavere end WHO grad III MPNST illustreret i panel C, og at kernerne i tumorcellerne i D er mere hyperkromatiske (mørkere) end dem, der ses i panel B. (C) Lav- og (D) højeffektfotomikrografier af en WHO klasse III MPNST. Denne tumor viste >4 mitotiske tal pr. 10 højeffektfelter med celler, der var tættere pakket og mere hyperkromatiske, atypiske kerner. (E) Lav- og (F) højeffektvisninger af en WHO-klasse IV MPNST. Bemærk fokus på nekrose i den nederste midterste del af panel F. Lav effekt = 20x. Høj effekt = 40x, skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative billeder af tidlige passager P 0-GGFβ3 MPNST-celler og deres tumorigenicitet som demonstreret ved vækst i blød agar og deres evne til at vokse som allotransplantater. (A) Lav- og (B) fasekontrastbilleder med høj effekt af tidlige passager P0-GGFβ3 MPNST-celler. C) P 0-GGFβ3 MPNST-celler dyrket i blød agar og farvet med sort sudan Kolonierne er tydelige som sort puncta i agaren. (D) Hæmatoxylin og eosinfarvet billede af en tumor, der blev dannet efter P 0-GGFβ3 MPNST-celler, blev allokpodet subkutant i en immundefekt mus som beskrevet i protokollen. (E) Spredning af tidlig passage P 0-GGFβ3 MPNST-celler over en 5-dages periode bestemt af et Celigo Image Cytometer. Lav effekt = 10x, høj effekt = 40x; Skalabjælke = 100 μm for alle paneler Klik her for at se en større version af denne figur.

Navn Brug Arters reaktivitet/klasse
CD117 Forfortyndet Kanin monoklonal
CD163 1:200 mus monoklonl
CD31 1:50 Kanin polyklonal
CD34 1:2000 Kanin monoklonal
CD86 1:1000 Kanin monoklonal
Cytokeratin 1 μg/ml mus monoklonal
Desmin 1:50 mus monoklonal
Iba1 1:500 Polyklonal kanin
Ki-67 1:50 Kanin monoklonal
MART1 1 μg/ml mus monoklonal
Nestin 1:1,000 mus monoklonal
PMEL 1:100 Rabbot monoklonal
S100B 1:200 Kanin polyklonal
SMA 1:100 mus monoklonal
Sox10 1:10 mus monoklonal
TCF4/TCFL2 1:100 Kanin monoklonal

Tabel 1: Antistoffer anvendt til diagnosticering af plexiform neurofibroma og maligne perifere nerveskedetumorer. Antistoffer anvendt til rutinemæssig identifikation af GEM plexiform neurofibromer (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnosen MPNST'er og en fuldstændig vurdering af andre celletyper, der er til stede i neurofibromer. Forkortelse: MPNST = malign perifer nerveskede tumor.

S100β Nestin Sox10 MART1 PMEL Desmin Glat muskulatur actin Cytokeratin SS18-SSX Fusion
MPNST 50-90%, normalt fokal Positiv1 ~30% Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
Fibrosarkom Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ
Leiomyosarkom Sjælden Negativ Negativ Negativ Negativ 50-100% Positiv ~40% Negativ
Epitel sarkom Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Negativ
Melanom Positiv Positiv 85% Positiv Positiv Negativ Negativ Negativ Negativ
Monofasisk synovial sarkom ~30% Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Negativ Positiv Positiv

Tabel 2: Markører bruges til at etablere tumoridentitet hos mennesker. Disse immunohistokemiske og histokemiske markører sammen med en vurdering af tumormikroskopisk morfologi anvendes til at skelne MPNST'er fra andre neoplasmer, der efterligner dem. Den differentielle diagnose, der typisk overvejes for humane MPNST'er, inkluderer fibrosarkom af voksentype, epiteloid sarkom, leiomyosarkom, monofasisk synovial sarkom og melanom. Fibrosarkomer af voksentype har et sildebensmønster mikroskopisk og pletter for vimentin, men ikke S100β. Leiomyosarkomer, men ikke MPNST'er, er immunoreaktive for desmin; Leiomyosarkomer har også kerner med en særlig stump morfologi. Epitheloid sarkomer, men ikke MPNST'er, er immunoreaktive for cytokeratin. Melanomer, som MPNST'er, kan være S100β-positive, men er også immunoreaktive for MART-1 og PMEL. Forkortelse: MPNST = malign perifer nerveskede tumor. 1Kombination af S100β og nestin meget forudsigende for MPNST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De histologiske og biokemiske metoder, der præsenteres her, giver en ramme for diagnosticering og karakterisering af GEM-modeller af neurofibroma og MPNST-patogenese. I årenes løb har vi fundet, at disse metoder er ret nyttige til vurdering af patologien af perifere nervekappetumorer, der opstår i GEM-modeller 21,25,26. Men mens de protokoller, der er skitseret her, er nyttige til at bestemme, hvor præcist tumorer i GEM-modellerne rekapitulerer patologien hos deres menneskelige kolleger, er der nogle begrænsninger for disse strategier, der bør værdsættes. Til at begynde med viser P 0-GGFβ3-mus næsten fuldstændig penetrans af deres tumorfænotype, hvilket gør det relativt let at opnå et stort antal mus med neurofibromer og MPNST'er 21,25,26, der kan bruges til genomiske undersøgelser og genomskala shRNA-skærme. Den høje penetrans af fænotypen i denne model gør også P 0-GGFβ3 mus ret nyttige til prækliniske forsøg. Det skal dog erkendes, at dette ikke vil være tilfældet for alle GEM-kræftmodeller. Derfor har vi understreget vigtigheden af at bestemme den brøkdel af dyr, der kan forudsiges at udvikle tumorer. Når vi arbejder med en dyremodel, der mindre almindeligt udvikler tumorer, har vi fundet det fordelagtigt at bruge billeddannelsesmetoder såsom magnetisk resonansbilleddannelse eller positronemissionstomografi til definitivt at identificere dyr, der bærer tumorer, der kan indgå i prækliniske forsøg eller andre undersøgelser. Denne tilgang kan dog være omkostningsuoverkommelig, hvis gentagne scanninger er påkrævet. Derfor understregede vi også vigtigheden af at etablere den gennemsnitlige overlevelsestid for GEM-modellen af interesse26-forståelse, når et dyr kan forventes at udvikle en tumor, reducerer antallet af scanninger, der er nødvendige for at identificere dyr med den ønskede fænotype og tilhørende omkostninger.

Det er også vigtigt at erkende, at en stor tumor i en mus stadig er en ret lille mængde væv. I denne protokol anbefaler vi en proces, hvor tumorvævet er opdelt i tredjedele, med dele afsat til histologi / immunhistokemi, etablering af tidlige passagecellekulturer og isolering af biomolekyler (proteiner, RNA, DNA) af interesse. Imidlertid vil tumorstørrelsen variere, og hvis tumoren er ret lille, kan dette udelukke at have nok væv til at opdele på denne måde. I så fald skal efterforskeren afgøre, om tumordiagnose eller anden anvendelse af tumorvæv prioriteres32. Under disse omstændigheder er vores bias, at vi skal have en ordentlig diagnose for at forstå, hvad vi arbejder med, før vi går i gang med andre eksperimenter. Vi har fundet ud af, at tumordiagnoser normalt let kan etableres ved hjælp af mindre end en tredjedel af neoplasmaet. Når vi beskæftiger os med små tumorer, vil vi i stedet typisk fjerne et lille fragment af tumorvæv, pakke det ind i histologivæv og placere det i en vævskassette for at sikre, at vævet ikke går tabt under behandlingen. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at det kan få efterforskeren til at underklassificere neoplasmaet, hvis WHO-klassificering ønskes; Dette skyldes, at regioner af lavere og højere kvalitet almindeligvis sameksisterer i kræftformer, og hvis der tages en meget lille prøve, afhænger den opnåede karakter af, hvor tumorprøven blev taget fra.

De protokoller, vi beskriver til etablering af perifer nerveskede tumoridentitet, er stærkt afhængige af immunhistokemi. Mens der lejlighedsvis er alternative tilgange, der kan bruges til nogle celletyper (f.eks. Udførelse af Unna-pletter for at identificere mastceller), gælder det ikke ensartet for de fleste af de celletyper, der findes i neurofibromer og MPNST'er. Derfor skal der udvises stor omhu for at fastslå, at de immunhistokemiske procedurer, der vil blive anvendt, er blevet korrekt optimeret. Det er vores erfaring, at flere problemer kan kompromittere diagnostisk immunhistokemi. Det er kritisk vigtigt, at efterforskeren udfører en fortyndingsserie med et primært antistof, som de ikke har brugt før; Derudover bør der udføres en fortyndingsserie, når der anvendes en ny batch af et antistof, der tidligere er optimeret33. Der skal også drages omsorg for, at der er friske partier af reagenser til rådighed. Det er vores erfaring, at når de bliver ældre, er brintoverilte og DAB særligt tilbøjelige til ikke at fungere korrekt, hvilket kan føre til, at efterforskeren uhensigtsmæssigt beslutter, at deres pletter er negative.

De immunohistokemiske profiler, som vi beskriver for plexiforme neurofibromer, MPNST'er og de forskellige typer neoplasmer, der overvejes i differentialdiagnosen af MPNST'er, er dem, som vi oftest har stødt på 21,25,26,34. Da divergerende differentiering imidlertid ikke er ualmindelig i MPNST'er og disse andre maligniteter, kan efterforskeren støde på farvningsprofiler, der adskiller sig noget fra det, vi beskriver her. Disse nuancer er grunden til, at vi stærkt anbefaler, at holdet, der karakteriserer en ny GEM-model af tumorigenese, inkluderer en erfaren human eller veterinærpatolog. I denne protokol har vi anvendt WHO-klassificering til GEM og menneskelige MPNST'er. Vi foretrækker dette klassificeringssystem, fordi klassificeringskriterierne er relativt veldefinerede og er lette at sammenligne mellem MPNST'er til mennesker og mus 2,28. Vi vil dog bemærke, at WHO's klassificeringskriterier ikke accepteres ensartet af patologer. Dette skyldes, at det ikke er klart, at de tre WHO-grader, der anvendes på MPNST'er, er prædiktive for kliniske resultater hos patienter. På grund af dette foretrækker mange patologer at klassificere MPNST'er simpelthen som maligniteter af lav kvalitet eller høj kvalitet. Ved hjælp af denne tilgang betragtes ca. 85% af MPNST'erne som højkvalitets maligniteter præget af livlig mitotisk aktivitet, markeret cellulær atypi og hyperkromasi, der kan ledsages af tumornekrose. Lavkvalitets MPNST'er viser mindre cellularitet, hyperkromasi og mitotisk aktivitet.

Vi har fundet ud af, at allografting af MPNST-celler med tidlig passage er et ligetil middel til at verificere tumorigeniciteten af disse kulturer. Nogle problemer bør dog overvejes, når cellerne ikke etablerer et allotransplantat32. Det er vores erfaring, at mens det overvældende flertal af MPNST-celler med tidlig passage vil etablere et allotransplantat, er vi lejlighedsvis stødt på tidlige passagekulturer, der ikke gør det. På trods af denne fiasko viste array komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og hel eksomsekventering, at disse tidlige passagekulturer havde flere genomiske abnormiteter, der var i overensstemmelse med, at de var tumorceller25,26. Vi har også fundet tidlige overgangskulturer, der ikke er sunde, normalt fordi kulturerne fik lov til at blive sammenflydende, før de blev høstet til podning. Celler, der er beskadiget ved grov håndtering (f.eks. inkuberet for længe med ikke-enzymatisk celledissociationsopløsning, der pipetteres op og ned et for stort antal gange), fungerer også dårligt, når de podes. Vi vil også bemærke, at de tidspunkter, vi har angivet for podningsetablering, er et skøn baseret på vores erfaring. Lejlighedsvis har vi stødt på tidlige overgangskulturer, der med succes vil etablere allotransplantater, men tager længere tid at gøre det.

De ovenfor skitserede tilgange giver et omfattende middel til at karakterisere nøgleaspekter af en nyudviklet GEM-model af neoplasi i perifert nervesystem og korrekt diagnosticere eventuelle neurofibromer og MPNST'er, som disse dyr udvikler. De metoder, vi skitserer til etablering af MPNST-kulturer med tidlig passage og brug af disse kulturer til allogpodning, giver også klare beviser for tumorigeniciteten af neoplasmer identificeret i GEM-modeller. Vi vil gerne understrege, at vi ikke udfører udvælgelsen af individuelle kloner, når vi etablerer tidlige passagekulturer. Selvom vi erkender, at en vis selektion er uundgåelig, når man placerer tumorceller i kulturer, tyder disse indledende fund på, at mutationerne identificeret i tidlige GEM MPNST-kulturer forbliver meget som dem, der er til stede i modertumoren. Men ved hjælp af agGgh har vi også fundet ud af, at fortsat at bære disse tidlige passagekulturer i mere udvidede passager resulterer i genomiske ændringer, der begynder at afvige fra det, der ses i de tidligere passager af disse tumorceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 og R01 NS109655 til S.L.C.; R01 NS109655-03S1 til D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 til S.L.C.) og forsvarsministeriet (X81XWH-09-1-0086 og W81XWH-12-1-0164 til S.L.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Corning Falcon 353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) Vector Laboratories SK-400
6- well plates Corning Costar 3516
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) Invitrogen A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) Invitrogen A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-500
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Caldesmon ABCAM  E89, ab32330
CD117 Cell Marque 117R-18-ASR
CD163 Leica NCL-L-CD163
CD31 ABCAM  ab29364
CD34 ABCAM  ab81289
CD86 ABCAM  ab53004
Cell Scraper Sarstedt 83.183
Cell Stripper Corning 25-056-CI
Circle Coverslip Fisher Scientific 12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) Decon Laboratories 5989-27-5
Critic Acid Fisher Scientific A104-500
Cytokeratin ABCAM  C-11, ab7753
Desmin Agilent Dako  clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution Vector Laboratories SK-4100
DMEM Corning 15-013-CV
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Fetal Calf Serum Omega Scientific FB-01
Forksolin Sigma-Aldrich F6886
Glycerol Sigma-Aldrich G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Hemacytometer Brightline-Hauser Scientific 1490
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific 327-500
Iba1 Wako Chemicals 019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse Vector Laboratories MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit Vector Laboratories MP-7401
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Isopropanol Fisher Scientific A415
Ki-67 Cell Signaling  12202
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015
Liquid Nitrogen
MART1 ABCAM  M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin Millipore  Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta In house Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin Santa Cruz Biotechnology  sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice Jackson Laboratory 5557
Nonfat Dry Milk Walmart Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice In house
Paraffin Wax Leica Paraplast 39601006
Parafilm M Sigma-Aldrich PM-999
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium) Fisher Scientific SP15-100
pH Meter Mettler Toldedo Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) Corning 20-031-CV
PMEL ABCAM  EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) Millipore Sigma 10981100ML
Rice Cooker Beech Hamilton
S100B Agilent Dako  Z0311  (now GA504)
SMA Ventana Medical Systems  clone 1A4
Sodium Chloride Fisher Scientific S640
Sodium Citrate (Dihydrate) Fisher Scientific BP327-1
Sox10 ABCAM  ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
TCF4/TCFL2  Cell Signaling  (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue ACROS Organics 348600050
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
TRIzol Invitrogen 15596026
Trypsin Corning 25-051-31

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 207
Identificere, diagnosticere og klassificere maligne perifere nerveskedetumorer i genetisk manipulerede musemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B.,… More

Jenkins, D. P., Turner-Ivey, B., Fromm Longo, J., Carroll, S. L. Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models. J. Vis. Exp. (207), e65740, doi:10.3791/65740 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter