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Biology

Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.

Abstract

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) che causa la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19) è una seria minaccia per la salute pubblica. Durante le stagioni influenzali, la diffusione del SARS-CoV-2 e di altri virus respiratori può causare un carico di malattie respiratorie a livello di popolazione che è difficile da gestire. Per questo, i virus respiratori SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) dovranno essere attentamente monitorati nelle prossime stagioni autunnali e invernali, in particolare nel caso di SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, che condividono fattori epidemiologici simili come popolazioni suscettibili, modalità di trasmissione e sindromi cliniche. Senza saggi specifici per il bersaglio, può essere difficile distinguere tra i casi di questi virus a causa delle loro somiglianze. Di conseguenza, un test multiplex sensibile e mirato, in grado di differenziare facilmente tra questi bersagli virali, sarà utile per gli operatori sanitari. In questo studio, abbiamo sviluppato un test basato sulla PCR con trascrittasi inversa in tempo reale utilizzando un kit RT-qPCR R3T one-step sviluppato internamente per il rilevamento simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con un minimo di 10 copie dei loro RNA sintetici, possiamo identificare con successo i bersagli di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV contemporaneamente con una specificità del 100%. Questo test è risultato accurato, affidabile, semplice, sensibile e specifico. Il metodo sviluppato può essere utilizzato come test diagnostico ottimizzato per SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV in ospedali, centri medici e laboratori diagnostici, nonché per scopi di ricerca.

Introduction

La pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) in corso è causata dal nuovo coronavirus noto come sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. A causa della forte contagiosità e della capacità di trasmissione rapida del SAR-CoV-2, la pandemia di COVID-19 è emersa nella città di Wuhan, in Cina, e si è diffusa rapidamente in tutto il mondo. Questo alla fine ha portato all'inizio di segni di distress respiratorio e persino alla morte 2,3,4. Il COVID-19 è stato dichiarato pandemia in più di 213 paesi, prevedendo un forte aumento del numero di casi confermati, come evidenziato dai documenti pubblicati da diversi studi di ricerca 3,5. Il COVID-19 si trasmette principalmente attraverso piccole goccioline respiratorie che le persone infette rilasciano nell'ambiente e quindi vengono esposte a persone vulnerabili attraverso l'inalazione o il contatto ravvicinato con superfici contaminate. Quando queste goccioline entrano in contatto con la mucosa degli occhi, della bocca o del naso, una persona può essere infettata6. Le statistiche pubblicate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) mostrano che ci sono stati più di 76 milioni di casi confermati di pandemia in tutto il mondo, con l'incredibile cifra di 7 milionidi morti. Pertanto, le Nazioni Unite hanno classificato la pandemia causata dalla malattia COVID-19 come un disastro a causa del suo impatto diretto sulla vita di miliardi di persone in tutto il mondo e ha avuto effetti economici, ambientali e sociali di vasta portata.

Le iniziative di salute pubblica, tra cui test approfonditi, diagnosi precoce, tracciamento dei contatti e isolamento dei casi, si sono dimostrate cruciali per tenere sotto controllo questa pandemia 8,9,10,11. I mesi invernali aumenteranno la circolazione di altri virus respiratori come l'influenza A e B con sintomi simili al COVID-19 che rendono difficile identificare, rintracciare e isolare precocemente i casi di COVID-19. Ogni anno, l'epidemia di influenza A e B inizia nel tardo autunno o all'inizio di gennaio con una stagionalità prevedibile12. Numerosi tratti epidemiologici sono condivisi dai virus SARS-CoV-2 e influenzali. Inoltre, condividendo somiglianze nelle popolazioni suscettibili che includono bambini, anziani, immunocompromessi e individui con comorbidità croniche come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, insufficienza cardiaca e renale o diabete12,13. Questi virus non solo condividono popolazioni vulnerabili, ma anche vie di trasmissione di contatto e goccioline respiratorie14. Si prevede che i pazienti possano probabilmente contrarre più di uno di questi virus respiratori conl'avvicinarsi della stagione influenzale. Per questo, lo screening del SARS-CoV-2 e dei virus dell'influenza deve essere eseguito su pazienti sintomatici prima che vengano isolati. L'esecuzione di test separati per i tre virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) non è possibile a causa della mancanza globale di risorse per l'estrazione e la diagnostica degli acidi nucleici. Per esaminarli tutti in un'unica reazione, è necessario sviluppare un metodo o un test.

La sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS)-CoV è un membro della famiglia del coronavirus umano (CoV). I primi isolati del virus MERS-CoV provenivano da un paziente ricoverato in Arabia Saudita che era morto nel settembre 2012 a causa di problemi respiratori acuti15. Ci sono prove che suggeriscono che un importante ospite serbatoio per MERS-CoV sono i dromedari. È stato dimostrato che i virus dei dromedari infetti sono zoonotici e quindi possono infettare l'uomo16,17. Gli esseri umani infettati da questo virus possono diffonderlo ad altri attraverso il contatto ravvicinato18. Al 26 gennaio 2018, ci sono stati 2143 casi confermati in laboratorio di infezione da MERS-CoV, inclusi 750 decessi a livello globale19. I sintomi più tipici della MERS-CoV sono tosse, febbre e mancanza di respiro. È stato anche segnalato che le infezioni da MERS-CoV mostrano sintomi di polmonite, diarrea e malattie gastrointestinali20. Attualmente, non è disponibile alcun vaccino commerciale o trattamento specifico per MERS-CoV. Pertanto, una diagnosi tempestiva e precisa è essenziale per prevenire le diffuse epidemie di MERS-CoV e differenziare la malattia MERS-CoV dalla malattia SARS-CoV-2.

Ad oggi, sono stati proposti molti approcci per rilevare questi virus, come RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, test immunologico a flusso laterale30, sensori biomolecolari cartacei31, test SHERLOCK in one pot32, aptamero del DNA33, isoterma mediata da loop amplificazione (LAMP)19,34, ecc. Ognuno dei metodi sopra menzionati presenta vantaggi e svantaggi unici in termini di sensibilità e specificità. Tra questi metodi, il test basato sull'amplificazione degli acidi nucleici: qRT-PCR multiplex, è il più comune ed è considerato il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.

In questo studio, abbiamo progettato e valutato varie combinazioni di primer e sonde per il rilevamento efficace, accurato e simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizzando RNA virali sintetici a torsione standard. I test multiplexati sviluppati per i geni bersaglio di MERS-CoV o SARS-CoV-2 sono raccomandati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Questi geni generalmente codificano proteine e complessi che contribuiscono alla formazione di un complesso di replicazione/trascrizione (RTC)35 come la regione all'interno del frame di lettura aperto 1a (ORF1a) utilizzato per il test MERS-CoV. Inoltre, le proteine strutturali sono codificate dai geni utilizzati nei saggi diagnostici come il gene della regione a monte dell'involucro (upE) e il gene del nucleocapside (N) che vengono utilizzati rispettivamente per i saggi MERS-CoV e SARS-Cov-235,36. Abbiamo utilizzato il kit RT-qPCR R3T one-step interno per stabilire la RT-qPCR per il rilevamento dei virus37. Il rilevamento dei virus, la sensibilità, la specificità e la gamma dinamica del nostro kit RT-qPCR R3T one-step e dei set di primer sono stati testati e valutati utilizzando diluizioni seriali di 10 volte degli RNA sintetici twist standard. Il limite di rilevamento pratico più basso era di circa 10 copie di trascrizioni per reazione. Di conseguenza, il kit RT-qPCR one-step R3T e i set di primer/sonde possono essere utilizzati e implementati con successo per la diagnosi simultanea di routine di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.

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Protocol

1. Espressione e purificazione della Taq polimerasi

  1. Costruire un plasmide con un tag esa-istidina separabile all'estremità C dell'enzima.
  2. Trasformare 50 ng del vettore di espressione nel ceppo di E. coli BL21-(DE3) seguendo il protocollo standard38.
  3. Inoculare le cellule trasformate in quattro matracci da 6 L contenenti ciascuno 2 L di brodo di terreno 2YT a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere il OD 600 di 0,8 o il numero di cellule 6,4 x 108 .
  4. Indurre l'espressione della Taq polimerasi con 0,5 mM di isopropil-β-d-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare ulteriormente a 16 °C per 18 ore con agitazione.
  5. Raccogliere le cellule facendole girare a 4 °C a 7808 x g per 10 min. Risospendere i pellet in 200 mL di un tampone di lisi Taq polimerasi ghiacciato (Tabella 1) in 5 mL/g di pellet cellulare.
  6. Incubare le cellule con lisozima (2 mg/mL di tampone di lisi) e inibitori della proteasi per 45 minuti, quindi far passare il lisato attraverso un interferente cellulare a 30 kPsi e centrifugare a 22.040 x g per 30 minuti a 4 °C per separare i detriti cellulari.
  7. Riscaldare il surnatante per 15 minuti a 85 °C. Centrifugare a 95.834 x g per 1 h a 4 °C. Raccogliere il surnatante e filtrarlo su ghiaccio utilizzando un filtro da 0,45 μm.
  8. Eseguire la purificazione delle proteine utilizzando la cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) facendo passare prima il campione attraverso una colonna Ni-NTA HP da 5 mL a una velocità di flusso di 4 mL/min utilizzando il tampone Taq polimerasi A (Tabella 2; Figura 1A).
  9. Lavare con 10 volumi di colonna (CV) di tampone Taq polimerasi A e 4% di tampone Taq polimerasi B (Tabella 2). Eluire la proteina legata con un gradiente lineare utilizzando il tampone Taq polimerasi B oltre 20 CV in un flacone da 100 ml.
  10. Far passare l'eluente nel flacone da 100 mL attraverso una colonna a scambio cationico da 5 mL a 4 mL/min utilizzando il tampone Taq polimerasi C (Tabella 2; Figura 1A).
  11. Lavare con 20 CV di tampone Taq polimerasi 100% C e tampone Taq polimerasi Taq D al 5% (Tabella 2).
  12. Eluire con un gradiente lineare utilizzando il tampone Taq polimerasi D (Tabella 2) a partire dal 5% al 100%.
  13. Controllare le frazioni eluite eseguendo l'elettroforesi su gel SDS-PAGE 39 seguita da colorazione con gel 40 come descritto in precedenza. In breve, prelevare 10 μL di ciascuna frazione e aggiungere un volume uguale di 2x colorante di carico SDS. Denaturare il campione a 90oC per 10 min. Caricare i campioni su gel SDS-PAGE al 10% e far scorrere il gel per 25 minuti a 200 V. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue e poi decolorare.
  14. Raccogliere tutte le frazioni che contengono Taq polimerasi purificata e dializzarle con il tampone di conservazione della taq polimerasi (Tabella 3) a 4 °C. Preparare brevemente 2 L del tampone di conservazione e immergere la cassetta di dialisi nel tampone per 2 minuti per idratare. Iniettare le frazioni raccolte con un ago nella cassetta di dialisi e lasciarle per una notte nel tampone di dialisi a 200 giri/min sull'agitatore.
  15. Dopo la dialisi, misurare la concentrazione proteica con uno spettrofotometro, fare aliquote di 10 μL, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
    NOTA: Filtrare tutti i tamponi per la purificazione utilizzando un filtro da 0,45 μm prima di caricarli nel sistema FPLC.

2. Espressione di MMLV-RT nel sistema di espressione e purificazione delle cellule di insetto

  1. Generazione e isolamento del DNA bacmidico
    1. Clonare la sequenza di MMLV-RT con un tag TEV-8xHis-Strep c-terminale con scissione C, come descritto in precedenza41.
    2. Miscelare 100 ng del vettore di espressione in 50 μL di cellule DH10Bac e mescolare delicatamente picchiettando la provetta.
    3. Incubare le cellule su ghiaccio per 15 min. Eseguire uno shock termico delle celle per 1 minuto a 42 °C.
    4. Trasferire immediatamente su ghiaccio e aggiungere 400 μL di terreno S.O.C. Incubare a 37 °C agitando per 4 ore.
    5. Piastra da 10 μL e 15 μL della miscela su piastre LB Agar contenenti tre antibiotici; 50 μg/mL di Kanamicina, 10 μg/mL di Tetraciclina e 7 μg/mL di Gentamicina insieme a 40 μg/mL di IPTG e 100 μg/mL di X-Gal per la selezione blu-bianca.
    6. Incubare le piastre a 37 °C per 48 ore. Raccogli diverse colonie bianche e una colonia blu come controllo e ri-striale su piastre di agar LB fresche contenenti gli antibiotici di cui sopra. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
    7. Dopo aver confermato il fenotipo bianco, prelevare un paio di colonie e inocularle in 10 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di Kanamicina, 10 μg/mL di tetraciclina e 7 μg/mL di gentamicina in provette da 50 mL.
    8. Incubare la coltura a 37 °C agitando a 170 giri/min per una notte. Pellet le cellule facendole girare a 22.040 x g per 10 min.
    9. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 250 μL di soluzione di risospensione dal kit miniprep (questa soluzione deve essere maneggiata secondo le istruzioni del produttore), quindi trasferire la soluzione in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
    10. Aggiungere 250 μL di soluzione di lisi, mescolare delicatamente e incubare per 3 minuti. Aggiungere 350 μL di soluzione neutralizzante, capovolgere 2x-3x e centrifugare a 22.040 x g per 10 min.
    11. Trasferire il surnatante in una provetta fresca e aggiungere un volume uguale di isopropanolo ghiacciato e incubare per 30 minuti a -20 °C.
    12. Pellet lungo il DNA precipitato ruotando a 22.040 x g per 10 min. Scartare il surnatante e lavare il pellet con 700 μL di etanolo ghiacciato al 70%, 2x.
    13. Rimuovere il surnatante con una pipetta senza toccare il pellet. Lasciare asciugare il pellet all'aria nella cappa a flusso laminare per 5-10 minuti o fino a quando non si vede più liquido nel tubo. Sciogliere il pellet in 100 μL di tampone EB.
  2. Trasfezione bacmidica e amplificazione del virus
    1. Preparazione del virus P1
      1. In una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti, seminare ~ 9 x 105 cellule/pozzetto in 2 mL di terreno di coltura di cellule di insetto.
      2. Incubare la piastra per ~30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle cellule di attaccarsi.
      3. Preparare la miscela Bacmid/Fugene come segue: mescolare 1 μg di DNA Bacmid e 300 μL di terreno di coltura di cellule di insetto in una provetta. In un'altra provetta, mescolare 8 μL di reagente di trasfezione e 300 μL di terreno per cellule di insetto. Miscelare entrambe le miscele mediante pipettaggio delicato e lasciare agire per ~30 minuti a temperatura ambiente per la formazione del complesso reagente bacmid/trasfezione.
      4. Aggiungere la miscela di complesso bacmidico (~210 μL) a ciascun pozzetto goccia a goccia e sigillare la piastra con una pellicola trasparente.
      5. Incubare la piastra a 27 °C per 3-4 giorni.
      6. Prelevare il terreno che contiene il virus, aggiungere FBS (concentrazione finale 2%), filtrare con filtro da 0,45 μm e conservare al buio a 4°C come riserva di virus P1.
    2. Preparazione del virus P2
      1. Trasfettare 50 mL di cellule di insetto a 2 x 106 cellule/mL con 3 mL di virus P1 in un pallone di coltura.
      2. Incubare a 27 °C con agitazione a 100 rpm per 4-6 giorni fino a quando la percentuale di cellule morte raggiunge il 25%-30%.
      3. Centrifugare a 300 x g per 10 min e raccogliere il surnatante che contiene il virus.
      4. Aggiungere FBS a una concentrazione finale del 2%, filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm e un'aliquota da 1 mL ciascuno e conservare a -80 °C come riserva di virus P2.
    3. Preparazione del virus P3
      1. Trasfettare 100 mL di cellule di insetto a 2 x 106 cellule/mL con 2 mL di virus P2 in un pallone di coltura.
      2. Incubare a 27 °C agitando a 100 rpm per 3-4 giorni fino a quando la percentuale di cellule morte raggiunge il 15%-20%.
      3. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e raccogliere il surnatante che contiene il virus.
      4. Aggiungere FBS ad una concentrazione finale del 2%. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm. Può essere conservato al buio a 4 °C per 1 mese.
  3. Espressione e purificazione di MMLV-RT in cellule di insetto
    1. Aggiungere 5 mL di virus P3 alle cellule fresche di insetto ad una densità di 2 x 106 cellule/mL (700 mL/2L di pallone) in un totale di 6 palloni.
    2. Raccogliere le cellule dopo 55-60 h di post-trasfezione facendo filare a 7808 x g per 10 min.
    3. Risospendere i pellet cellulari in 200 mL di tampone di lisi MMLV-RT (Tabella 4). Far passare il lisato attraverso un disgregatore cellulare a 15 kPsi e centrifugare a 22.040 x g per 30 minuti a 4 °C.
    4. Trasferire il surnatante in nuove provette e centrifugare nuovamente a 95,834 x g a 4 °C per 1 h. Raccogliere il surnatante e filtrarlo su ghiaccio utilizzando un filtro da 0,45 μm.
    5. Avviare la purificazione delle proteine utilizzando FPLC facendo passare prima il campione attraverso la colonna Ni-NTA Excel da 5 mL (Figura 1B) a una velocità di flusso di 4 mL/min utilizzando il tampone MMLV-RT A (Tabella 5).
    6. Lavare la colonna con 10 CV di tampone MMLV-RT A e 4% di tampone MMLV-RT B (Tabella 5) ed eluire la proteina con il gradiente lineare del tampone MMLV-RT B su 20 CV in un flacone da 100 ml.
    7. Far passare il campione eluito attraverso la colonna Strep 5 mL (Figura 1B) bilanciata con il tampone MMLV-RT C (Tabella 5).
    8. Lavare la colonna con 10 CV di tampone C 100% MMLV-RT ed eluire la proteina con un gradiente lineare con 20 CV di tampone D (Tabella 5).
    9. Controllare le frazioni eluite eseguendo SDS-PAGE come nei passaggi 1.13.-1.14. e raccogliere le frazioni che contengono MMLV-RT purificate da dializzare rispetto al tampone di conservazione MMLV-RT (Tabella 6) a 4 °C.
    10. Misurare la concentrazione proteica utilizzando Nanodrop, aliquota, congelare istantaneamente in azoto liquido e conservare a -80 °C.
      NOTA: Filtrare tutti i tamponi per la purificazione utilizzando un filtro da 0,45 μm prima di caricarli nel sistema FPLC.

3. Preparazione dei componenti del kit RT-qPCR multisala R3T one-step in-house

  1. Preparazione della miscela tampone
    1. Preparare il tampone 2x per la reazione RT-qPCR che contiene i reagenti precedentemente mostrati in37. Preparare tutti i reagenti in acqua priva di DNasi/RNasi e la miscela tampone conservata in un congelatore a -20 °C.
  2. Set di primer e sonde e preparazione della miscela di primer
    NOTA: Le sonde e i primer utilizzati sono elencati nella Tabella 7. Il kit multiplexato per l'influenza e il SARS-CoV-2 contiene 3 sonde e 4 set di primer diretti e inversi. Le sonde sono etichettate alle estremità 5′ utilizzando i reporter 6-carbossifluoresceina (FAM) per InfA, Texas Red-XN per SARS-CoV-2 (gene N) e Yakima Yellow per InfB. Il kit multiplexato MERS-CoV e SARS-CoV-2 contiene 3 sonde e 3 set di primer diretti e inversi. Le sonde sono anche marcate alle estremità 5′ utilizzando i reporter Texas Red-XN per MERS-CoV (gene ORF1a), VIC per MERS-CoV (gene UpE) e 6-carbossifluoresceina (FAM) SARS-CoV-2 (gene N).
    1. Preparare una miscela di primer contenente tutti i primer e le sonde elencati nella Tabella 7 con una concentrazione finale di 6,7 μM per ciascun primer diretto e inverso e 1,25 μM per ciascuna sonda in una provetta da 1,5 mL. Conservare la miscela di primer nel congelatore a -20 °C. Utilizzare il tampone di eluizione per ottenere il volume richiesto.
  3. Preparazione della miscela enzimatica
    1. Preparare la miscela enzimatica Taq polimerasi (30 U/μL) e MMLV-RT (60 ng/μL) nel tampone di conservazione della Taq polimerasi come mostrato nella Tabella 3 per ottenere il volume richiesto. Eseguire questo passaggio su ghiaccio e conservare la miscela enzimatica a -20 °C.
  4. Modello di RNA
    1. Risospendere separatamente gli RNA sintetici di SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B e MERS-CoV in 100 μL di 1x tampone Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl e 1 mM EDTA (pH 8,0) per ottenere una scorta di 1 x 106 copie di RNA/μL.
    2. Miscelare RNA sintetici per RT-qPCR nelle seguenti configurazioni: 1) SARS-CoV-2, influenza A e influenza B aggiungendo 5 μL di ciascun stock virale a un volume di 50 μL per ottenere 1 x 105 copie di RNA/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV aggiungendo 5 μL di ciascun ceppo virale a un volume di 50 μL per ottenere 1 x 105 copie di RNA/μL. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte di ciascuna miscela di RNA sintetico che vanno da 1 x 105 copie di RNA/μL a 10 copie di RNA/μL.
      NOTA: Assicurarsi di utilizzare acqua ghiacciata priva di DNasi/RNasi per preparare la diluizione seriale dei modelli.

4. Test RT-qPCR in un'unica fase di SARS-CoV-2, influenza A, influenza B e SARS-CoV-2 multiplexato in-house

NOTA: Disinfettare le superfici della workstation e utilizzare un modello di piastra a 96 pozzetti per pianificare il layout della piastra PCR.

  1. Preparazione della piastra a 96 pozzetti
    1. Scongelare 2 volte il tampone e la miscela di primer. Tenere la miscela di enzimi sul ghiaccio.
    2. A ciascun pozzetto, aggiungere 10 μL di miscela tampone 2x, 1,5 μL della miscela primer, 1 μL di miscela enzimatica, 6,5 μL di acqua priva di DNasi/RNasi e 1 μL della corrispondente miscela di RNA che deve essere testata. Il volume finale in ogni pozzetto è di 20 μL. Fare riferimento al layout preparato per assistenza in questo passaggio.
      NOTA: Si consiglia di creare una miscela master in base al numero di reazioni che contengono tutti i reagenti tranne il campione di RNA per evitare distorsioni di pipettaggio. Inoltre, eseguire le reazioni in duplicato o triplice per evitare errori tecnici.
    3. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastre PCR e centrifugare brevemente per 1 minuto per raccogliere tutto il liquido sul fondo della piastra. Assicurarsi che ogni pozzetto abbia lo stesso volume di liquido e sia privo di bolle prima di trasferire i campioni alla macchina qPCR.
      NOTA: Tutte le reazioni PCR devono essere impostate su ghiaccio.
  2. Programma PCR
    1. Aprire il programma della macchina qPCR in tempo reale e scegliere le seguenti proprietà sperimentali:
      Il tipo di blocco: Fast a 96 pozzetti (0,1 mL)
      Impostazione dell'esperimento: Curva standard
      Reagenti: Reagenti TaqMan
      Proprietà esecuzione: Standard.
    2. Definire tutti i bersagli genici e il loro colorante reporter come presentato nella Tabella 7. Inoltre, definire i nomi dei campioni per ogni reazione da testare per facilitare l'analisi delle curve di amplificazione.
    3. Assegnare target e campioni al layout della piastra del programma in base alla piastra a 96 pozzetti.
    4. Impostare il seguente programma di ciclo nello strumento PCR come segue:
      55 °C per 10 min
      40 cicli: 94 °C per 1 min
      94 °C per 10 s
      68 °C per 10 s
      68 °C per 20 s; qui acquisiscono la fluorescenza.
    5. Trasferire la piastra alla macchina qPCR in tempo reale e posizionarla nel supporto assicurandosi del corretto orientamento della piastra e avviare la corsa.
    6. Scegliere il percorso del file in cui salvare i dati sperimentali.
  3. Analisi dei dati
    1. È essenziale esaminare prima i diagrammi di amplificazione prodotti dal programma qPCR. Analizzare il limite di rilevamento per valutare la concentrazione minima di RNA che può essere rilevata.
    2. Tracciare il log del numero di copie di RNA sull'asse x e il corrispondente valore medio di Ct sull'asse y per valutare la sensibilità del saggio. La pendenza e l'R2 indicano l'affidabilità e l'efficienza della reazione.

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Representative Results

Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nell'approccio diagnostico per rilevare i virus respiratori comuni utilizzando gli approcci PCR 21,22,23,24,25. Tuttavia, nonostante questi progressi, l'approccio multiplexato, che consente di rilevare più virus in un singolo test, non è stato ampiamente implementato, in particolare nella piattaforma RT-qPCR. Questo metodo è stato implementato con successo utilizzando virus a RNA sintetici e l'ottimizzazione interna dei componenti della reazione37. La specificità, la sensibilità e l'affidabilità del test diagnostico sono state valutate come elevate, attraverso l'uso di un limite di analisi di rilevazione. L'approccio presentato potrebbe migliorare notevolmente l'efficienza e l'accuratezza della diagnosi dei virus respiratori, riducendo la necessità di test multipli e minimizzando il rischio di diagnosi errate come in43. Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i vantaggi di questo approccio utilizzando campioni di pazienti e incoraggiarne l'adozione nella pratica clinica.

Espressione e purificazione della Taq DNA polimerasi marcata con istidina
Sulla base del protocollo stabilito per l'espressione e la purificazione della Taq DNA polimerasi44, il plasmide della Taq DNA polimerasi marcato con istidina N-terminale è stato costruito sotto il controllo di un promotore di shock freddo per facilitarne l'espressione e il processo di purificazione, come spiegato sopra (Figure 1A e Figura 2A). Pertanto, semplicemente alterando la concentrazione e la temperatura dell'IPTG, il livello di espressione di questo nuovo costrutto può essere controllato facilmente. L'incubazione di cellule contenenti il plasmide Taq DNA polimerasi a 16°C con 1 mM IPTG ha mostrato una maggiore espressione della DNA polimerasi His-Taq. Inoltre, il protocollo44 stabilito in precedenza richiedeva lunghe fasi di precipitazione della polietilenimmina (PEI), che possono essere saltate con il costrutto utilizzato in questo caso, poiché la purezza del prodotto finale non è stata influenzata e paragonabile alla Taq polimerasi disponibile in commercio (Figura 2B). La Taq polimerasi purificata è migrata più lentamente di quella commerciale a causa della presenza dei peptidi linker tra l'enzima e il tag istidina all'N-terminale. La Taq DNA polimerasi è stata prodotta con successo con 0,98 mg/L di coltura di E. coli di proteina pura.

Espressione e purificazione della doppia trascrittasi inversa MMLV marcata con His- e Strep-Tagged
Il sistema di espressione del baculovirus è stato utilizzato per esprimere MMLV-RT con un doppio His C-terminale e Strep-tag nelle cellule di insetto (Sf9) come descritto nella Figura 2A. Uno studio precedente ha dimostrato che l'MMLV-RT marcato con C-terminale dimostra una maggiore attività in cui sia la proteina marcata N-terminale che la proteina marcata C-terminale sono state sintetizzate nei bachi da seta utilizzando il sistema vettoriale di espressione baco-baculovirus da seta (silkworm-BEVS)41. Per produrre una proteina MMLV-RT omogenea, sono state utilizzate le stesse strategie e lo stesso protocollo presentati nello studio sopra menzionato. Di conseguenza, è stata ottenuta una maggiore espressione e oltre il 95% di proteine pure con una resa di 7,5 mg/L di coltura di cellule di insetto, come mostrato dal risultato del gel SDS-PAGE (Figura 2C).

Ottimizzazione e standardizzazione della qRT-PCR multiplexata
Un test RT-qPCR multiplexato ottimizzato e sviluppato internamente è stato assemblato e prodotto con successo dopo cicli di ottimizzazione della miscela di tamponi e primer per rilevare contemporaneamente tre diversi virus respiratori comuni (Figura 3)37. Il primo kit è stato progettato per colpire il gene N di SARS-CoV-2, l'influenza A H1N1 e H3N2 e il gene dell'influenza B; e il secondo kit è per il gene N di SARS-CoV-2, MERS ORF1a e i geni upE. Pertanto, entrambi i kit sono in grado di rilevare correttamente e simultaneamente tutti e tre i target come il flusso di lavoro presentato qui (Figura 3). I campioni di RNA sintetico di ciascuno dei virus utilizzati in questo protocollo sono stati amplificati, indicando la possibilità di utilizzare un kit multiplexato per il rilevamento dei virus respiratori comuni. La sensibilità di questo test diagnostico è simile ai risultati precedentemente riportati nei campioni dei pazienti. Nei casi in cui i pazienti mostrano sintomi simil-influenzali, l'uso di una RT-qPCR multiplexata in tempo reale ha mostrato risultati comparabili con il test multiplexato SARS-CoV-2, influenza A e influenza B45.

Sensibilità e limite di rilevazione del kit RT-qPCR multiplexato in-house nei confronti dei comuni virus respiratori
L'efficacia del kit multiplexato interno è stata valutata utilizzando due set di miscela di primer e il corrispondente RNA sintetico per ciascun kit, come illustrato nel flusso di lavoro RT-qPCR multiplexato (Figura 3). Utilizzando ciascuna miscela di primer con una diluizione seriale di 10 volte di ciascuna miscela di RNA sintetico compresa tra 10 e 105 copie/μL come modello, la sensibilità, la specificità e il limite di rilevazione di entrambe le RT-qPCR multiplexate sviluppate possono essere determinate utilizzando l'analisi della curva standard. Questo viene fatto in tre repliche indipendenti di ciascun test, per confermare l'efficacia e la coerenza del kit RT-qPCR multiplexato. Di conseguenza, i due kit sviluppati qui possono amplificare con successo tutti e tre i geni bersaglio simultaneamente con un minimo di 10 copie/reazione di RNA, come si vede dalla curva di amplificazione e dal limite di rilevazione (LoD) (Figura 4 e Figura 5). La pendenza e i valori R2 di ciascuna curva sono stati utilizzati per valutare l'efficienza dei singoli saggi (Figura 4 e Figura 5). I valori di R2 hanno fornito una stima della bontà dell'adattamento lineare ai punti dati. In un test qPCR efficiente, R2 dovrebbe essere molto vicino o superiore a 0,90. Le efficienze di amplificazione delle titolazioni di influenza A, influenza B e SARS-CoV-2 o MERS-CoV e SARS-CoV-2 sono state superiori al 99% per tutti i set di primer (Figura 4 e Figura 5). Inoltre, le piccole barre di errore dimostrano la riproducibilità di ogni kit RT-qPCR multiplexato. E' importante notare che entrambi i kit multiplexati non hanno mostrato alcuna formazione di dimero di primer poiché non c'è amplificazione con il controllo negativo (dati non mostrati). Pertanto, la progettazione di entrambi i kit ha amplificato con successo tutti i geni bersaglio con affidabilità, specificità e sensibilità.

Figure 1
Figura 1: Panoramica schematica dell'assemblaggio del kit RT-qPCR multiplexato in un'unica fase. L'assemblaggio del kit inizia con l'espressione e la purificazione degli enzimi necessari, Taq DNA polimerasi e MMLV trascrittasi inversa. Entrambi gli enzimi dovevano essere fatti passare attraverso due colonne, come illustrato. In secondo luogo, dopo la purificazione c'è stata l'ottimizzazione delle condizioni di reazione e il programma di cicli termici che ha portato a condizioni ottimali per il kit di test multiplexato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: I costrutti plasmidici e i risultati di purificazione di His-Taq Pol e C-His/Strep MMLV-RT. (A) Rappresentazione schematica dei plasmidi ricombinanti di espressione di His-Taq Pol e C-His/Strep MMLV-RT. Abbreviazioni: promotore CSPA - promotore della proteina A da shock freddo; RBS - sito di legame dei ribosomi; 6x His - His-tag con sei istidine; TEE - elemento traslazionale; Taq ORF - Cornice di lettura aperta Taq Pol; Polh - promotore di poliedria; MMLV-RT ORF - Telaio di lettura aperto MMLV-RT; TEV - sito di targeting della proteasi del virus dell'incisione; 8x His - His-tag con otto istidine; Streptococco - Strep-tag; polyA - SV40 segnale di poliadenilazione tardiva. (B) Analisi SDS-PAGE di His-Taq Pol espresso in cellule BL21(DE3) di E. coli e Taq polimerasi. (C) Analisi SDS-PAGE di C-His/Strep MMLV-RT purificati espressi nelle cellule Sf9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Diagramma schematico dei due kit RT-qPCR in un'unica fase ottimizzati, standardizzati e sviluppati insieme ai componenti della reazione. Ogni singola reazione multiplexata è composta da dNTP, miscela tampone, miscela enzimatica, miscela primer multiplexata e il modello di RNA sintetico da testare. (A) Influenza A/B, SARS-CoV-2 kit e (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Le curve di amplificazione e il limite di rilevamento per il kit RT-qPCR multiplex one-step per l'influenza A/B e SARS-CoV2. Le curve di amplificazione della RT-qPCR multiplexata sono state condotte utilizzando una miscela di RNA sintetico con diluizioni seriali di 10 volte (da 10 a 105 copie/μL) con tutti i bersagli (A) Influenza A, (C) Influenza B e (E) SARS-CoV-2. Le reazioni sono state effettuate in triplice copia, mostrandone una replicata come esempio. Il limite di rilevamento per (B) Influenza A, (D) Influenza B e (F) SARS-CoV-2 è stato determinato tracciando la media di tre valori Ct replicati rispetto al numero di copie del log. Il coefficiente di determinazione (R2) e l'equazione della curva di regressione lineare sono stati calcolati e mostrati in ciascun pannello. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard tra tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Le curve di amplificazione e il limite di rilevamento per il kit RT-qPCR multiplex one-step MERS ORF1a/upE e SARS-CoV2. Le curve di amplificazione della RT-qPCR multiplexata sono state condotte utilizzando una miscela di RNA sintetico con diluizioni seriali di 10 volte (da 10 a 105 copie/μL) con tutti i bersagli (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE e (E) SARS-Cov-2. Le reazioni sono state effettuate in triplice copia, mostrandone una replicata come esempio. Il limite di rilevamento per (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE e (F) SARS-CoV-2 è stato determinato tracciando la media di tre valori Ct replicati rispetto al numero di copie del log. Il coefficiente di determinazione (R2) e l'equazione della curva di regressione lineare sono stati calcolati e mostrati in ciascun pannello. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard tra tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: L'elenco dei componenti per il tampone di lisi della Taq polimerasi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Tamponi di purificazione della Taq polimerasi. L'elenco dei componenti tampone necessari per la purificazione a due colonne della Taq DNA polimerasi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Tampone di stoccaggio della Taq polimerasi. L'elenco dei componenti tampone necessari per dializzare la Taq DNA polimerasi dopo la purificazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: L'elenco dei componenti per il tampone di lisi MMLV-RT. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Tamponi di purificazione MMLV-RT. L'elenco dei componenti tampone necessari per la purificazione a due colonne di MMLV-RT. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 6: Buffer di archiviazione MMLV-RT. L'elenco dei componenti tampone necessari per la dializzazione di MMLV-RT dopo la purificazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 7: Informazioni su primer e sonde. Le informazioni sulla sequenza dei primer e delle sonde necessarie per ciascuna miscela di primer multiplexata. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Il sistema sanitario di tutto il mondo è gravoso dal pesante onere economico derivante dagli elevati tassi di infezione e mortalità dovuti alla diffusione di virus respiratori comuni come le varianti SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivati dal senso di responsabilità verso l'alleggerimento di questo onere, ci siamo resi conto della necessità di un test diagnostico rapido, preciso e accessibile come la RT-qPCR per distinguere tra questi virus comuni in un unico test. In virtù della natura multiplexata della qRT-PCR, è possibile diagnosticare e distinguere SARS-CoV-2 da altri virus respiratori, come i virus dell'influenza A/B e MERS-CoV. Alla fine, è possibile ottenere un trattamento migliore e più preciso dei pazienti utilizzando l'attuale test multiplexato46. Per ricapitolare, questo studio descrive la realizzazione di un test RT-qPCR multiplex one-step in-house che può mirare a due diverse combinazioni. Ogni combinazione è composta da tre diversi virus respiratori per limitare la diffusione di tali virus infettivi e ridurre l'onere economico per il sistema sanitario.

L'attuale kit RT-qPCR multiplexato può colpire due combinazioni di virus respiratori comuni (SARS-CoV-2, Influenza A/B) e (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a). Il protocollo descritto è facile, diretto da seguire e molto più economico dei kit RT-qPCR one-step disponibili in commercio. Un altro vantaggio sono state le proprietà multiplexate del kit che può colpire più bersagli genetici virali utilizzando diverse combinazioni di sonde e primer. Pertanto, la versatilità e la semplicità del kit consentono un'implementazione semplice in ambienti con risorse limitate. Inoltre, il kit è adatto per test approfonditi che consentono una diagnosi accurata e precisa che può aiutare a limitare la diffusione e la co-infezione di più virus respiratori.

Sono stati eseguiti saggi preliminari per garantire che tutti i bersagli fossero amplificati con successo e con alta fedeltà per limitare la formazione di prodotti non specifici. Innanzitutto, abbiamo eseguito diversi cicli di ottimizzazione per i componenti della miscela tampone e le rispettive concentrazioni nella miscela tampone. In secondo luogo, abbiamo ottimizzato i primer e le loro concentrazioni corrispondenti sia nella miscela di primer che nella reazione PCR. In terzo luogo, abbiamo ottimizzato la composizione della miscela enzimatica per massimizzarne l'attività e ridurre al minimo l'effetto inibitorio di MMLV-RT sull'attività della Taq polimerasi47. In quarto luogo, abbiamo ottimizzato le condizioni dei cicli termici tenendo conto dei limiti per la stabilità termica di entrambi gli enzimi. Incorporando i miglioramenti di cui sopra, la versione ottimizzata del nostro kit RT-qPCR multiplexato qui presentato è stata in grado di rilevare fino a 10 copie/reazioni di RNA con elevata specificità, sensibilità e riproducibilità.

Alcune precauzioni devono essere prese in considerazione per garantire l'elevata efficienza e il successo dell'implementazione del test RT-qPCR multiplex, per prevenire gli inibitori ed evitare errori di pipettaggio. Poiché ogni struttura è unica nella sua configurazione e strumentazione, ecco alcuni passaggi che potrebbero aiutare durante la costruzione di un kit di questo tipo: in primo luogo, i guanti devono essere indossati in ogni momento per evitare la presenza di qualsiasi contaminazione e inibitore della PCR. In secondo luogo, assicurati di utilizzare puntali con filtro resistenti agli aerosol e di utilizzare una pipetta calibrata. Inoltre, assicurati di utilizzare acqua di grado PCR. L'uso del controllo senza modello aiuterà a verificare la presenza di eventuali contaminazioni. È importante notare che la master mix deve essere preparata per tutte le repliche per evitare possibili contaminazioni e variazioni di pipettaggio. Altri suggerimenti per la risoluzione dei problemi devono essere presi in considerazione per mantenere la qualità della sonda, come aliquotare il materiale ed evitare l'uso di acqua per diluirlo. È importante seguire le raccomandazioni del produttore sulla conservazione e la diluizione del primer e della sonda utilizzati. Pertanto, questi semplici suggerimenti aiuteranno a mantenere il successo del test RT-qPCR multiplex e a garantirne l'elevata efficienza.

Sebbene i saggi RT-qPCR multiplexati sviluppati in questa ricerca abbiano mostrato buoni risultati quando testati con gli RNA virali sintetici, la sua efficacia in un contesto clinico reale deve ancora essere valutata e convalidata. Sfortunatamente, la scarsità di campioni clinici rende difficile determinare le specificità e la sensibilità del test per i virus inclusi in questa indagine. Tuttavia, vale la pena ricordare che il LOD (limite di rilevamento), che indica il numero minimo di copie che possono essere rilevate nel 100% dei campioni, è stato stabilito attraverso una regressione lineare statisticamente provata. Questo fornisce un potenziale per la diagnosi clinica ed è un risultato importante della ricerca.

In questo studio è stato sviluppato con successo un test RT-qPCR multiplex one-step basato su sonda, che ha dimostrato un'elevata efficacia. Il SARS-CoV-2 può essere facilmente rilevato e distinto da altri virus respiratori comuni, come spiegato sopra, con elevata efficienza e affidabilità in una sola provetta. Pertanto, la dipendenza da questa funzione multiplexata contribuirà ad aumentare la produttività della diagnosi e a risparmiare tempo, costi e campioni rispetto ad altri approcci di test e PCR singleplex. Tutto sommato, la possibilità che i virus respiratori circolino insieme è elevata e questa RT-qPCR multiplex in un'unica fase sarà molto vantaggiosa.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla King Abdullah University of Science and Technology attraverso il finanziamento di base e il National Term Grand Challenge (NTGC) a SMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Questo mese in JoVE numero 201 Taq polimerasi MMLV-RT espressione proteica COVID-19 SARS-CoV-2 influenza A/B MERS-CoV RT-qPCR multiplex
Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV
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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

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