Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

Abstract

Het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt, vormt een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in het algemeen. Tijdens griepseizoenen kan de verspreiding van SARS-CoV-2 en andere respiratoire virussen een bevolkingsbrede last van luchtwegaandoeningen veroorzaken die moeilijk te beheersen is. Daarvoor zullen de respiratoire virussen SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) in de komende herfst- en winterseizoenen zorgvuldig in de gaten moeten worden gehouden, met name in het geval van SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B, die vergelijkbare epidemiologische factoren delen, zoals vatbare populaties, wijze van overdracht en klinische syndromen. Zonder doelwitspecifieke tests kan het een uitdaging zijn om onderscheid te maken tussen gevallen van deze virussen vanwege hun overeenkomsten. Dienovereenkomstig zal een gevoelige en gerichte multiplextest die gemakkelijk onderscheid kan maken tussen deze virale doelwitten nuttig zijn voor beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg. In deze studie ontwikkelden we een real-time reverse transcriptase-PCR-gebaseerde assay met behulp van een in-house ontwikkelde R3T eenstaps RT-qPCR-kit voor gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV. Met slechts 10 kopieën van hun synthetische RNA's kunnen we met succes SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en MERS-CoV-doelen tegelijkertijd identificeren met 100% specificiteit. Deze test blijkt nauwkeurig, betrouwbaar, eenvoudig, gevoelig en specifiek te zijn. De ontwikkelde methode kan worden gebruikt als een geoptimaliseerde SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostische test in ziekenhuizen, medische centra en diagnostische laboratoria, evenals voor onderzoeksdoeleinden.

Introduction

De pandemie van de aanhoudende coronavirusziekte 2019 (COVID-19) wordt veroorzaakt door het nieuwe coronavirus dat bekend staat als het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Vanwege de sterke besmettelijkheid van SAR-CoV-2 en het vermogen tot snelle overdracht, ontstond de COVID-19-pandemie in Wuhan City, China, en verspreidde zich snel over de hele wereld. Dit leidde uiteindelijk tot het begin van tekenen van ademnood en zelfs de dood 2,3,4. COVID-19 is in meer dan 213 landen uitgeroepen tot pandemie, waarbij een sterke toename van het aantal bevestigde gevallen wordt verwacht, zoals blijkt uit de artikelen die door verschillende onderzoeken zijn gepubliceerd 3,5. COVID-19 wordt voornamelijk overgedragen door kleine ademhalingsdruppeltjes die geïnfecteerde personen in het milieu afgeven en vervolgens worden blootgesteld aan kwetsbare personen door inademing of nauw contact met besmette oppervlakken. Wanneer deze druppeltjes in contact komen met het slijmvlies van de ogen, mond of neus, kan een persoon besmet raken6. Uit statistieken van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) blijkt dat er wereldwijd meer dan 76 miljoen bevestigde gevallen van de pandemie zijn geweest, met maar liefst 7 miljoen doden7. Zo classificeerden de Verenigde Naties de pandemie veroorzaakt door de ziekte COVID-19 als een ramp vanwege de directe impact op het leven van miljarden mensen over de hele wereld en had verstrekkende economische, ecologische en sociale gevolgen.

Initiatieven op het gebied van de volksgezondheid, waaronder grondige tests, vroege opsporing, contactopsporing en isolatie van gevallen, blijken allemaal cruciaal te zijn om deze pandemie onder controle te houden 8,9,10,11. De wintermaanden zullen de circulatie van andere respiratoire virussen zoals Influenza A en B met COVID-19-achtige symptomen verhogen, waardoor het moeilijk wordt om COVID-19-gevallen in een vroeg stadium te identificeren, op te sporen en te isoleren. Elk jaar begint de uitbraak van influenza A en B in de late herfst of begin januari met een voorspelbare seizoensgebondenheid12. Talrijke epidemiologische kenmerken worden gedeeld door SARS-CoV-2- en influenzavirussen. Bovendien delen ze overeenkomsten in de vatbare populaties, waaronder kinderen, ouderen, immuungecompromitteerden en personen met chronische comorbiditeiten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, hart- en nierfalen of diabetes12,13. Deze virussen delen niet alleen kwetsbare populaties, maar ook transmissieroutes van contact en ademhalingsdruppeltjes14. Verwacht wordt dat patiënten waarschijnlijk meer dan één van deze respiratoire virussen kunnen oplopen naarmate het griepseizoennadert 14. Daarvoor moet de screening van SARS-CoV-2 en de influenzavirussen worden uitgevoerd op symptomatische patiënten voordat ze worden geïsoleerd. Het uitvoeren van afzonderlijke tests voor de drie virussen (SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B) is niet mogelijk vanwege het wereldwijde gebrek aan middelen voor nucleïnezuurextractie en diagnostiek. Om ze allemaal in één reactie te screenen, moet een methode of test worden ontwikkeld.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is een familielid van het menselijke coronavirus (CoV). De eerste isolaten van het MERS-CoV-virus waren afkomstig van een gehospitaliseerde patiënt in Saoedi-Arabië die in september 2012 was overleden als gevolg van acute ademhalingsproblemen. Er zijn aanwijzingen dat dromedariskamelen een prominente reservoirgastheer voor MERS-CoV zijn. Het is bewezen dat virussen van geïnfecteerde dromedariskamelen zoönotisch zijn en dus mensen kunnen infecteren16,17. Mensen die met dit virus zijn besmet, kunnen het via nauw contact naar anderen verspreiden18. Op 26 januari 2018 waren er 2143 laboratoriumbevestigde gevallen van MERS-CoV-infectie, waaronder 750 sterfgevallen wereldwijd. De meest typische MERS-CoV-symptomen zijn hoesten, koorts en kortademigheid. Er is ook gemeld dat MERS-CoV-infecties symptomen van longontsteking, diarree en gastro-intestinale misselijkheid vertonen20. Momenteel is er geen commercieel vaccin of specifieke behandeling voor MERS-CoV beschikbaar. Daarom is een snelle en nauwkeurige diagnose essentieel om de wijdverbreide MERS-CoV-uitbraken te voorkomen en MERS-CoV te onderscheiden van de ziekte SARS-CoV-2.

Tot op heden zijn er veel benaderingen voorgesteld om deze virussen te detecteren, zoals multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 en CRISPR/Cas329, laterale flow-immunoassay30, op papier gebaseerde biomoleculaire sensoren31, SHERLOCK-testen in één pot32, DNA-aptameer 33, lusgemedieerde isotherme versterking (LAMP)19,34, enz. Elk van de bovengenoemde methoden heeft unieke voor- en nadelen op het gebied van gevoeligheid en specificiteit. Van deze methoden is de op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde test: multiplex qRT-PCR, de meest voorkomende en wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en MERS-CoV.

In deze studie hebben we verschillende primercombinaties en sondes ontworpen en beoordeeld voor de effectieve, nauwkeurige en gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV met behulp van standaard twist synthetische virale RNA's. De gemultiplexte tests die zijn ontwikkeld voor MERS-CoV- of SARS-CoV-2-doelgenen worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze genen coderen over het algemeen voor eiwitten en complexen die bijdragen aan de vorming van een replicatie/transcriptiecomplex (RTC)35, zoals het gebied binnen het open leesframe 1a (ORF1a) dat wordt gebruikt voor de MERS-CoV-test. Bovendien worden structurele eiwitten gecodeerd door de genen die worden gebruikt in diagnostische tests, zoals het stroomopwaartse gebied van het envelopgen (upE) en het nucleocapside-gen (N) die worden gebruikt voor respectievelijk MERS-CoV- en SARS-Cov-2-assays35,36. We gebruikten de interne R3T eenstaps RT-qPCR-kit om de RT-qPCR voor de detectie van virussen vast te stellen37. Virusdetectie, gevoeligheid, specificiteit en dynamisch bereik van onze R3T one-step RT-qPCR kit en primersets werden getest en geëvalueerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard twist synthetische RNA's. De laagste praktische detectielimiet was ongeveer 10 transcriptiekopieën per reactie. Als gevolg hiervan kunnen de interne R3T-eenstaps RT-qPCR-kit en primer-/sondesets met succes worden gebruikt en geïmplementeerd voor routinematige gelijktijdige diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Taq-polymerase-expressie en -zuivering

  1. Construeer een plasmide met een splitsbare hexa-histidine-tag aan de C-terminus van het enzym.
  2. Transformeer 50 ng van de expressievector in E. coli BL21-(DE3)-stam volgens het standaardprotocol38.
  3. Inoculeer de getransformeerde cellen in vier kolven van 6 l met elk 2 l 2YT-mediabouillon bij 37 °C en schud bij 170 omw/min totdat de OD 600 van 0,8 of celnummer 6,4 x10,8 is bereikt.
  4. Induceer Taq-polymerase-expressie met 0,5 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) en incubeer verder bij 16 °C gedurende 18 uur met schudden.
  5. Oogst de cellen door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 4 °C bij 7808 x g . Resuspendeer de pellets in 200 ml ijskoude Taq-polymeraselysisbuffer (tabel 1) in 5 ml/g celpellet.
  6. Incubeer de cellen met lysozym (2 mg/ml lysisbuffer) en proteaseremmers gedurende 45 minuten en laat het lysaat vervolgens door een celverstoorder bij 30 kPsi lopen en centrifugeer bij 22.040 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om het celafval te scheiden.
  7. Verwarm het supernatans gedurende 15 minuten op 85 °C. Centrifugeren bij 95.834 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Vang het supernatans op en filtreer het op ijs met een filter van 0,45 μm.
  8. Voer eiwitzuivering uit met behulp van Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) door het monster eerst door een Ni-NTA HP 5 ml-kolom te halen met een stroomsnelheid van 4 ml/min met behulp van Taq-polymerasebuffer A (tabel 2; Figuur 1A).
  9. Wassen met 10 kolomvolumes (CV) Taq-polymerasebuffer A en 4% Taq-polymerasebuffer B (tabel 2). Elueer het gebonden eiwit met een lineaire gradiënt met behulp van Taq-polymerasebuffer B over 20 CV in een fles van 100 ml.
  10. Laat het eluent in de fles van 100 ml door een kationenuitwisselingskolom van 5 ml lopen met een snelheid van 4 ml/min met behulp van Taq-polymerasebuffer C (tabel 2; Figuur 1A).
  11. Wassen met 20 CV 100% Taq-polymerasebuffer C en 5% Taq-polymerasebuffer D (tabel 2).
  12. Elute met een lineaire gradiënt met behulp van Taq-polymerasebuffer D (tabel 2) vanaf 5% tot 100%.
  13. Controleer de geëlueerde fracties door SDS-PAGE-gelelektroforese 39 uit te voeren, gevolgd door gelkleuring 40 zoals eerder beschreven. Neem in het kort 10 μL van elke fractie en voeg een gelijk volume van 2x SDS-laadkleurstof toe. Denatureer het monster bij 90°C gedurende 10 min. Laad de monsters op 10% SDS-PAGE gel en laat de gel 25 minuten draaien op 200 V. Kleur de gel met Coomassie Brilliant Blue en verwijder vervolgens de vlek.
  14. Verzamel alle fracties die gezuiverd Taq-polymerase bevatten en dialyseer tegen de taq-polymerase-opslagbuffer (tabel 3) bij 4 °C. Bereid kort 2 L van de opslagbuffer voor en dompel de dialysecassette 2 minuten onder in de buffer om te hydrateren. Injecteer de opgevangen fracties met een naald in de dialysecassette en laat deze een nacht in de dialysebuffer bij 200 toeren per minuut op de roerder staan.
  15. Meet na dialyse de eiwitconcentratie met behulp van een spectrofotometer, maak aliquots van 10 μL, vries vast in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    NOTITIE: Filter alle buffers voor zuivering met behulp van een filter van 0.45 μm voordat u ze in het FPLC-systeem laadt.

2. MMLV-RT-expressie in het expressiesysteem en de zuivering van insectencellen

  1. Bacmid-DNA-generatie en -isolatie
    1. Kloon de sequentie van MMLV-RT met een C-terminus splitsbare TEV-8xHis-Strep tag zoals eerder beschreven41.
    2. Meng 100 ng van de expressievector in 50 μL DH10Bac-cellen en meng voorzichtig door op de buis te tikken.
    3. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten op ijs. Geef de cellen een hitteschok gedurende 1 minuut bij 42 °C.
    4. Breng onmiddellijk over op ijs en voeg 400 μL SOC-medium toe. Incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 4 uur.
    5. plaat 10 μl en 15 μl van het mengsel op LB Agar-platen met drie antibiotica; 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline en 7 μg/ml gentamicine samen met 40 μg/ml IPTG en 100 μg/ml X-Gal voor blauw-witte selectie.
    6. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 °C. Kies verschillende witte kolonies en één blauwe kolonie als controle en streep ze opnieuw op verse LB-agarplaten met de bovenstaande antibiotica. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
    7. Nadat je het witte fenotype hebt bevestigd, kies je een paar kolonies en inoculeer je ze in 10 ml LB-media met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline en 7 μg/ml gentamicine in buisjes van 50 ml.
    8. Incubeer de cultuur bij 37 °C en schud gedurende een nacht bij 170 tpm. Pellet de cellen door ze gedurende 10 minuten op 22.040 x g te draaien.
    9. Decanteer het supernatans en resuspendeer de pellet in 250 μL resuspensieoplossing uit de miniprep-kit (deze oplossing moet worden behandeld in overeenstemming met de instructies van de fabrikant) en breng de oplossing vervolgens over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    10. Voeg 250 μL lysisoplossing toe, meng voorzichtig en incubeer gedurende 3 minuten. Voeg 350 μL neutraliserende oplossing toe, keer 2x-3x om en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 22.040 x g .
    11. Breng het supernatans over in een verse tube en voeg een gelijk volume ijskoude isopropanol toe en incubeer gedurende 30 minuten bij -20 °C.
    12. Pellet het neergeslagen DNA door gedurende 10 minuten te draaien op 22.040 x g . Gooi het supernatans weg en was de pellet met 700 μL 70% ijskoude ethanol, 2x.
    13. Verwijder het supernatans met een pipet zonder de pellet aan te raken. Laat de pellet 5-10 minuten aan de lucht drogen in de laminaire stroomkap of totdat er geen vloeistof meer in de buis te zien is. Los de pellet op in 100 μL EB-buffer.
  2. Bacmidetransfectie en virusamplificatie
    1. P1 virus voorbereiding
      1. In een weefselkweekplaat met 6 putjes, zaad ~ 9 x 105 cellen/putje in 2 ml insectencelkweekmedium.
      2. Incubeer de plaat gedurende ~30 minuten bij kamertemperatuur zodat de cellen zich kunnen hechten.
      3. Bereid het bacmide/fugene-mengsel als volgt: meng 1 μg bacmide-DNA en 300 μl insectencelmedia in één buisje. Meng in een ander buisje 8 μL transfectiereagens en 300 μL insectencelmedia. Meng beide mengsels door voorzichtig te pipetteren en laat ~30 minuten bij kamertemperatuur staan om het bacmide/transfectiereagenscomplex te vormen.
      4. Voeg druppelsgewijs een bacmidecomplexmengsel (~210 μL) toe aan elk putje en sluit de plaat af met een transparante film.
      5. Incubeer de plaat 3-4 dagen bij 27 °C.
      6. Neem het medium dat het virus bevat, voeg FBS (eindconcentratie 2%) toe, filtreer met een 0,45 μm filter en bewaar bij 4°C in het donker als P1-virusvoorraad.
    2. P2-virus voorbereiding
      1. Transfecteer 50 ml insectencellen bij 2 x 106 cellen/ml met 3 ml P1-virus in een kweekkolf.
      2. Incubeer bij 27 °C met schudden bij 100 tpm gedurende 4-6 dagen tot het percentage dode cellen 25%-30% bereikt.
      3. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g en vang het supernatans op dat het virus bevat.
      4. Voeg FBS toe tot een eindconcentratie van 2%, filtreer door een filter van 0,45 μm en aliquot elk 1 ml en bewaar bij -80 °C als P2-virusvoorraad.
    3. P3 virus voorbereiding
      1. Transfecteer 100 ml insectencellen bij 2 x 106 cellen/ml met de 2 ml P2-virus in een kweekkolf.
      2. Incubeer bij 27 °C met schudden bij 100 tpm gedurende 3-4 dagen tot het percentage dode cellen 15%-20% bereikt.
      3. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g en verzamel het supernatans dat het virus bevat.
      4. Voeg FBS toe tot een eindconcentratie van 2%. Filtreer door een filter van 0,45 μm. Het kan 1 maand in het donker bij 4 °C worden bewaard.
  3. Expressie en zuivering van MMLV-RT in insectencellen
    1. Voeg 5 ml P3-virus toe aan verse insectencellen met een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml (700 ml/2 l kolf) in totaal 6 kolven.
    2. Oogst de cellen na 55-60 uur posttransfectie door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren op 7808 x g.
    3. Resuspendeer de celpellets in 200 ml MMLV-RT lysisbuffer (tabel 4). Haal het lysaat door een celverstoorder bij 15 kPsi en centrifugeer bij 22.040 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    4. Breng het supernatans over in nieuwe buizen en centrifugeer het opnieuw bij 95.834 x g bij 4 °C gedurende 1 uur. Vang het supernatans op en filtreer het op ijs met behulp van een filter van 0,45 μm.
    5. Start de eiwitzuivering met behulp van FPLC door het monster eerst door de Ni-NTA Excel 5 ml-kolom (Figuur 1B) te halen met een stroomsnelheid van 4 ml/min met behulp van MMLV-RT-buffer A (tabel 5).
    6. Was de kolom met 10 CV MMLV-RT buffer A en 4% MMLV-RT buffer B (tabel 5) en elueer het eiwit met de lineaire gradiënt van MMLV-RT buffer B over 20 CV in een fles van 100 ml.
    7. Haal het geëlueerde monster door de Strep 5 ml-kolom (Figuur 1B) in evenwicht met MMLV-RT-buffer C (tabel 5).
    8. Was de kolom met 10 CV 100% MMLV-RT buffer C en eluer het eiwit met een lineaire gradiënt met 20 CV buffer D (Tabel 5).
    9. Controleer de geëlueerde breuken door SDS-PAGE uit te voeren zoals gedaan in stap 1.13.-1.14. en verzamel de fracties die gezuiverd MMLV-RT bevatten om bij 4 °C te worden gedialyseerd tegen de MMLV-RT-opslagbuffer (tabel 6).
    10. Meet de eiwitconcentratie met behulp van Nanodrop, aliquot, snap freeze in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
      NOTITIE: Filter alle buffers voor zuivering met behulp van een filter van 0.45 μm voordat u ze in het FPLC-systeem laadt.

3. Voorbereiding van in-house multiplex R3T one-step RT-qPCR kit componenten

  1. Voorbereiding buffermix
    1. Bereid de 2x-buffer voor op de RT-qPCR-reactie die de eerder in37 getoonde reagentia bevat. Bereid alle reagentia in DNase/RNase-vrij water en het buffermengsel in een vriezer van -20 °C.
  2. Primer en sonde Sets en primers mengselvoorbereiding
    OPMERKING: De gebruikte sondes en primers staan vermeld in tabel 7. De Influenza en SARS-CoV-2 multiplexed kit bevat 3 sondes en 4 voorwaartse en achterwaartse primersets. De sondes zijn aan de 5′-uiteinden gelabeld met reporters 6-carboxyfluoresceïne (FAM) voor InfA, Texas Red-XN voor SARS-CoV-2 (N-gen) en Yakima Yellow voor InfB. De MERS-CoV en SARS-CoV-2 multiplexed kit bevat 3 sondes en 3 voorwaartse en achterwaartse primersets. De sondes zijn ook gelabeld aan de 5′-uiteinden met behulp van reporters Texas Red-XN voor MERS-CoV (ORF1a-gen), VIC voor MERS-CoV (UpE-gen) en 6-carboxyfluoresceïne (FAM) SARS-CoV-2 (N-gen).
    1. Maak een primermengsel met alle primers en sondes vermeld in tabel 7 met een eindconcentratie van 6,7 μM voor elke voorwaartse en achterwaartse primer en 1,25 μM voor elke sonde in een buis van 1,5 ml. Bewaar de primermix in de vriezer van -20 °C. Gebruik elutiebuffer om het vereiste volume aan te vullen.
  3. Bereiding van enzymenmix
    1. Bereid Taq-polymerase (30 E/μL) en MMLV-RT (60 ng/μL) enzymmengsel in de Taq-polymeraseopslagbuffer zoals weergegeven in tabel 3 om het vereiste volume te vormen. Voer deze stap uit op ijs en bewaar het enzymmengsel bij -20 °C.
  4. RNA-sjabloon
    1. Resuspendeer synthetische RNA's van SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B en MERS-CoV afzonderlijk in 100 μL 1x Tris-EDTA-buffer (10 mM Tri-Cl en 1 mM EDTA (pH 8,0) om een voorraad van 1 x 106 RNA-kopieën/μL te maken.
    2. Meng synthetische RNA's voor RT-qPCR in de volgende configuraties: 1) SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B door 5 μL van elke virusvoorraad toe te voegen aan het volume van 50 μL om 1 x 105 RNA-kopieën/μL te maken; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV door 5 μL van elke virusvoorraad toe te voegen aan een volume van 50 μL om 1 x 105 RNA-kopieën/μL te maken. Maak 10-voudige seriële verdunningen van elk synthetisch RNA-mengsel, variërend van 1 x 105 RNA-kopieën/μL tot 10 RNA-kopieën/μL.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u ijskoud DNase/RNase-vrij water gebruikt om de seriële verdunning van de sjablonen voor te bereiden.

4. Interne gemultiplexte SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en SARS-CoV-2-, MERS-CoV-eenstaps RT-qPCR-test

OPMERKING: Desinfecteer de oppervlakken van het werkstation en gebruik een plaatsjabloon met 96 putjes om de lay-out van de PCR-plaat te plannen.

  1. Bereiding van een plaat met 96 putjes
    1. Ontdooi 2x buffer en primer mix. Bewaar het enzymmengsel op ijs.
    2. Voeg aan elk putje 10 μL 2x buffermix, 1,5 μL van de primermix, 1 μL enzymmix, 6,5 μL DNase/RNasevrij water en 1 μL corresponderend RNA-mengsel toe dat moet worden getest. Het uiteindelijke volume in elk putje is 20 μL. Raadpleeg de voorbereide lay-out voor hulp bij deze stap.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een mastermix te maken op basis van het aantal reacties dat alle reagentia behalve het RNA-monster bevat om pipetteerbias te voorkomen. Voer bovendien de reacties in tweevoud of drievoud uit om technische fouten te voorkomen.
    3. Sluit de plaat af met een zelfklevende PCR-plaatafdichting en centrifugeer kort gedurende 1 minuut om alle vloeistof op de bodem van de plaat op te vangen. Zorg ervoor dat elk putje hetzelfde vloeistofvolume heeft en vrij is van luchtbellen voordat u de monsters overbrengt naar de qPCR-machine.
      OPMERKING: Alle PCR-reacties moeten op ijs worden ingesteld.
  2. PCR-programma
    1. Open het real-time qPCR-machineprogramma en kies de volgende experimentele eigenschappen:
      Het bloktype: Snel 96-wells (0,1 ml)
      Experimentinstellingen: Standaardcurve
      Reagentia: TaqMan-reagentia
      Eigenschappen uitvoeren: Standaard.
    2. Definieer alle gendoelwitten en hun reporterkleurstof zoals weergegeven in tabel 7. Definieer bovendien monsternamen voor elke te testen reactie om de analyse van de amplificatiecurven te vergemakkelijken.
    3. Wijs doelen en monsters toe aan de plaatlay-out van het programma op basis van de plaat met 96 putjes.
    4. Stel het volgende cyclusprogramma in het PCR-instrument als volgt in:
      55 °C gedurende 10 min
      40 cycli: 94 °C gedurende 1 min
      94 °C gedurende 10 s
      68 °C gedurende 10 s
      68 °C gedurende 20 s; hier fluorescentie verwerven.
    5. Breng de plaat over naar de real-time qPCR-machine en plaats deze in de houder, zorg voor de juiste oriëntatie van de plaat en start de run.
    6. Kies de bestandslocatie om de experimentele gegevens op te slaan.
  3. Data-analyse
    1. Het is essentieel om eerst de amplificatieplots te onderzoeken die door het qPCR-programma worden geproduceerd. Analyseer de detectielimiet om de minimale RNA-concentratie te beoordelen die kan worden gedetecteerd.
    2. Plot het logboek van het RNA-kopienummer op de x-as en de bijbehorende gemiddelde Ct-waarde op de y-as om de gevoeligheid van de test te beoordelen. De helling en de R2 geven de betrouwbaarheid en efficiëntie van de reactie aan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de diagnostische benadering voor het detecteren van veel voorkomende respiratoire virussen met behulp van PCR-benaderingen 21,22,23,24,25. Ondanks deze vooruitgang is de multiplex-benadering, die het mogelijk maakt om meerdere virussen in één test te detecteren, echter niet op grote schaal geïmplementeerd, met name in het RT-qPCR-platform. Deze methode is met succes geïmplementeerd met behulp van synthetische RNA-virussen en interne optimalisatie van reactiecomponenten37. De specificiteit, sensitiviteit en betrouwbaarheid van de diagnostische test werden als hoog beoordeeld door het gebruik van een detectielimietanalyse. De gepresenteerde aanpak zou de efficiëntie en nauwkeurigheid van de diagnose van respiratoire virussen aanzienlijk kunnen verbeteren, waardoor de behoefte aan meerdere tests wordt verminderd en het risico op een verkeerde diagnose wordt geminimaliseerd, zoals in43. Verder onderzoek is nodig om de voordelen van deze aanpak te onderzoeken met behulp van patiëntenmonsters en de acceptatie ervan in de klinische praktijk aan te moedigen.

Expressie en zuivering van Histidine-tagged Taq DNA-polymerase
Op basis van het vastgestelde protocol van Taq-DNA-polymerase-expressie en -zuivering44, werd N-terminaal histidine-gelabeld Taq-DNA-polymeraseplasmide geconstrueerd onder controle van een koudeschokpromotor om het expressie- en zuiveringsproces te vergemakkelijken, zoals hierboven uitgelegd (figuren 1A en figuur 2A). Dus door alleen de IPTG-concentratie en temperatuur te veranderen, kan het expressieniveau van dit nieuwe construct gemakkelijk worden gecontroleerd. Incubatie van cellen die het Taq-DNA-polymeraseplasmide bevatten bij 16°C met 1 mM IPTG toonde een verbeterde expressie van His-Taq-DNA-polymerase. Bovendien vereiste het eerder vastgestelde protocol44 tijdrovende precipitatiestappen van polyethyleenimine (PEI), die kunnen worden overgeslagen met het hier gebruikte construct, aangezien de zuiverheid van het eindproduct niet werd beïnvloed en vergelijkbaar was met in de handel verkrijgbaar Taq-polymerase (Figuur 2B). Het gezuiverde Taq-polymerase migreerde langzamer dan het commerciële polymerase vanwege de aanwezigheid van de linkerpeptiden tussen het enzym en de histidine-tag aan de N-terminus. Taq-DNA-polymerase werd met succes geproduceerd met 0,98 mg/L E. coli-cultuur van puur eiwit.

Expressie en zuivering van dubbele His- en Strep-Tagged MMLV reverse transcriptase
Het baculovirusexpressiesysteem werd gebruikt om MMLV-RT tot expressie te brengen met een C-terminale dubbele He en Strep-tag in insectencellen (Sf9), zoals beschreven in figuur 2A. Een eerdere studie toonde aan dat de C-terminaal gelabelde MMLV-RT een hogere activiteit vertoont waarbij zowel het N-terminaal gelabelde eiwit als het C-terminaal gelabelde eiwit werden gesynthetiseerd in zijderupsen met behulp van het zijderups-baculovirusexpressievectorsysteem (zijderups-BEVS)41. Om een homogeen MMLV-RT-eiwit te produceren, werden dezelfde strategieën en hetzelfde protocol gebruikt als gepresenteerd in de bovengenoemde studie. Als gevolg hiervan werden verbeterde expressie en meer dan 95% zuiver eiwit bereikt met een opbrengst van 7,5 mg/L insectencelkweek, zoals blijkt uit het SDS-PAGE-gelresultaat (Figuur 2C).

Optimalisatie en standaardisatie van de multiplexed qRT-PCR
Een geoptimaliseerde en ontwikkelde in-house gemultiplexte RT-qPCR-test werd geassembleerd en met succes geproduceerd na rondes van buffer- en primermixoptimalisatie om drie verschillende veel voorkomende respiratoire virussen tegelijkertijd te detecteren (Figuur 3)37. De eerste kit is ontworpen om zich te richten op het SARS-CoV-2 N-gen, Influenza A H1N1 en H3N2 en het Influenza B-gen; en de tweede kit is voor SARS-CoV-2 N-gen, MERS ORF1a en upE-genen. Beide kits kunnen dus met succes en tegelijkertijd alle drie de doelen detecteren zoals de hier gepresenteerde workflow (Figuur 3). Synthetisch RNA-monsters van elk van de virussen die in dit protocol worden gebruikt, werden geamplificeerd, wat wijst op de mogelijkheid om een dergelijke multiplexkit te gebruiken voor de detectie van gewone respiratoire virussen. De gevoeligheid van deze diagnostische test is vergelijkbaar met eerder gerapporteerde resultaten in patiëntenmonsters. In gevallen waarin patiënten griepachtige symptomen vertonen, heeft het gebruik van een gemultiplexte real-time RT-qPCR vergelijkbare resultaten opgeleverd als de SARS-CoV-2, influenza A en influenza B multiplexed assay45.

Gevoeligheid en detectielimiet van in-house gemultiplexte RT-qPCR-kit voor veel voorkomende respiratoire virussen
De effectiviteit van de in-house gemultiplexte kit werd beoordeeld met behulp van twee sets primermix en het bijbehorende synthetische RNA voor elke kit, zoals geïllustreerd in de gemultiplexte RT-qPCR-workflow (Figuur 3). Met behulp van elke primermix met 10-voudige seriële verdunning van elke synthetische RNA-mix, variërend van 10 tot 105 kopieën/μL als sjabloon, kunnen de gevoeligheid, specificiteit en de detectielimiet van beide ontwikkelde gemultiplexte RT-qPCR worden bepaald met behulp van standaardcurve-analyse. Dit wordt gedaan in drie onafhankelijke replicaten van elke test, om de werkzaamheid en consistentie van de gemultiplexte RT-qPCR-kit te bevestigen. Als gevolg hiervan kunnen de twee hier ontwikkelde kits met succes alle drie de doelgenen tegelijkertijd amplificeren met slechts 10 RNA-kopieën/reactie, zoals te zien is aan de amplificatiecurve en de detectielimiet (LoD) (Figuur 4 en Figuur 5). De helling en de R2-waarden van elke curve werden gebruikt om de efficiëntie van individuele assays te evalueren (Figuur 4 en Figuur 5). De R2-waarden gaven een schatting van de goedheid van de lineaire fit met de datapunten. In een efficiënte qPCR-test moet R2 zeer dicht bij of groter zijn dan 0,90. De amplificatie-efficiëntie van Influenza A-, Influenza B- en SARS-CoV-2- of MERS-CoV- en SARS-CoV-2-titraties lag boven de 99% voor alle primersets (Figuur 4 en Figuur 5). Bovendien bewijzen de kleine foutbalken de reproduceerbaarheid van elke gemultiplexte RT-qPCR-kit. Het is belangrijk op te merken dat beide gemultiplexte kits geen primerdimeervorming vertoonden, aangezien er geen versterking is met de negatieve controle (gegevens niet getoond). Het ontwerp van beide kits versterkte dus met succes alle doelgenen met betrouwbaarheid, specificiteit en gevoeligheid.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de gemultiplexte eenstaps RT-qPCR-kitassemblage. De assemblage van de kit begint met de expressie en zuivering van de benodigde enzymen, Taq DNA-polymerase en MMLV reverse transcriptase. Beide enzymen moesten door twee kolommen worden geleid, zoals afgebeeld. Ten tweede volgde de zuivering op de optimalisatie van de reactieomstandigheden en het thermische cyclusprogramma, wat resulteerde in optimale omstandigheden voor de gemultiplexte testkit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De plasmideconstructies en de zuiveringsresultaten van His-Taq Pol en C-His/Strep MMLV-RT. (A) Schematische weergave van de recombinante expressieplasmiden His-Taq Pol en C-His/Strep MMLV-RT. Afkortingen: CSPA-promotor - cold-shock proteïne A-promotor; RBS - ribosoombindingsplaats; 6x His - His-tag met zes histidines; TEE - translationeel verbeterend element; Taq ORF - Taq Pol open leeslijst; Polh - veelvlakspromotor; MMLV-RT ORF - MMLV-RT open leesframe; TEV - ets virus protease targeting site; 8x His - His-tag met acht histidines; Streptokokken - Strep-tag; polyA - SV40 laat polyadenylatiesignaal. (B) SDS-PAGE-analyse van His-Taq Pol uitgedrukt in BL21(DE3) E. coli-cellen en Taq-polymerase. (C) SDS-PAGE-analyse van gezuiverd C-His/Strep MMLV-RT tot expressie gebracht in de Sf9-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Schematisch diagram van de twee geoptimaliseerde, gestandaardiseerde en ontwikkelde gemultiplexte eenstaps RT-qPCR-kits samen met de reactiecomponenten. Elke afzonderlijke gemultiplexte reactie is samengesteld uit dNTP's, buffermix, enzymmix, multiplexed primermix en de te testen synthetische RNA-sjabloon. (A) Influenza A/B, SARS-CoV-2-kit en (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: De amplificatiecurven en de detectielimiet voor Influenza A/B en SARS-CoV2 multiplex eenstaps RT-qPCR-kit. De amplificatiecurven van de gemultiplexte RT-qPCR werden uitgevoerd met behulp van een synthetisch RNA-mengsel met 10-voudige seriële verdunningen (10 tot 105 kopieën/μL) met alle doelen (A) Influenza A, (C) Influenza B en (E) SARS-CoV-2. De reacties werden in drievoud uitgevoerd, waarbij één replicaat als voorbeeld werd getoond. De aantoonbaarheidsgrens voor (B) Influenza A, (D) Influenza B en (F) SARS-CoV-2 werd bepaald door het gemiddelde van drie gerepliceerdeC-t-waarden uit te zetten tegen het nummer van de logkopie. De bepalingscoëfficiënt (R2) en de vergelijking van de lineaire regressiecurve werden berekend en in elk paneel weergegeven. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie tussen drie replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: De amplificatiecurven en de limiet van de detectie voor MERS ORF1a/upE en SARS-CoV2 multiplex eenstaps RT-qPCR-kit. De amplificatiecurven van de gemultiplexte RT-qPCR werden uitgevoerd met behulp van een synthetisch RNA-mengsel met 10-voudige seriële verdunningen (10 tot 105 kopieën/μL) met alle doelen (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE en (E) SARS-Cov-2. De reacties werden in drievoud uitgevoerd, waarbij één replicaat als voorbeeld werd getoond. De detectiegrens voor (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE en (F) SARS-CoV-2 werd bepaald door het gemiddelde van drie gerepliceerdeCt-waarden uit te zetten tegen het logkopienummer. De bepalingscoëfficiënt (R2) en de vergelijking van de lineaire regressiecurve werden berekend en in elk paneel weergegeven. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie tussen drie replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: De lijst met componenten voor Taq-polymerase-lysisbuffer. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Taq-polymerasezuiveringsbuffers. De lijst van de buffercomponenten die nodig zijn voor de tweekolomszuivering van Taq-DNA-polymerase. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Taq-polymerase-opslagbuffer. De lijst van de buffercomponenten die nodig zijn om Taq-DNA-polymerase na zuivering te dialyseren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: De lijst met componenten voor MMLV-RT lysisbuffer. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: MMLV-RT zuiveringsbuffers. De lijst van de buffercomponenten die nodig zijn voor de tweekolomszuivering van MMLV-RT. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: MMLV-RT opslagbuffer. De lijst van de buffercomponenten die nodig zijn om MMLV-RT na zuivering te dialyseren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: Informatie over primers en sondes. De sequentie-informatie van de primers en sondes die nodig zijn voor elke gemultiplexte primermix. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er is wereldwijd een zware economische last voor het gezondheidszorgsysteem als gevolg van de hoge infectie- en sterftecijfers als gevolg van de verspreiding van veel voorkomende respiratoire virussen zoals SARS-CoV-2, Influenza A/B en MERS-CoV-varianten 12,19,20. Gemotiveerd door het verantwoordelijkheidsgevoel om deze last te verlichten, realiseerden we ons de noodzaak van een snelle, nauwkeurige en toegankelijke diagnostische test zoals RT-qPCR om deze veel voorkomende virussen in één test te onderscheiden. Op grond van het gemultiplexte karakter van qRT-PCR is het mogelijk om SARS-CoV-2 te diagnosticeren en te onderscheiden van andere respiratoire virussen, zoals Influenza A/B- en MERS-CoV-virussen. Uiteindelijk kan een betere en preciezere behandeling van patiënten worden bereikt met behulp van de huidige multiplexed assay46. Samenvattend beschrijft deze studie de realisatie van een interne eenstaps multiplex RT-qPCR-test die zich op twee verschillende combinaties kan richten. Elke combinatie is samengesteld uit drie verschillende respiratoire virussen om de verspreiding van dergelijke infectieuze virussen te beperken en de economische last voor de gezondheidszorg te verminderen.

De huidige gemultiplexte RT-qPCR-kit kan zich richten op twee combinaties van veel voorkomende respiratoire virussen (SARS-CoV-2, Influenza A/B) en (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a). Het beschreven protocol is eenvoudig, ongecompliceerd te volgen en veel goedkoper dan de in de handel verkrijgbare eenstaps RT-qPCR-kits. Een ander voordeel waren de gemultiplexte eigenschappen van de kit die zich kan richten op meerdere virale genetische doelen door gebruik te maken van verschillende sonde- en primercombinaties. De veelzijdigheid en eenvoud van de kit maken dus een eenvoudige implementatie mogelijk in omgevingen met beperkte middelen. De kit is ook geschikt voor uitgebreide tests, wat resulteert in een nauwkeurige en nauwkeurige diagnose die kan helpen de verspreiding en co-infectie van meerdere respiratoire virussen te beperken.

Voorlopige tests werden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat alle doelen met succes en met hoge betrouwbaarheid werden geamplificeerd om de vorming van niet-specifieke producten te beperken. Eerst hebben we verschillende optimalisatierondes doorlopen voor de componenten van de buffermix en hun respectievelijke concentraties in de buffermix. Ten tweede optimaliseerden we de primers en de bijbehorende concentraties in zowel de primermix als de PCR-reactie. Ten derde hebben we de samenstelling van het enzymmengsel geoptimaliseerd om de activiteit ervan te maximaliseren en het remmende effect van MMLV-RT op de activiteit van Taq-polymerase47 te minimaliseren. Ten vierde hebben we de thermische cyclusomstandigheden geoptimaliseerd, rekening houdend met de beperkingen voor de thermische stabiliteit van beide enzymen. Door de bovengenoemde verbeteringen op te nemen, was de geoptimaliseerde versie van onze hier gepresenteerde gemultiplexte RT-qPCR-kit in staat om tot 10 RNA-kopieën/reacties te detecteren met een hoge specificiteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid.

Er moeten enkele voorzorgsmaatregelen worden overwogen om de hoge efficiëntie en succesvolle implementatie van de multiplex RT-qPCR-test te garanderen, om remmers te voorkomen en pipetteerfouten te voorkomen. Aangezien elke faciliteit uniek is in zijn opzet en instrumentatie, zijn hier enkele stappen die kunnen helpen bij het bouwen van een dergelijke kit: ten eerste moeten te allen tijde handschoenen worden gedragen om de aanwezigheid van besmetting en PCR-remmers te voorkomen. Ten tweede, zorg ervoor dat u aërosolbestendige filtertips gebruikt en gebruik een gekalibreerde pipet. Zorg er daarnaast voor dat u water van PCR-kwaliteit gebruikt. Het gebruik van no-template controle zal helpen bij het verifiëren van de aanwezigheid van eventuele besmetting. Het is belangrijk op te merken dat de mastermix moet worden voorbereid voor alle replicaten om mogelijke contaminatie en pipetteervariatie te voorkomen. Andere tips voor het oplossen van problemen moeten worden overwogen om de kwaliteit van de sonde te behouden, zoals het aliquoteren van de voorraad en het vermijden van het gebruik van water om deze te verdunnen. Het is belangrijk om de aanbevelingen van de fabrikant op te volgen voor het bewaren en verdunnen van de gebruikte primer en sonde. Deze eenvoudige tips zullen dus helpen om het succes van de multiplex RT-qPCR-test te behouden en de hoge efficiëntie ervan te garanderen.

Hoewel de gemultiplexte RT-qPCR-assays die in dit onderzoek zijn ontwikkeld, goede resultaten hebben opgeleverd bij het testen met de synthetische virale RNA's, moet de effectiviteit ervan in een echte klinische setting nog worden geëvalueerd en gevalideerd. Helaas maakt de schaarste aan klinische monsters het moeilijk om de specifieke kenmerken en gevoeligheid van de test voor de virussen die in dit onderzoek zijn opgenomen, te bepalen. Het is echter vermeldenswaard dat de LOD (detectielimiet), die het minimum aantal kopieën aangeeft dat in 100% van de monsters kan worden gedetecteerd, is vastgesteld door middel van een statistisch bewezen lineaire regressie. Dit biedt mogelijkheden voor klinische diagnose en is een belangrijke bevinding van het onderzoek.

Een in-house multiplex eenstaps RT-qPCR-test die op sondes is gebaseerd, werd in deze studie met succes ontwikkeld en gevalideerd met een hoge werkzaamheid. SARS-CoV-2 kan gemakkelijk worden gedetecteerd en onderscheiden van andere veel voorkomende respiratoire virussen, zoals hierboven uitgelegd, met een hoge efficiëntie en betrouwbaarheid in slechts één reageerbuis. De afhankelijkheid van deze gemultiplexte functie zal dus helpen bij het verhogen van de doorvoer van de diagnose en tijd, kosten en monsters besparen in vergelijking met andere testbenaderingen en singleplex PCR. Al met al is de kans groot dat respiratoire virussen samen circuleren en deze multiplex eenstaps RT-qPCR zal zeer voordelig zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology door middel van kernfinanciering en de National Term Grand Challenge (NTGC) aan SMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

Deze maand in JoVE Taq-polymerase MMLV-RT eiwitexpressie COVID-19 SARS-CoV-2 Influenza A/B MERS-CoV multiplex RT-qPCR
Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter