Изучение вариантов жизненного цикла: использование температуры и типа субстрата в качестве взаимодействующих факторов для предпочтений личинок и самок мух

Summary

В данной работе подробно описаны два протокола оценки предпочтений в отношении источников пищи и яйцекладок у личинок и самок мух. Они включают в себя четыре варианта с двумя взаимодействующими факторами: типом субстрата и температурой. Анализы позволяют определить предпочтительный источник пищи для личинок и предпочтительное место для яйцекладки для самок.

Abstract

Мухи (Diptera: Calliphoridae) представляют широкий спектр образа жизни личинок, обычно классифицируемых как облигатный паразитизм, факультативный паразитизм и полная сапронекрофагия. Некоторые виды паразитов, как облигатные, так и факультативные, считаются имеющими санитарное и хозяйственное значение, так как их личинки могут вызывать миаз (заражение живых тканей личинками). Однако примечательно, что решающую роль при выборе места яйцекладки играет взрослая самка, а, следовательно, во многом определяет характер питания и условия развития личинок. В данном исследовании предложены два протокола для проверки предпочтений кормления личинок и предпочтений самки по месту откладки яиц с учетом двух взаимодействующих факторов: типа мясного субстрата и температуры. Представленные здесь установки позволили протестировать личинок Lucilia cuprina и самок гравида в четырехвариантном анализе с двумя температурами (33 ± 2 °C и 25 ± 2 °C) и двумя типами мясных субстратов (свежее мясо с добавлением крови и 5-дневное тухлое мясо). Личинки или гравидные самки могут закапывать или откладывать яйца, соответственно, в одном из следующих способов: тухлое мясо при 25 °C (имитация состояния некрофагов), свежее мясо с добавлением крови при 33 °C (имитация состояния паразитических видов) и две контрольные группы, тухлое мясо при 33 °C или свежее мясо с кровью при 25 °C. Предпочтение оценивается путем подсчета количества личинок или яиц, отложенных в каждом варианте для каждого репликанта. Сравнение наблюдаемых результатов со случайным распределением позволило оценить статистическую значимость предпочтения. Результаты показали, что личинки L. cuprina отдают предпочтение перепревшему субстрату при температуре 25 °C. И наоборот, предпочтения самок к месту откладки яиц были более разнообразными в зависимости от типа мяса. Эта методика может быть адаптирована для проверки предпочтений других видов насекомых аналогичного размера. Другие вопросы также могут быть исследованы с помощью альтернативных условий.

Introduction

Мухи, особенно мускоидные калиптраты (в том числе светлячки, домашние мухи, мухи-боты и мясные мухи), демонстрируют широкий спектр образа жизни, включая паразитическое и некро-сапрофагическое^{поведение.} Паразитические виды, как правило, вызывают миаз — заражение живых тканей личинками2^. В семействе Calliphoridae как облигатные, так и факультативные паразитические виды являются основными вредителями домашнего скота, ответственными за экономические потери и плохое самочувствие животных из-за заражения личинками 2,3,4,5,6,7. Облигатные паразиты, такие как черви Нового и Старого Света (Cochliomyia hominivorax и Chrysomyia bezziana, соответственно), особенно опасны 4,7,8,9,10 наряду с факультативными паразитами, такими как овечьи мухи (Lucilia cuprina и Lucilia sericata)^{2,5,6, 7}. См. Непаразитические виды, в том числе сапронекрофаги, развиваются в разлагающемся и некротизированном органическом веществе и обычно встречаются в антисанитарных условиях. Их строго непаразитарный образ жизни может быть успешно использован для терапии личинок, которая использует личинки мух для очистки ран от некротических тканей^11,12,13. Мухи также используются в криминалистике, поскольку они являются одними из первых организмов, которые обнаруживают и колонизируют недавно умершие тела, а развивающиеся личинки служат средством оценки^{времени смерти.}

Образ жизни мух был предметом различных исследований (например, ¹⁵, 16, ¹⁷, ¹⁸, ¹⁹, ^{20, 21}) из-за их значимости по отношению к интересам человека. Понимание биологических механизмов, управляющих образом жизни вида, может дать ценную информацию об улучшении методов, направленных на борьбу с видами вредителей. Кроме того, разнообразие и эволюция образа жизни мух создают идеальный контекст для изучения происхождения и механизмов сложных признаков (например, паразитизма). Паразитизм, обусловленный личинками, питающимися живыми тканями, несколько раз эволюционировал независимо в пределах семейства Calliphoridae^22,23. Тем не менее, эволюционная история пищевых привычек мух до сих пор в значительной степени неизвестна, и исследования ограничиваются картированием привычек по филогенезу (например, ^16,19,22) без помощи функциональных анализов. Например, неясно, произошли ли облигатные паразиты от универсалов (т.е. факультативных паразитов) или непосредственно от некрофагов. Молекулярные, физиологические и поведенческие процессы, сопровождающие эволюционные сдвиги в образе жизни, также в значительной степени неизвестны.

В этом контексте факультативные паразиты, такие как овечья муха Lucilia cuprina, которые могут развиваться как паразиты на хозяине или как некрофаги на трупах, дают возможность изучить факторы и механизмы, контролирующие выбор образа жизни. Lucilia cuprina – космополитичный вид, известный тем, что вызывает овечью муху, особенно в Австралии, где она считается вредителем ^3,16. Миаз, вызванный L. cuprina, также может возникать у других домашних животных, домашних животных и человека 3,24,25,26,27,28,29,30. Тем не менее, его личинки также могут развиваться в некротических тканях и разлагающемся веществе, и этот вид успешно используется в судебной энтомологии, поскольку он очень быстро находит и колонизирует трупы^31,32,33,34. Несмотря на то, что паразитический и непаразитический образ жизни мух определяется личиночной стадией, место яйцекладки выбирает взрослая самка. Следовательно, взрослая самка сильно влияет на образ жизни личинок, так как последние имеют ограниченную подвижность. Однако выбор самки не обязательно означает, что личинки предпочтут тот же субстрат, когда им будет предоставлен выбор³⁵. Одна из гипотез заключается в том, что поведенческие изменения, приводящие к тому, что самки откладывают яйца на живые ткани, могли быть частью раннего перехода к паразитическому образу жизни. Предадаптация или физиологические возможности образовавшихся личинок были необходимы для их успешного развития на живой ткани, что привело бы к возникновению паразитического образа жизни. Таким образом, затронутые и отобранные процессы могут не совпадать между обоими жизненными стадиями.

В связи с этим были разработаны два метода для проверки поведенческих предпочтений у мух, в частности, у L. cuprina, в отношении субстрата питания личинок (анализ предпочтений личинок) и места яйцекладки (анализ предпочтений самок). Эти методы учитывают два взаимодействующих фактора: температуру и свежесть мяса. Температура была выбрана в качестве решающего фактора, поскольку большинство случаев миаза встречается у гомеотермических животных². Таким образом, температура 33 °C была выбрана в качестве показателя «паразитарного фактора образа жизни», в то время как температура 25 °C (комнатная температура) представляет собой «непаразитарный фактор». Была выбрана температура 25 °C, поскольку она является репрезентативной для среднегодовой температуры, зарегистрированной в Бразилии (Национальный институт метеорологии, INMET). Кроме того, были рассмотрены два типа мясных субстратов, оба из коровьих источников: (i) свежее мясо с добавлением крови, имитирующее субстрат для паразитического образа жизни, который используется для выращивания паразитической мухи Co. hominivorax в лабораторных условиях³⁶, и (ii) 5-дневное гнилое мясо, имитирующее субстрат для некрофагического образа жизни. Субстрат для крупного рогатого скота обычно используется для выращивания L. cuprina в лабораторных условиях 27,37,38,39, поскольку он имеет ряд преимуществ с точки зрения доступности, экономичности и практичности^, являясь при этом экологически оправданным субстратом. В других исследованиях^40,41, сравнивающих влияние гнилых и свежих субстратов на мух, использовали 7-дневный гнилой субстрат (в анаэробных условиях) и показали неблагоприятное влияние гнилого субстрата на скорость развития, выживаемость и рост. Поскольку известно, что L. cuprina колонизирует свежие трупы, которые обычно подвергаются воздействию воздуха, мы решили использовать 5-дневное тухлое мясо (говяжий фарш) в негерметичных горшках (аэробное и анаэробное разложение), чтобы имитировать субстрат некрофагов.

Преимущество представленных здесь экспериментальных схем заключается в выявлении предпочтений как для отдельных факторов, так и для их комбинированных эффектов. Кроме того, оцениваемые фенотипы, а именно выбор кормового субстрата для личинок и количество откладываемых яиц, имеют непосредственное отношение к биологическим и экологическим аспектам видов мух. Пригодность этих протоколов подчеркивается демонстрацией их эффективности на L. cuprina. Кроме того, предоставляется сценарий для статистического анализа, который может быть использован для сравнения наблюдаемых результатов, полученных у L. cuprina , с смоделированными случайными данными, обеспечивая надежный статистический анализ и интерпретацию.

Protocol

Образцы мух были получены с помощью ловушек, а не на зараженных животных. Выдана лицензия SISBIO (67867-1) на сбор и содержание мух семейства Calliphoridae в неволе в лабораторных условиях. Образцы насекомых не подлежат этической оценке в исследованиях в Бразилии. Говядина и кровь были получены комм?…

Representative Results

Для демонстрации эффективности представленных методов эксперименты были проведены с использованием лабораторной популяции Lucilia cuprina (семейство: Calliphoridae), факультативной паразитической мухи2. Полный набор исходных данных, полученных для этого вида, можно найти в д…

Discussion

Понимание эволюции пищевых привычек, особенно в контексте паразитизма у мух, требует изучения предпочтений субстрата на разных этапах жизни для питания или яйцекладки. Поэтому в данном исследовании были предложены надежные и простые методы изучения субстратных предпочтений у личино?…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)