Explorando las opciones de la historia de vida: Uso de la temperatura y el tipo de sustrato como factores que interactúan para las preferencias de las larvas y las hembras de moscardón

Summary

En este trabajo se detallan dos protocolos para evaluar la fuente de alimento y las preferencias de oviposición en larvas y hembras de moscardones. Estos comprenden cuatro opciones con dos factores que interactúan: el tipo de sustrato y la temperatura. Los ensayos permiten determinar la preferencia por la fuente de alimento de las larvas y la preferencia por el sitio de oviposición de las hembras.

Abstract

Los moscardones (Diptera: Calliphoridae) presentan una amplia gama de estilos de vida larvarios, típicamente clasificados como parasitismo obligado, parasitismo facultativo y sapro-necropagia completa. Varias especies parásitas, tanto obligadas como facultativas, se consideran de importancia sanitaria y económica, ya que sus larvas pueden causar miasis (infestación de gusanos en tejidos vivos). Sin embargo, cabe destacar que la hembra adulta juega un papel decisivo en la elección del sitio de oviposición y, por lo tanto, determina en gran medida el hábito alimentario y las condiciones de desarrollo de las larvas. En este estudio, se proponen dos protocolos para evaluar la preferencia de alimentación de las larvas y la preferencia de sitio de oviposición de las hembras considerando dos factores que interactúan: el tipo de sustrato de la carne y la temperatura. Las configuraciones presentadas aquí permitieron probar larvas de Lucilia cuprina y hembras grávidas en un ensayo de cuatro opciones con dos temperaturas (33 ± 2 °C y 25 ± 2 °C) y dos tipos de sustratos cárnicos (carne fresca suplementada con sangre y carne podrida de 5 días de edad). Las larvas o las hembras grávidas pueden optar por enterrar o poner sus huevos, respectivamente, en cualquiera de los siguientes lugares: carne podrida a 25 °C (simulando una condición de especie necrófaga), carne fresca suplementada con sangre a 33 °C (simulando una condición de especie parásita) y dos controles, carne podrida a 33 °C, o carne fresca suplementada con sangre a 25 °C. La preferencia se evalúa contando el número de larvas o huevos puestos en cada opción para cada réplica. La comparación de los resultados observados con una distribución aleatoria permitió estimar la significación estadística de la preferencia. Los resultados indicaron que las larvas de L. cuprina tienen una fuerte preferencia por el sustrato podrido a 25 °C. Por el contrario, la preferencia por el sitio de oviposición por parte de las hembras fue más variada para el tipo de carne. Esta metodología se puede adaptar para probar la preferencia de otras especies de insectos de tamaño similar. También se pueden explorar otras cuestiones mediante el uso de condiciones alternativas.

Introduction

Las moscas, en particular las moscas caliptras muscoides (incluyendo moscardones, moscas domésticas, moscas bot y moscas de la carne, entre otras), exhiben una amplia gama de estilos de vida, que abarcan comportamientos parásitos y necro-saprófagos¹. Las especies parásitas suelen causar miasis, una infestación de tejidos vivos por gusanos (larvas)². En la familia Calliphoridae, tanto las especies parásitas obligadas como las facultativas son las principales plagas del ganado responsables de las pérdidas económicas y el escaso bienestar animal debido a las infestaciones de gusanos 2,3,4,5,6,7. Los parásitos obligados, como los gusanos barrenadores del Nuevo y Viejo Mundo (Cochliomyia hominivorax y Chrysomyia bezziana, respectivamente), son especialmente problemáticos 4,7,8,9,10 junto con los parásitos facultativos, como los moscardones de las ovejas (Lucilia cuprina y Lucilia sericata)^{2,5,6, 7}. Las especies no parásitas, incluidas las saprontocrófagas, se desarrollan en materia orgánica en descomposición y necrótica y se encuentran comúnmente en ambientes insalubres. Su estilo de vida estrictamente no parasitario puede ser utilizado con éxito para la terapia de gusanos, que utiliza larvas de mosca para limpiar heridas de tejidos necróticos^11,12,13. Los moscardones también se utilizan en la ciencia forense, ya que se encuentran entre los primeros organismos en localizar y colonizar cuerpos recientemente fallecidos, y las larvas en desarrollo sirven como medio para estimar el momento de la muerte¹⁴.

Los estilos de vida de los moscardones han sido objeto de diversos estudios de investigación (por ejemplo,15,16,17,18,19,20,21) debido a su importancia en relación con los intereses humanos. Comprender los mecanismos biológicos que gobiernan el estilo de vida de una especie puede proporcionar información valiosa para mejorar los métodos destinados a controlar las especies plaga. Además, la diversidad y la evolución de los estilos de vida de los moscardones ofrecen un contexto ideal para estudiar los orígenes y mecanismos de rasgos complejos (por ejemplo, el parasitismo). El parasitismo debido a gusanos que se alimentan de tejido vivo ha evolucionado de forma independiente varias veces dentro de la familia Calliphoridae^22,23. Sin embargo, la historia evolutiva de los hábitos alimenticios de los moscardones aún se desconoce en gran medida, con estudios restringidos a mapear los hábitos a lo largo de las filogenias (por ejemplo, ^16,19,22) sin la ayuda de ensayos funcionales. Por ejemplo, no se sabe con certeza si los parásitos obligados evolucionaron a partir de generalistas (es decir, parásitos facultativos) o directamente de especies necrófagas. Los procesos moleculares, fisiológicos y conductuales que acompañan a los cambios evolutivos en el estilo de vida también son en gran medida desconocidos.

En este contexto, los parásitos facultativos, como la moscardón de oveja Lucilia cuprina, que pueden desarrollarse como parásitos en un huésped o como necrófagos en cadáveres, ofrecen la posibilidad de explorar los factores y mecanismos que controlan las elecciones de estilo de vida. Lucilia cuprina es una especie cosmopolita conocida por causar el ataque de la mosca de las ovejas, especialmente en Australia, donde se considera una plaga ^3,16. La miasis por L. cuprina también puede ocurrir en otros animales de ganado, mascotas y humanos 3,24,25,26,27,28,29,30. Sin embargo, sus larvas también pueden desarrollarse en tejidos necróticos y materia en descomposición y esta especie ha sido utilizada con éxito en entomología forense ya que es muy rápida para localizar y colonizar cadáveres^31,32,33,34. Aunque el estilo de vida parasitario versus no parasitario de los moscardones está definido por la etapa larvaria, es la hembra adulta la que selecciona el sitio de oviposición. En consecuencia, la hembra adulta influye en gran medida en el estilo de vida de las larvas, ya que estas últimas tienen una movilidad limitada. Sin embargo, la elección de la hembra no implica necesariamente que las larvas prefieran el mismo sustrato cuando se les presenta una opción³⁵. Una hipótesis es que los cambios de comportamiento que llevan a las hembras a poner sus huevos en tejido vivo podrían haber sido parte de un cambio temprano hacia un estilo de vida parasitario. Las preadaptaciones o capacidades fisiológicas de las larvas resultantes habrían sido esenciales para su desarrollo exitoso en el tejido vivo, lo que llevó a la aparición del estilo de vida parasitario. Como tal, los procesos afectados y seleccionados pueden no necesariamente alinearse entre ambas etapas de la vida.

En este contexto, se desarrollaron dos métodos para probar la preferencia de comportamiento en moscardones, en particular, para L. cuprina, con respecto al sustrato de alimentación de las larvas (ensayo de preferencia larvaria) y el sitio de oviposición (ensayo de preferencia femenina). Estos métodos tienen en cuenta dos factores que interactúan: la temperatura y la frescura de la carne. La temperatura fue elegida como un factor crucial, ya que la mayoría de los casos de miasis ocurren en animales homeotérmicos². Por lo tanto, se seleccionó una temperatura de 33 °C como indicador del “factor de estilo de vida parasitario”, mientras que una temperatura de 25 °C (temperatura ambiente) representa el “factor no parasitario”. Se eligió una temperatura de 25 °C por ser representativa de la temperatura media anual registrada en Brasil (Instituto Nacional de Meteorología, INMET). Adicionalmente, se consideraron dos tipos de sustratos cárnicos, ambos de origen bovino: (i) carne fresca suplementada con sangre, imitando el sustrato para el estilo de vida parasitario, que se utiliza para criar al moscardón parásito Co. hominivorax en condiciones de laboratorio³⁶, y (ii) carne podrida de 5 días de edad, emulando el sustrato para el estilo de vida necrófago. El sustrato bovino se utiliza comúnmente para la cría de L. cuprina en condiciones de laboratorio 27,37,38,39, ya que ofrece varias ventajas en términos de disponibilidad, rentabilidad y practicidad^, a la vez que es un sustrato ecológicamente justificable. Otros estudios^40,41 que comparan el efecto de sustratos podridos versus sustratos frescos en moscardones han utilizado sustrato podrido de 7 días de edad (en condiciones anaeróbicas) y mostraron un efecto adverso del sustrato podrido sobre las tasas de desarrollo, supervivencia y crecimiento. Como se sabe que L. cuprina coloniza cadáveres frescos que generalmente están expuestos al aire, decidimos usar carne podrida de 5 días (carne molida) en macetas no herméticas (descomposición aeróbica y anaeróbica) para imitar un sustrato necrófago.

Los diseños experimentales presentados aquí ofrecen la ventaja de discernir las preferencias por los factores individuales, así como sus efectos combinados. Además, los fenotipos puntuados, es decir, la elección del sustrato de alimentación de las larvas y el número de huevos puestos, son directamente relevantes para los aspectos biológicos y ecológicos de las especies de moscardones. La idoneidad de estos protocolos se pone de manifiesto al demostrar su eficacia en L. cuprina. Además, se proporciona un script para el análisis estadístico, que se puede utilizar para comparar los resultados observados obtenidos en L. cuprina con datos aleatorios simulados, lo que garantiza un análisis e interpretaciones estadísticas sólidas.

Protocol

Las muestras de moscas se obtuvieron utilizando trampas y no en animales infestados. Se emitió una licencia SISBIO (67867-1) para recolectar y mantener moscas de la familia Calliphoridae en cautiverio en condiciones de laboratorio. Las muestras de insectos están exentas de evaluación ética en la investigación en Brasil. La carne y la sangre de bovino se obtenían comercialmente y no se requería autorización ética. 1. Preferencia de alimentación de las larvas <li…

Representative Results

Para demostrar la efectividad de los métodos presentados, los experimentos se llevaron a cabo utilizando una población de laboratorio de Lucilia cuprina (familia: Calliphoridae), un moscardón parásito facultativo2. Todo el conjunto de datos brutos obtenido para esta especie se puede encontrar en el Archivo Suplementario S3 con los resultados de las pruebas de preferencia de sustrato de larvas y hembras. Para evaluar si las larvas y las hembras muestran preferencia por…

Discussion

Comprender la evolución de los hábitos alimenticios, particularmente en el contexto del parasitismo en moscardones, requiere el examen de las preferencias de sustrato a lo largo de las diferentes etapas de la vida para la alimentación o la oviposición. Por lo tanto, en este estudio, se propusieron métodos robustos y sencillos para investigar las preferencias de sustrato en larvas y hembras de moscardones. Estos métodos fueron probados en Lucilia cuprina, un moscardón parásito facultativo<sup class="xref"…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)