Summary
Här presenterar vi en metod för att identifiera substanser som modulerar ADCC-mekanismen, en viktig cancercellsdödande mekanism för antitumörantikroppar. Den cytotoxiska effekten av NK-celler mäts i sfäroider av bröstcancerceller i närvaro av Trastuzumab. Bildanalys identifierar levande och döda mördar- och målceller i sfäroider.
Abstract
Monoklonal antikroppsbaserad immunterapi riktad mot tumörantigener är nu en grundpelare i cancerbehandlingen. En av de kliniskt relevanta verkningsmekanismerna för antikropparna är antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC), där antikroppen binder till cancercellerna och engagerar den cellulära komponenten i immunsystemet, t.ex. naturliga mördarceller (NK-celler), för att döda tumörcellerna. Effekten av dessa terapier skulle kunna förbättras genom att identifiera adjuvansföreningar som ökar cancercellernas känslighet eller immuncellernas styrka. Dessutom kan oupptäckta läkemedelsinteraktioner hos cancerpatienter som sammedicinerats för tidigare tillstånd eller cancerrelaterade symtom avgöra framgången för antikroppsbehandlingen. Därför måste sådana oönskade läkemedelsinteraktioner elimineras. Med dessa mål i åtanke skapade vi en cancer-ADCC-modell och beskriver här ett enkelt protokoll för att hitta ADCC-modulerande läkemedel. Eftersom 3D-modeller som cancercellssfäroider är överlägsna 2D-kulturer när det gäller att förutsäga in vivo-svar av tumörer på anticancerterapier, sfäroida samkulturer av EGFP-uttryckande HER2+ JIMT-1 bröstcancerceller och NK92. CD16-cellinjer sattes upp och inducerades med Trastuzumab, en monoklonal antikropp som är kliniskt godkänd mot HER2-positiv bröstcancer. JIMT-1-sfäroider tilläts bildas i cellavvisande U-bottenplattor med 96 brunnar. På dag 3 tillsattes NK-celler och Trastuzumab. Sfäroiderna färgades sedan med Annexin V-Alexa 647 för att mäta apoptotisk celldöd, som kvantifierades i sfäroidernas perifera zon med ett automatiserat mikroskop. Användbarheten av vår analys för att identifiera ADCC-modulerande molekyler visas genom att visa att Sunitinib, en receptortyrosinkinashämmare som godkänts av FDA mot metastaserande cancer, nästan helt avskaffar ADCC. Genereringen av sfäroiderna och bildinsamlings- och analyspipelines är kompatibla med screening med hög genomströmning för ADCC-modulerande föreningar i cancercellssfäroider.
Introduction
Multicellulära tumörsfäroider (MCTS) är allmänt använda tredimensionella (3D) modeller som bildas på grund av tendensen hos vidhäftande celler att aggregera och representerar ett viktigt verktyg för att få mekanistisk insikt i cancercellbiologi. De kan genereras från ett brett spektrum av celltyper med hjälp av många tekniker, såsom vätskebaserade och ställningsbaserade 3D-kulturer1. Deras främsta fördel jämfört med monolager 2D-modeller är att de rekapitulerar huvuddragen i in vivo-tumörer , nämligen strukturell organisation och hypoxi, genom att efterlikna tumörcellernas biologiska beteende, särskilt de mekanismer som leder till terapeutisk flykt och läkemedelsresistens2. Eftersom MCTS kan förbättra förutsägbarheten av toxicitet och läkemedelskänslighet används de i stor utsträckning för att studera cancer i 3D och kan förbättra utvecklingen av effektiva läkemedel för olika typer av cancer3.
För att studera alla sjukdomar finns det ett kritiskt behov av relevanta och praktiska modeller. Att sätta upp modeller för cancerimmunologiska studier är utmanande eftersom immunsystemet består av flera celltyper. Varje celltyp har flera subtyper och ett brett spektrum av aktiveringstillstånd. Dessa olika typer av immunceller interagerar med cancerceller och andra tumörkomponenter, vilket i slutändan påverkar resultatet av sjukdomen. 2D in vitro cellodlingsmetoder misslyckas med att rekapitulera dessa komplexa cellulära interaktioner, eftersom de saknar översättbarhet och inte kan förutsäga effekten av ett läkemedel på systemnivå (t.ex. i vävnader)4,5. Dessutom har musmodeller också allvarliga begränsningar på grund av de grundläggande skillnaderna mellan det mänskliga och murina immunsystemet. 3D-odlingssystem kan därför fylla de nuvarande luckorna i tillgängliga modeller, tillhandahålla en alternativ metod och förbättra vår förståelse av cancerimmunologi6. Specifikt kan sfäroidmodeller användas för att testa immunterapier, främst för att bedöma effektiviteten av läkemedelsscreening och terapeutiska antikroppar för att förbättra immuncellsinfiltration och antitumöreffekter mot sfäroidmålen7. Dessutom har potentialen hos MCTS som består av celler i olika metaboliska och proliferativa tillstånd att studera interaktionerna mellan stromaceller (t.ex. lymfocyter, makrofager, fibroblaster) och cancerceller och för utveckling av nya anticancerstrategier mer än väl visats8. Därför finns det ett stort behov av att bekräfta prediktiva och exakta plattformar för att öka läkemedelstestningsprocessen, med hänsyn till patofysiologin i tumörmikromiljön.
Bröstcancer är den vanligaste cancerformen som diagnostiseras hos kvinnor i världen. Den kliniska klassificeringen av denna heterogena sjukdom baseras på närvaron av transmembranreceptorer, t.ex. östrogenreceptorer (ER) och progesteronreceptorer (PR) (kollektivt kallade hormonreceptorer, HR) tillsammans med överuttryck eller amplifiering av det humana epidermala tillväxtfaktorreceptorn 2 (HER2)-protein/onkogen. Baserat på det immunhistokemiska uttrycket av dessa receptorer är fyra subtyper allmänt erkända: luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positiv (HR-/HER2+) och trippelnegativ bröstcancer (HR-/HER2-). HER2+-gruppen utgör 10-15% av BC-fallen och kännetecknas av högt HER2-uttryck med frånvaro av ER och PR, har en sämre prognos jämfört med luminala tumörer och kräver specifika läkemedel riktade mot HER2/neu-proteinet9.
BC-utveckling är en process i flera steg, och en tidig diagnos är avgörande för en framgångsrik behandling av sjukdomen10. Men trots nyligen framkomna personliga BC-behandlingsalternativ (t.ex. endokrina och anti-HER2-antikroppsterapier) fortsätter BC att utmana onkologer. Precis som kirurgi, kemoterapi och strålbehandling kan dessa personliga terapier också ha allvarliga biverkningar och patienter kan utveckla resistens mot dessa medel, vilket gör det till en långsiktig utmaning att bestämma den bästa strategin11,12. Därför är förbättrad förståelse av samspelet mellan tumören och dess mikromiljö avgörande och förväntas ge nya riktningar för utvecklingen av nya behandlingar som tar hänsyn till särdragen hos de olika BC-subtyperna13. En ny våg av immunterapier, såsom antikroppskonjugat, adoptiva T-cellsterapier, vacciner och nya HER2-riktade monoklonala antikroppar (mAbs) studeras i en bred population av patienter med HER2-uttryckandetumörer14.
Trastuzumab, till exempel, representerar en effektiv behandlingsmodalitet för HER2+ BC. Som en del av sin verkningsmekanism medierar trastuzumab fragmentkristalliserbara gammareceptorer (FcγR)-beroende aktiviteter. FcγR kännetecknas av sin affinitet för Fc-fragmentet och det immunsvar de initierar. Aktivering av FcγRIIIa (CD16A) på naturliga mördarceller (NK) är avgörande för att mediera antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC), medan triggning av FcγRIIa (CD32A) och FcγRIIIa på makrofager inducerar antikroppsberoende cellulär fagocytos (ADCP)15. Studier på djurmodeller visade att möss som saknade FcγRI (CD64) och FcγRIII (CD16) receptorer inte kunde initiera skyddande immunsvar mot tumörspecifika antigener, vilket avslöjar att ADCC sannolikt är en viktig verkningsmekanism för mAb Trastuzumab16.
Eftersom NK-celler tillgriper tumörcellsbundna Abs för cancercellsdödande genom ADCC, är uttryck av Fc-receptorer avgörande för en effektiv behandling med Trastuzumab17 (Figur 1). Dessutom balanseras deras verkan effektivt av en stimulering av aktiverande och hämmande receptorer, t.ex. Killer-cell immunoglobulin-like (KIR) receptorer18.
Figur 1. Mekanism för ADCC i samband med ett antitumörsvar. Fcγ-receptorn i en naturlig mördarcell (NK) känner igen Fc-regionen hos en antikropp, som tidigare hade bundit till ett ytantigen på en cancercell. Denna immunologiska synaps leder till degranulering av NK-cellen, vilket frisätter cytotoxiska mediatorer som granzymer och perforin. Dessa molekyler bidrar till porbildning i cellmembranet och aktiverar apoptotiska vägar som orsakar programmerad celldöd i målcellen (bild skapad med Biorender.com). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Immunterapiutveckling för HER2+ BC representerar ett område under utveckling. I det här fallet bör man överväga interaktioner mellan olika komponenter i immunsystemet. Dessutom har tidigare publikationer i stor utsträckning testat kombinationsterapier som involverar alla typer av traditionella, immun- eller cellterapier för att identifiera synergiserande kombinationer19.
Flera 3D-modeller av HER2+ BC har tidigare använts för läkemedelsutveckling. Till exempel använde Balalaeva et al. SKBR-3-sfäroider som överuttrycker HER2 för att bedöma cytotoxiciteten hos det HER2-riktade immuntoxinet 4D5scFv-PE4020. I en annan studie etablerades ett 3D Matrigel-baserat HER2+ BC-odlingssystem för att mäta celltillväxt som svar på trastuzumab och endokrina medel21. Dessa studier belyser vikten av tumörsfäroidmodeller av HER2-överuttryckande cancerceller för att representera en effektiv strategi för att kliniskt förbättra terapeutiska svar22.
Vår grupp har tidigare identifierat Sunitinib, en multiriktad tyrosinkinashämmare, som en hämmare av Trastuzumab-beroende ADCC i JIMT-1 HER2+ BC-celler i en 2D-odlingsanalys. Studien visade att Sunitinib inducerar autofagi och försämrar NK-cellernas dödande funktion, nedreglerar HER2-uttrycket och förbättrar ytbindningen av JIMT-1-celler17.
Här etablerade vi en ny 3D, sfäroid ADCC-modell (NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP cancerceller) som ska användas för screeningapplikationer med hög genomströmning och för att validera de ovan nämnda fynden användes Sunitinib som en modellförening. Först genererade vi EGFP-uttryckande JIMT-1-celler17 och odlade sfäroider från dessa celler. ADCC inducerades av NK-celler tillsammans med trastuzumab, och sfäroider hölls i odling i närvaro eller frånvaro av testsubstanser i 24 timmar (figur 2). Kvantifiering av ADCC baseras på detektion av apoptotisk cancercelldöd (Annexin V-färgning) med hjälp av ett High-Content Analysis-system.
Figur 2. ADCC i ett 3D-sfäroid samkultursystem. Våra experimentella inställningar är baserade på ett 3D-sfäroidsystem som mer exakt kan modellera in vivo-mikromiljön jämfört med 2D-modeller. JIMT-1 EGFP-bröstcancerceller såddes på en konkav cellavvisande botten för att bilda ett rundformat cellkluster, kallat sfäroid. ADCC initierades sedan genom att lägga till NK92. CD16 naturliga mördarceller (E:T-förhållande = 20:1) och en monoklonal anti-HER2-antikropp, Trastuzumab. Den experimentella modellen har visat sig vara effektiv och lätt att tillämpa för identifiering av ADCC-modifierande testföreningar (bild skapad med Biorender.com). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vi visade att insamling av data på detta sätt kan göras i realtid och är statistiskt robust för användning vid screening med högt innehåll i cancerläkemedelsutveckling. Det är viktigt att denna modell möjliggör en utökad validering av en större uppsättning föreningar, och den kan tillämpas på flera analyser av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ställa in JIMT-1-enhanced fluorescent protein (EGFP) sfäroidmodell
- För att bilda en U-formad cellavvisande botten, belägg 96-hålsplattan med 0,5 % agaros-PBS-lösning (30 μL/brunn). Inkubera plattan i rumstemperatur i ca 30-45 min.
- Tvätta JIMT-1-EGFP-cellerna två gånger med 2 ml steril PBS (generering av JIMT1-EGFP-cellinje rapporterades i en tidigare publikation17). Använd T25-vävnadsodlingskolvar och JIMT-1-media (DMEM/F-12-medium kompletterat med 20 % fetalt bovint serum (FBS), 0,3 E/ml insulin (100 IE/ml, Humulin R) och 1 % penicillin-streptomycin) för cellkulturen.
- Tillsätt 2 ml trypsin-EDTA till kolven och inkubera den i 10 minuter i en CO2 -inkubator.
- Knacka på kolven för att kontrollera om JIMT-1-celler lossnade efter inkubationstiden.
- Använd 2 ml JIMT-1-medium för att stoppa matsmältningen och samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml rör.
- Räkna cellerna i en Bürker-kammare med 0,4 % trypanblått (80 μL av färgämnet + 20 μL av cellsuspensionen) och justera cellantalet till 20 000 celler/ml.
- Pipettera 100 μl av cellsuspensionen (2000 celler/brunn) till varje brunn på 96-hålsplattan (förbelagd med 0,5 % agaros-PBS-lösning enligt 1.1).
- Låt cellerna klumpa ihop sig under en 3-dagars inkubationstid vid 37 °C i en CO2 -inkubator.
- Kontrollera regelbundet storleken och formen på sfäroider med ett inverterat mikroskop.
2. Beläggning av HCS-plattan
OBS: För att förhindra att JIMT-1-EGFP-sfäroider fästs på plattans glasyta är det avgörande att belägga HCS-plattan (High-Content Screening) (annars skulle analys med högt innehåll inte vara möjlig).
- På dag 3 efter induktion av sfäroider, belägg den 96 brunnar långa siktplattan med högt innehåll med Pluronic-F127 (0,5 % i DMSO, 50 μL/brunn) och inkubera plattan i 45 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera beläggningslösningen och tvätta brunnarna två gånger med DMEM/F-12-serumfritt medium (100 μL/brunn).
3. Överföring av sfäroider till HCS-plattan
- Använd en 1 ml pipett och överför sfäroiderna i tre exemplar till HCS-plattan med 96 brunnar i glasbotten.
4. Förbehandling av JIMT-1 EGFP-sfäroider med testföreningar
- Tillsätt testföreningen (t.ex. Sunitinib utspädd i DMSO i en koncentration av 40 μM) genom att pipettera 10 μL/brunn och tillsätt 10 μL färskt JIMT-1-medium till kontrollbrunnarna (CTL).
- Inkubera plattan i 1 timme i en CO2 -inkubator vid 37 °C.
5. Induktion av ADCC genom tillsats av effektorcellerna
OBS: CD16.176V.NK92-celler (hädanefter kallade NK-celler) odlades i α-MEM kompletterat med 20 % FBS, 1 % MEM-NEAA, 1 % Na-pyruvat, 1 % glutamin, 1 % penicillin-streptomycin och 100 IE/ml IL-2.
- Samla NK-cellerna i kolven i ett 15 ml rör. Räkna cellerna med trypanblått (80 μL av färgämnet + 20 μL av cellsuspensionen) och justera celldensiteten till 20:1 effektor-till-mål-förhållande (E:T) (40 000 NK-celler/brunn).
- Färga NK-cellerna med 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL i 1 ml α-MEM NK-medium) och placera dem i en CO 2-inkubator vid 37 °C i 1 timme.
- Centrifugera NK-cellerna vid 150 x g i 3 minuter vid rumstemperatur två gånger för att tvätta överskottet av färgämnet med 1 ml α-MEM-medium.
- Återsuspendera NK-cellpelleten i 1 ml färskt JIMT-1-medium.
- Tillsätt de färgade NK-cellerna tillsammans med anti-HER2-antikroppen (Ab) (Trastuzumab, löst i sterilt destilleratH2O) till JIMT-1-sfäroiderna genom att pipettera 55 μL/brunn CTB-färgade NK-celler och 55 μL/brunn 10 μg/ml Ab i JIMT-1-medium (total behandlingsvolym som tillsätts för ADCC är 110 μL/brunn och den slutliga Sunitinib-koncentrationen är 20 μM).
OBS: För valet av Ab-koncentration och E:T-förhållande förlitade vi oss på vår tidigare publikation17. Preliminära experiment utfördes med olika E:T-förhållanden och koncentrationer av Trastuzumab för att bedöma vilken som var mest effektiv för att inducera ADCC i sfäroider (tilläggsfigur S1). - Tillsätt 110 μl/brunn färska JIMT-1 medium to control (CTL) brunnar.
- Inkubera plattan i 24 timmar i en CO2 -inkubator vid 37 °C.
OBS: Eftersom NK92-celler är kända för att utöva icke-specifika cytotoxiska funktioner, för kontrollanvändning saminkuberade JIMT-1-celler med både NK-celler ensamma och med en isotypkontroll eller en F(ab')2 Ab. Här användes F(ab')2-Trastuzumab (TR-F(ab')2) som negativ CTL. TR-F(ab')2-fragmentet framställdes enligt Tóth et al.19 och tillsattes i samma volym som Trastuzumab tillsammans med NK-celler enligt beskrivningen i 5.5. Koncentrationen justerades till 6,6 μg/ml, vilket motsvarar en ekvimolär koncentration med Trastuzumab23.
6. Annexin V-647 färgning av sfäroider
- För att mäta apoptotisk celldöd, färga sfäroiderna med Annexin V-Alexa Fluor 647-konjugat i 1 timme i JIMT-1-medium (1:100) genom att pipettera 50 μL/brunn.
7. Bildbehandling
OBS: Plattan avbildas 24 timmar efter tillsats av NK-effektorcellerna till målcellerna. För bildbehandling används en High-Content Analyzer och en bildanalysprogramvara.
- Välj typ av mikroplatta från listan över plattor med alternativet Plåttyp . Använd 96-brunnars HCS-platta (High-Content Screening).
- Välj Two Peak-autofokus eftersom analysen utförs i plattor med 10x objektiv med 0.3 numerisk bländare (NA), med alternativen Autofokus respektive Objektiv . Välj konfokalläge med alternativet Opt. Mode och tillämpa Binning 2 med alternativet Binning .
- För avbildning av sfäroider, välj lämpliga kanaler med alternativet Kanalval . För att detektera de EGFP-transducerade JIMT-1-cellerna väljer du EGFP (integrationstid 200 ms, lasereffekt 50 %, stackhöjd 2,0 μm; ex: 488 nm em: 500-550 nm), och för att detektera apoptotiska celler använd Alexa 647 (integrationstid 100 ms, lasereffekt 50 %, stackhöjd 10,0 μm; ex: 640 nm em: 650-760 nm). För att visualisera NK-cellerna i sfäroiderna, välj följande kanal: DAPI (integrationstid 100 ms, lasereffekt 50 %, stackhöjd 2,0 μm; ex: 405 nm em: 435-480 nm).
- I alternativet Layoutval väljer du Z-staplar eftersom celler i sfäroiderna tenderar att vara på olika fokalplan i mikroskopet. 10 plan (med ett avstånd på 10 μm) är tillräckligt för att täcka hela sfäroidområdet. Ställ in värdena för det första planet och det sista planet till 0 μm respektive 90 μm.
OBS: Innan mätningen påbörjas kan sampbilder kan tas med snapshot-funktionen för att kontrollera rätt inställningar. - Ange antalet brunnar och fält för avbildning med alternativet Definiera layout .
8. Analys av högt innehåll (HCA)
OBS: Analysera bilderna med Harmony-programvaran eller exportera bilder för analys med hjälp av en föredragen programvara från tredje part. För analys av ADCC-effektivitet mäts fluorescensintensiteten för bilaga V 647. Målceller som dödas av ADCC uppträder i det perifera området av sfäroiderna. Därför mäts de positiva cellerna i annexin V i denna sfäroida "ring". För att validera denna metod utfördes analyser med olika parametrar för att bedöma vilken som var mest tillförlitlig och gav bäst resultat (tilläggsfigur S2). En ADCC-brunn visas i videon för att steg-för-steg demonstrera bildanalysprocessen.
- Identifiera sfäroiderna med hjälp av EGFP-fluorescensen hos JIMT-1-celler med alternativet Hitta texturområden och filtrera bort dem efter storlek (> 25 000 μm2).
- Ta bort kantobjekt med alternativet Välj befolkning .
- Eftersom Annexin V-positiva (apoptotiska) celler uppträder i periferin av sfäroider, mät Annexin-intensiteten i denna apoptotiska "Ring", vald av alternativet Välj region (yttre kant -90%) för att bestämma apoptotisk celldöd.
- Ange intensitetsvärden i bilaga V som medelintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGFP-uttryckande JIMT-1-celler genererades och sfäroider odlades från dessa celler. Sunitinib användes som testsubstans eftersom det tidigare visats påverka förloppet av ADCC17. Sfäroiderna fick klumpa ihop sig i 72 timmar. På dag 3 tillsattes 10 μg/ml Trastuzumab (eller ekvimolar 6,6 μg/ml TR-F(ab')219) och NK-celler (20:1) till sfäroiderna i närvaro eller frånvaro av 20 μM Sunitinib (1 timme före behandling), under en total tid av 24 timmar. JIMT-1 ensamt och JIMT-1 saminkuberat med NK-celler (20:1) användes som CTL. Sfäroider färgades med Annexin V 647 i 1 timme för att detektera apoptotisk celldöd och avbildades sedan med en High-Content Analyzer.
Som indikeras av Annexin V-färgning orsakade tillsats av NK-celler tillsammans med Trastuzumab till JIMT-1-cellerna celldöd i tumörsfäroiderna. Annexinpositiva (apoptotiska) celler uppstod i den perifera zonen av sfäroiderna, vilket syns i figur 3A. Å andra sidan resulterade inte enbart tillsatsen av NK-celler i tumörcellsapoptos. För att skilja mellan Trastuzumabs förmåga att rekrytera ADCC och dess direkta biologiska effekt användes TR-F(ab')2 som saknade funktionell FcR-bindningsförmåga som en negativ kontroll av Trastuzumab. Eftersom TR-F(ab')2 visade sig vara ineffektivt i denna modell (Figur 3B), är det troligt att effekten medieras via ADCC. Dessutom minskade förbehandling med Sunitinib Annexin V-färgning i sfäroiderna, vilket bekräftade Sunitinib-inducerad ADCC-resistens och avslöjade förebyggande av apoptotisk celldöd i JIMT-1-sfäroider saminkuberade med NK-celler och Trastuzumab.
Figur 3. Detektion av ADCC-effektorföreningar i en 3D-sfäroidmodell. Tumörsfäroider genererades med JIMT-1-EGFP-celler. Efter en inkubationstid på 3 dagar överfördes sfäroider till en HCS-platta, tidigare belagd med Pluronic F-127 för att förhindra cellbindning. Nästa dag, 10 μg/ml Trastuzumab (TR) (eller ekvimolar 6,6 μg/ml TR-F(ab')2 som negativ CTL) och NK92. CD16-celler (förfärgade med Cell Tracker Blue) tillsattes till brunnarna (E:T-förhållande på 20:1), i frånvaro eller närvaro av 20 μM Sunitinib (SUN). Enbart JIMT-1-sfäroider och JIMT-1-sfäroider saminkuberade med NK-celler (20:1) användes som CTL. (A) Efter en inkubationstid på 24 timmar användes Annexin V 647 (röd färg) för att färga sfäroiderna i 1 timme för att visualisera apoptotiska celler. (B) Bilder av 3 sfäroider/tillstånd togs och analyserades med avseende på fluorescensintensiteten hos Annexin V 647 i sfäroidernas perifera område (ringregion). Histogrammet visar 4 oberoende experiment (medel±SEM). Data analyserades med Kruskal-Wallis test följt av Dunns post-hoc test (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: inte signifikant). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Dessa data bekräftar att Sunitinib hämmar ADCC. ADCC-förstärkande föreningar förväntas identifieras på ett liknande sätt. Sammanfattningsvis kan vår HCS-analys vara lämplig för identifiering av föreningar som påverkar ADCC.
Kompletterande figur S1. Optimering av E:T-förhållandet och Trastuzumab-koncentrationen. JIMT-1-EGFP-celler användes för att generera sfäroider. På dag 3 överfördes sfäroider till en HCS-platta och NK-celler tillsattes i olika E:T-förhållanden (20:1, 40:1 och 60:1) med 10, 20 och 50 μg/ml Trastuzumab (TR) för att se vilken som var den mest effektiva behandlingen som kunde inducera celldöd i sfäroiderna. Kontroll (JIMT-1-EGFP) behandlades med JIMT-1 cellodlingsmedia. (A) Efter 24 timmar färgades cellerna med Annexin V 647 (röd färg) i 1 timme och apoptotisk celldöd mättes med HCA. Histogram visar 3 oberoende experiment (medel±SEM). Kolumnerna representerar intensiteten hos Annexin V 647 runt JIMT-1-sfäroiderna. (B) Bilder av 3 sfäroider/tillstånd analyserades för intensiteten i ringregionen Annexin V 647. Data analyserades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys post-hoc-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: inte signifikant). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2. Utvärdering av JIMT-1-cellapoptos i sfäroiderna. JIMT-1-EGFP-celler användes för att generera sfäroider. På dag 3 överfördes sfäroider till en HCS-platta och förbehandlades med 20 μM Sunitinib (SUN) i 1 timme, sedan tillsattes NK-celler i förhållandet 20:1 E:T med 10 μg/ml Trastuzumab. Efter 24 timmar färgades cellerna med Annexin V 647 i 1 timme och apoptotisk celldöd mättes med HCA. Bilder av 3 sfäroider/tillstånd analyserades för intensiteten i Annexin V 647 (kontroll: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 NK-celler+10 μg/ml Trastuzumab, ADCC+SUN: 20 μM Sunitinib+20:1 NK-celler+10 μg/ml Trastuzumab). Kolumnerna representerar intensiteten hos Annexin V 647 runt JIMT-1-sfäroiderna (ringen) (A), i hela sfäroiden (B) och i hela brunnen (C). Histogram visar 3 oberoende experiment (medel±SEM). Data analyserades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys post-hoc-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: inte signifikant). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots betydande förbättringar i behandlingen av BC under de senaste decennierna utvecklar patienter fortfarande regelbundet läkemedelsresistens eller upplever negativa biverkningar24. Den höga sjukligheten och dödligheten kopplad till BC kräver en fortsatt undersökning av de underliggande molekylära mekanismerna, precis som robusta screeningplattformar för att identifiera nya molekyler som kan användas för terapeutisk utveckling25. Dessa strategier kräver cellodlingsbaserade translationella analyser. 3D-tumörodlingssystem, såsom sfäroider och tumörorganoider, har nyligen dykt upp som billiga, lättimplementerade modeller som representerar viktiga aspekter av tumörpatofysiologi närmare än konventionella monolagerkulturer. En av dessa egenskaper är den rumsligt koordinerade interaktionen mellan olika tumörassocierade immunceller och cancerceller. Detta gör 3D-samodlingsmodeller till överlägsna verktyg för läkemedelsscreening inriktad på modulatorer som verkar på immunceller för att behandla maligniteter26.
I detta arbete har vi introducerat en ny sfäroidmodell för NK-cellsmedierad Trastuzumab-beroende ADCC mot JIMT-1 bröstcancerceller och beskrivit ett automatiserat bild- och analysarbetsflöde för utvärdering av NK-cellsmedierad cancercellsdöd. Proceduren implementerades för en programvara för bildanalys med högt innehåll som möjliggör övervakning av NK-cellernas sjukdomsrelevanta förmåga att inducera apoptos hos cancerceller. Den multiriktade tyrosinkinashämmaren Sunitinib som en substans som inducerar resistens mot Trastuzumab-beroende ADCC i JIMT-1-celler i 2D-cellodlingsanalyser har tidigare identifierats. Sunitinib försämrar NK-cellernas dödande funktion och inducerar autofagi, nedreglering av HER2-uttryck och förbättrar vidhäftningen av JIMT-1-celler17. För att validera vår sfäroidanalyspipeline för substansidentifiering testade vi Sunitinib som en modellsubstans och visar att den avsevärt kan hämma NK-cellernas förmåga att döda cancercellernas sfäroider och reproducera den effekt som den visade i monolager.
Vår metod är enkel och omfattar tillväxt av sfäroider i agarosbelagda 96-brunnars vävnadsodlingsplattor, en engångsöverföring av de bildade sfäroiderna till en mikroplatta med glasbotten lämplig för HCS- och HCA-applikationer, tillsats av testföreningar och de separat färgade NK-cellerna som aktiveras för att döda genom administrering av Trastuzumab, en enstegs celldödsfärgning och mikroskopianalys. Inga allvarliga manipulationer tillämpas på brunnarna efter att samodlingen av de två celltyperna och läkemedelsbehandlingen har påbörjats för att undvika att sfäroidernas integritet äventyras. Analysen tar bara 4 dagar att utföra. Att belägga botten av 96-brunnars vävnadsodlingsplattor med 1 % lågsmältande agaros som en del av proceduren är ett billigt alternativ till att använda ultralåga fästplattor för att förhindra att JIMT-1-celler fäster vid plattans yta och för att främja den spontana organisationen av tumörcellerna till sfäroider. Eftersom det inte är möjligt att ta bilder över agaroskudden och den U-formade plastytan måste sfäroiderna överföras till bildplattan. Avgörande var passiveringen av glasytan på HCS-plattan med det bioinerta ytaktiva ämnet Pluronic-F127 före sfäroidöverföring. Utan detta steg sprids sfäroider ut på botten av brunnarna, vilket gör avbildningen och analysen svår.
En human tumörcellinje som stabilt uttrycker EGFP användes för att bilda sfäroider17. Den genetiskt kodade markören ger ihållande fluorescens genom hela protokollet istället för cellfärgningar. Oövervakad texturanalys av EGFP-signalen utgör grunden för att känna igen sfäroidernas kompakta kärna, som omfattar hela sfäroiden utan celldödsinduktion. När NK-celler tillsattes och ADCC inducerades, utgjorde den markanta upplösningen av konturerna ibland en utmaning för bildanalysalgoritmen att avgränsa sfäroidens konturer. Eftersom Annexin V-positiva celler huvudsakligen hittades i periferin av sfäroiderna, kringgicks detta problem genom att utvärdera celldöd i en perifer ringformig region genererad av den inbyggda bildsegmenteringsmodulen i programvaran genom att förlänga den väldefinierade sfäroidkärnan. Expansionsfaktorn som definierar den yttre gränsen för detta område valdes för att omfatta penumbran av döende, strimlade och dispergerade celler i alla fall efter visuell kuratering av hundratals sfäroidbilder. Bestämning av den totala fluorescensen av det apoptotiska ringområdet i de maximala projektionerna av Z-stackbilder gav lägre experimentella fel och en mer uttalad ADCC-effekt än mätning av antingen hela sfäroidområdet eller hela brunnsområdet (tilläggsfigur S2). Fluorescerande etiketter valdes för att markera BC-cellerna (EGFP) och detektera celldöd (Alexa 647) för att utesluta ett behov av kanalseparation. En slutpunktsavläsning valdes baserat på fluorescerande märkning för exponerat fosfatidylserin, en apoptotisk markör, i motsats till att övervaka minskningen av EGFP-fluorescens för att bestämma sfäroidernas livskraft över tid, vilket skulle kunna vara ett annat alternativ. Annexinfärgning möjliggjorde en mer exakt och känslig identifiering av celldöd. I princip är det möjligt att förbättra den nuvarande endimensionella färgningsmetoden genom att komplettera den med ytterligare, mer exakta celldödsmarkörer som kan identifiera celldödsmodaliteten (t.ex. fluorescerande kaspassubstrat) och den försvunna celltypen.
Denna metod kan ändras med minimala förändringar för att studera andra effektorimmuncelltyper (makrofager, T-celler och chimära antigenreceptorer [CAR]-uttryckande immunceller) och aktivatormolekyler (t.ex. cytokiner, interleukiner). Med siktet inställt på enkelhet, robusthet och kort bearbetningstid har vi inte uttömt de möjligheter som HCA kan erbjuda för denna analys. Bild- och analysprotokollen är mottagliga för tillägg av ytterligare fluorescerande etiketter. Denna analys är anpassningsbar för att studera mer komplexa sfäroider genom att lägga till olika typer av celler och använda multiplexerade fluorescerande sonder för att särskilja dessa celltyper och specifika fluorescerande markörer för att koppla dem till pågående cellulära händelser 4,5. Protokollet kan anpassas till alla HC-kameror och bilderna kan analyseras med vilken bildanalysprogramvara som helst som innehåller en texturanalysmodul.
En viktig aspekt av vikten av detta protokoll är användningen av sfäroider. Därför måste ett antal parametrar beaktas. Det är känt att celler i 3D-odling uppvisar ett försvagat svar på föreningar jämfört med celler odlade i monolager21,22. Användningen av 2D-cellkulturer gör det inte möjligt att förutsäga det effektiva koncentrationsintervallet för ett testat medel i hela organismen. När vi satte upp vår 3D-modell testade vi högre koncentrationer och E:T-förhållanden än de som rapporterats i 2D. Till exempel optimerades protokollet genom att öka E:T-förhållandet från 2:1 som användes i vår 2D ADCC-analys17 till 20:1 för cancersfäroiderna. Logiken bakom detta kan vara att läkemedlen inte effektivt kunde tränga in i sfäroidernas kärna och främst påverkade cellerna i de yttre lagren. Å andra sidan ökade koncentrationen av trastuzumab inte ytterligare ADCC-svaret (tilläggsfigur S1). Det här valet kan skilja sig åt mellan cellinjer och mål. Således skulle det vara intressant att testa detta protokoll på andra cellinjer, t.ex. en icke-HER2 BC-cellinje, med hänsyn till att HER2-uttrycksnivån är en viktig determinant för ADCC-svaret20.
Sammanfattningsvis representerar vår nya metod en snabb och robust plattform för att analysera effekten av substanser i en 3D-immuncancermodell med potential att användas för läkemedelsscreening med hög kapacitet. Detta belyser relevansen av att använda HER2+ BC-sfäroider och NK92. CD16-celler för att ytterligare förbättra förståelsen av de molekylära mekanismerna för trastuzumab, vilket ger en möjlighet att förutse effektiviteten av Trastuzumab-beroende ADCC i den terapeutiska potentialen in vivo27. Jakten på nya immunmodulatorer mot tumörer kan dra stor nytta av denna analys. Metoden kan utvidgas till individanpassad kemosensitivitetstestning av tumörcellkulturer från patienter. Vi har visat att de traditionella 2D-samkulturerna som används vid avdödande av immunceller och ADCC-tester kan omvandlas till 3D-sfäroidanalyser, vilket potentiellt ökar deras translationella relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna uppgav att det inte förelåg några intressekonflikter.
Acknowledgments
LV fick finansiering från det nationella forsknings-, utvecklings- och innovationskontorets anslag GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 och K147482. Detta projekt har fått finansiering från HUN-REN Hungarian Research Network. CD16.176V.NK-92-celler erhölls från Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphia, PA, på uppdrag av Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), skyddas av patent över hela världen och licensierades av Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Författarna är tacksamma mot György Vereb och Árpád Szöőr för deras hjälp med användningen av NK-92-cellinjen och TR-F(ab')2 och för teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
References
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155 (2022).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293 (2017).
- Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects. Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926 (2022).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. 3D culture systems for exploring cancer immunology. Cancers (Basel). 13 (1), 56 (2020).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103 (2016).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Front Immunol. 11, 603640 (2020).
- Li, Y., et al. Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more. Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315 (2021).
- Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105 (2019).
- Sun, Y. S., et al. Risk factors and preventions of breast cancer. Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).
- Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan. BMC Cancer. 22 (1), 849 (2022).
- Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. Breast cancer treatments: Updates and new challenges. J Pers Med. 11 (8), 808 (2021).
- Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond. NPJ Breast Cancer. 6, 10 (2020).
- Musolino, A., et al. Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy. J Immunother Cancer. 10 (1), e003171 (2022).
- Petricevic, B., et al. Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients. J Transl Med. 11, 307 (2013).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Barok, M., et al. Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor. Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).
- Toth, G., et al. The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).
- Ehlers, F. aI., et al. ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response. Cancers (Basel). 13 (13), 3232 (2021).
- Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. 3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response. BMC Cancer. 16, 345 (2016).
- Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro. Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).
- Selis, F., et al. Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen. Int J Mol Sci. 17 (4), 491 (2016).
- Johnston, R. L., et al. High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations. Breast Cancer Res. 18 (1), 18 (2016).
- Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning. J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).
- Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer. SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
