Summary
Phage- en Robotics-assisted Near-continuous Evolution (PRANCE) is een techniek voor snelle, robuuste eiwitevolutie. Robotica maakt de parallellisatie van experimenten, real-time monitoring en feedbackcontrole mogelijk.
Abstract
Robotica-versnelde evolutietechnieken verbeteren de betrouwbaarheid en snelheid van evolutie met behulp van feedbackcontrole, waardoor de resultaten van evolutie-experimenten met eiwitten en organismen worden verbeterd. In dit artikel presenteren we een gids voor het opzetten van de hardware en software die nodig zijn om Phage- en Robotics-assisted Near-continuous Evolution (PRANCE) te implementeren. PRANCE combineert snelle, op fagen gebaseerde moleculaire evolutie met de mogelijkheid om honderden onafhankelijke, feedbackgestuurde evolutie-experimenten tegelijkertijd uit te voeren. Dit document beschrijft de hardwarevereisten en -instellingen voor PRANCE, waaronder een vloeistofbehandelingsinstrument, een plaatlezer, hulppompen, verwarmers en 3D-geprinte containers. We beschrijven hoe u de vloeistofbehandelingsrobot kunt configureren om compatibel te zijn met op Python gebaseerde open-source software. Ten slotte geven we suggesties voor de eerste twee experimenten die kunnen worden uitgevoerd met een nieuw gebouwd PRANCE-systeem dat zijn mogelijkheden uitoefent en valideert dat het systeem klaar is om multiplexed evolutie uit te voeren. Deze gids is bedoeld als een handboek voor het navigeren door de aanzienlijke apparatuuropstelling die gepaard gaat met het uitvoeren van robotica-versnelde evolutie.
Introduction
PRANCE is een combinatie van twee krachtige gerichte evolutietechnieken. De eerste is PACE1, een moleculaire techniek die rondes van gendiversificatie en -selectie koppelt aan de snelle levenscyclus van de M13-bacteriofaag, waardoor snelle evolutierondes continu kunnen plaatsvinden in vloeibare faagcultuur. Deze selectie wordt gedreven door het gebruik van een plasmide-gecodeerd gencircuit dat de functie van het evoluerende eiwit koppelt aan de expressie van pIII, het staartvachteiwit van M13, dat nodig is voor faagvoortplanting, dit wordt geïllustreerd in figuur 1. Op experimenteel niveau maakt continue verdunning van de vloeibare faagcultuur continue selectie mogelijk. De selectiestrengheid kan dus zowel op het niveau van het genencircuit als op experimenteel niveau worden gemoduleerd door de verdunningssnelheid van de faagcultuur te regelen. PACE kan daarom worden toegepast op elke uitdaging op het gebied van biomolecuultechniek waarvoor er een moleculaire sensor is die de gewenste activiteit in E. coli-bacteriën kan detecteren om pIII-expressie te induceren. Toepassingen zijn onder meer de evolutie van eiwit-eiwitbinding 2,3,4, eiwit-DNA-binding5, eiwitoplosbaarheid6 en tal van specifieke enzymatische functies7. Ten tweede is er Robotics-accelerated Evolution 8,9, dat een feedbackcontroller gebruikt om twee veelvoorkomende faalmodi van gerichte evolutie te elimineren: extinctie, die optreedt wanneer de omgeving te streng is, en gebrek aan evolutie, die optreedt wanneer de omgeving te mild is. In tegenstelling tot het seriële passeren van fagen zoals gedaan in PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, omvat robotica-versnelde "bijna-continue" evolutie snel pipetteren dat culturen in het midden van de logfase houdt, waardoor populaties continue cycli van infectie en voortplanting kunnen ervaren. Wanneer deze twee technologieën samen worden gebruikt, worden ze PRANCE genoemd, wat staat voor Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution8, dat robuuste, gemultiplexte en snelle continue evolutie mogelijk maakt. PRANCE is gebruikt om polymerasen, tRNA's en amino-acyl-tRNA-synthetasen te ontwikkelen en om feedbackcontrole uit te voeren tijdens die evoluties om hun snelheid en betrouwbaarheid te verbeteren8.
Er zijn verschillende details van de hardware- en software-installatie voor PRANCE die het gebruik van bacteriofagen op een vloeistofbehandelingsrobot mogelijk maken. In plaats van standaardsoftware te gebruiken die door de robotfabrikant wordt geleverd, gebruiken we een op python gebaseerd open-source softwarepakket11, dat een snelle, gelijktijdige uitvoering mogelijk maakt en dus de mogelijkheid om de semi-continue bioreactoren in het midden van de logfase te houden. De hands-off-tijd van de onderzoeker kan worden verlengd tot enkele dagen door verschillende componenten aan dek routinematig zichzelf te laten steriliseren, en dit wordt bereikt met automatische besturing van pompen die deze componenten kunnen bleken en spoelen. Kruisbesmetting van fagen kan worden geëlimineerd door het gebruik van een vloeistofbehandelingsrobot die geen gebruik maakt van force-fit-tips en een zorgvuldige aanpassing van de instellingen voor vloeistofbehandeling.
Protocol
1. Hardware-installatie
OPMERKING: Zie afbeelding 2 voor een overzicht van de hardwarecomponenten van een PRANCE-systeem en afbeelding 3 voor foto's van deze componenten die fysiek zijn gemonteerd.
- Zorg voor de primaire hardware voor het PRANCE-systeem, inclusief een vloeistofbehandelingsinstrument, een plaatlezer en hulppompen.
OPMERKING: Alle PRANCE-systemen tot nu toe zijn geïmplementeerd op middelgrote tot grote vloeistofbehandelingsinstrumenten die zijn uitgerust met een 8-kanaals, individueel adresseerbare pipetteerarmen, een pipetteerarm met één zuiger en 96 punten, een robotgrijper voor bewegende platen, een geïntegreerd wasstation voor sterilisatie van de tip en een geïntegreerde plaatlezer die absorptie- en luminescentiemetingen kan uitvoeren. - Configureer de verwarmingsstrategieën afhankelijk van het model en de kenmerken van de vloeistofbehandelingsrobot. Gebruik een verwarmde platendrager of een door verwarming gemedieerde robotklimaatregeling.
- Richt een tip-wash-station op om hergebruik van de tip mogelijk te maken.
OPMERKING: Tot op heden hebben PRANCE-systemen kant-en-klare wasstations gebruikt, hoewel dit onderdeel in principe gemakkelijk uit goedkope componenten kan worden opgebouwd. - Creëer een bron van bacteriecultuur die in de log-fase wordt gehandhaafd door een real-time bioreactor op te zetten die op 37 °C draait als een chemostaat/turbidostat. U kunt ook een bacteriecultuur in logfase van ten minste 1 l volume in een nabijgelegen koelkast bij 37 °C in logfase (OD600 tussen 0,25 en 0,45) bij 4 °C stoppen. Zorg ervoor dat de cultuur, gekoeld of warm, regelmatig wordt geroerd met behulp van een schudplaat of roerplaat om bezinking te voorkomen.
- Configureer de voorkeurspompen voor robotintegratie met de benodigde software en stuurprogramma's. Implementeer de software om de pompen in staat te stellen gedefinieerde hoeveelheden vloeistof in de orde van grootte van 10-100 ml te leveren.
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor pompen die in deze implementatie worden gebruikt en de website van de fabrikant voor software die wordt gebruikt om deze pompen te bedienen en documentatie over hoe ze te configureren. Dergelijke software voor de pompen die worden gebruikt in de PRANCE-opstelling die in dit manuscript wordt geïllustreerd, wordt open source geleverd in de volgende GitHub-repository https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE vereist ten minste een spruitstuk met drie pompen dat in staat is om drie afzonderlijke kanalen te pompen (bacteriën afleveren in bacteriereservoir, bleekmiddel leveren aan bacteriereservoir en bacteriereservoir afvoeren naar afval), met de snelheid van elk afzonderlijk gekalibreerd en gecontroleerd. In het verleden hebben mensen aquariumpompen en hydrocultuurpomparrays gebruikt, hoewel in principe elke python-bestuurbare peristaltische pomp kan worden gebruikt. Essentiële functies zijn onder meer de mogelijkheid om een robotgrijper te gebruiken om platen in of uit de lezer over te brengen, om een plaatlezermeting te starten en om toegang te krijgen tot metingen. - 3D-Print de vereiste aangepaste dekcomponenten voor het PRANCE-systeem, inclusief ten minste het bacteriële reservoir/distributiespruitstuk ("wafel"), zoals te vinden in aanvullend bestand 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Zet deze containers vast op het dek en kalibreer hun posities met behulp van standaard Liquid Handling Robot-software. Sluit het reservoir aan op de pomparray.
NOTITIE: Raadpleeg de documentatie van de fabrikant van de robot voor meer informatie over het uitvoeren van de kalibratie, aangezien dit afhankelijk is van de robot. Op hars gebaseerde 3D-printers zijn het meest geschikt; een voorbeeld van het gebruikte printertype wordt gegeven in de Materiaaltabel; Standaard doorzichtige hars werd gebruikt met de standaard printerinstellingen. - Rust het systeem uit met een afvoer die compatibel is met de lokale bioveiligheidsaanbevelingen.
- Plaats laboratoriumbenodigdheden op het dek van de Liquid Handling Robot, zoals geïllustreerd in afbeelding 4.
- Volg de standaard veiligheidsprocedures, inclusief het gebruik van standaard persoonlijke beschermingsmiddelen voor laboratoria (d.w.z. laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).
2. Voorbereiding van de software
- Installeer open-source software die wordt gebruikt voor het besturen van Liquid Handling-robots met python11, beschikbaar in de open-source PyHamilton-repository. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- Wijzig en kalibreer het decklay-outbestand voor de Liquid Handling-robotsoftware om de posities van de laboratoriumartikelen op het robotdeck nauwkeurig weer te geven, zoals weergegeven in afbeelding 4.
OPMERKING: De hier gebruikte opstelling maakt gebruik van de software die wordt geleverd door de fabrikant van de vloeistofbehandelingsrobot, volgens de meegeleverde documentatie. - Voer het PRANCE-robotmethodeprogramma uit in de simulatiemodus.
- Open de opdrachtregel met de volgende opdrachten (in het Windows-besturingssysteem), zoals weergegeven in afbeelding 5.
Windows-toets + R
Enter: cmd - Wijzig de bovenliggende map in de map van het robotmethodeprogramma. Voer een commando in zoals hieronder met het juiste pad, zoals weergegeven in afbeelding 5.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Roep het robotmethodeprogramma met Python aan met de vlag van de simulatiemodus, zoals weergegeven in afbeelding 5.
py robot_method.py --simuleren - Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Robot Run Control-venster dat wordt geopend wanneer het programma wordt uitgevoerd (Figuur 5).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de PRANCE-methode zonder fouten in de simulatie kan worden uitgevoerd voordat u verder gaat. Het wordt duidelijk of het script in staat is om in simulatiemodus zonder fouten te werken, omdat het meerdere lussen van het hoofdprogramma zal voltooien zonder dat de foutafhandeling van het systeem wordt aangeroepen, waardoor de hoofdprogrammalus wordt beëindigd.
- Open de opdrachtregel met de volgende opdrachten (in het Windows-besturingssysteem), zoals weergegeven in afbeelding 5.
- Voer het PRANCE-robotmethodeprogramma uit met de simulatiemodus uitgeschakeld.
- Open de opdrachtregel in de juiste map (Figuur 5).
Windows-toets + R
Enter: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Roep het robotmethodeprogramma aan met Python zonder vlaggen:
py robot_method.py - Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Robot Run Control-venster dat wordt geopend wanneer het programma wordt uitgevoerd.
- Controleer of PyHamilton het instrument kan besturen en ervoor kan zorgen dat het wordt geïnitialiseerd.
- Open de opdrachtregel in de juiste map (Figuur 5).
- Breng real-time gegevenssynchronisatie tot stand.
OPMERKING: Tot op heden hebben PRANCE-systemen netwerkcomputers gebruikt waarmee gebruikers de logbestanden en real-time meetgrafieken van plaatlezers kunnen volgen via software voor het delen van bestanden op afstand of via een extern bureaublad. - Schakel automatische updates uit.
3. Voorbereiding voor de run
- Zorg ervoor dat er bacteriekweekbronnen in de logfase beschikbaar zijn voor alle culturen die nodig zijn voor de geplande run en dat ze actief worden geroerd om sedimentatie te voorkomen. Gebruik een actieve chemostaat/turbidostaat of een door groei gestopte gekoelde voorgekweekte cultuur.
- Werk het manifestbestand van de controller bij met de details van welk volume (bereik 0-500 μL) van welke bacteriecultuur per programmacyclus in elke put van de lagune met 96 putjes moet worden gepompt. Dit maakt een nauwkeurige controle van de effectieve verdunningssnelheid van de lagune mogelijk. Dit is te zien in figuur 6.
- Bereken de verdunningssnelheid van de lagune met behulp van de DilutionCalculator.xlsx spreadsheet (geleverd als aanvullend bestand 2), zoals te zien is in figuur 7.
- Werk het robot_method.py bestand bij met de beoogde lagunehoogte. Om dit protocol te volgen, gebruikt u 14 (in millimetereenheden ) als de standaardwaarde voor de variabele fixed_lagoon_height in het programma. Dit komt overeen met een lagunevolume van 550 μL op het systeem, maar kan verschillen afhankelijk van de specifieke plaat met 96 diepe putten die wordt gebruikt.
- Plaats schone, gefilterde pipetpunten op het robotdek in de daarvoor bestemde posities en plak de tiprekken vast aan de tiphouders om stabiliteit tijdens de run te garanderen.
- Plaats schone platen met een diepe put van 96 op het robotdek op de daarvoor bestemde posities.
- Plaats schone leesplaten met 96 putjes op het robotdek op de daarvoor bestemde posities.
- Zorg ervoor dat de plaatlezerlade niet wordt ingenomen door een reeds bestaande plaat.
- Zorg ervoor dat pompen zijn aangesloten op de computer en aan het juiste adres zijn toegewezen.
- Reinig de pompleidingen door de pompen te activeren om bleekmiddel en vervolgens water te pompen.
- Sluit pompleidingen aan op de juiste bronnen en uitgangen en let er goed op dat de juiste leidingen worden aangesloten op de relevante bacterieculturen.
- Vul tanks/emmers met bleekmiddel/water bij voor het wassen van het bacteriereservoir en de pipetpunt.
- Zorg ervoor dat alle componenten aan dek, met name mobiele elementen, zijn gestabiliseerd in de daarvoor bestemde posities.
- Activeer de verwarmingstoestellen volgens de lokale implementatie tot de doeltemperatuur (d.w.z. 37 °C; Figuur 8).
- Voer het bestand van het UV-sterilisatieprotocol gedurende 10 minuten uit om de ingebouwde UV-sterilisatielamp in de vloeistofbehandelingsrobots te bedienen, zoals geleverd door de fabrikant (Afbeelding 9).
- Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Robot Run Control-venster dat wordt geopend wanneer het programma wordt uitgevoerd.
- Voer het bestand 600 s uit met de optie geparametriseerd.
- Zorg ervoor dat de Robot Run Control-software is gesloten.
OPMERKING: Het robotmethodeprogramma loopt vast als er bestaande exemplaren van de Run Control-software actief zijn.
4. Hardware- en software-integratie
- Voer een 'waterrun' uit, waarbij het PRANCE-robotmethodeprogramma 's nachts wordt uitgevoerd met watervervanging voor alle culturen en natte reagentia.
NOTITIE: Deze test kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.- Voltooi de voorbereiding voorafgaand aan de run zoals hierboven beschreven met de controller_manifest en robot_method die zijn ingesteld voor een effectieve verdunningssnelheid van de lagune van 1 volume/uur , zoals weergegeven in figuur 5 en figuur 6.
- Sluit de 'bacteriën in'-lijn aan op een bak met water om de bacteriën in de logfase te vervangen voor de waterloop.
NOTITIE: Kleurstof kan aan de waterbronnen worden toegevoegd om de beweging van vloeistoffen door het experiment te volgen. - Open de opdrachtregel in de juiste map.
- Roep het robotmethodeprogramma met Python aan met de nieuwe run-vlag (py robot_method.py --new) en voer de gevraagde argumenten in, inclusief de naam van het logbestand (TestRun), het aantal laguneputten (16), de cyclusduur (30), het aantal cycli per lezerplaatmeting (4) en het inductorvolume (het inductervolume is 0 μL voor deze testrun, tijdens een evolutie waarbij mutagenese wordt geïnduceerd met arabinose, kan deze waarde 10 μL zijn), zoals weergegeven in figuur 5.
- Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Robot Run Control-venster dat wordt geopend wanneer het programma wordt uitgevoerd zodra argumenten zijn opgegeven.
OPMERKING: De PRANCE-methode kan worden gestart met behulp van een lege laguneplaat en het vloeibare volume van de lagunes zal in de eerste zes cycli in evenwicht zijn met het uiteindelijke volume.
- Voer een 'bacteria-only run' uit, waarbij het PRANCE-protocol 's nachts alleen wordt uitgevoerd met bacteriecultuur op doeltemperatuur, maar zonder bacteriofaag.
- Voltooi de voorbereiding voorafgaand aan de run zoals hierboven beschreven met de controller_manifest en robot_method die zijn ingesteld voor een effectieve verdunningssnelheid van de lagune van 1 volume/uur, zoals weergegeven in figuur 5 en figuur 6. Zorg ervoor dat de kachels zijn ingeschakeld voor een doeltemperatuur van 37 °C.
- Sluit de 'bacteriën in'-lijn aan op de geselecteerde bron van log-fase bacteriën.
- Open de opdrachtregel in de juiste map.
- Roep het robotmethodeprogramma met Python aan met de nieuwe run-vlag (py robot_method.py --new) en voer de gevraagde argumenten in, zoals eerder beschreven in paragraaf 4.1.4.
- Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Robot Run Control-venster dat wordt geopend wanneer het programma wordt uitgevoerd zodra de argumenten zijn opgegeven.
- Voer een 'infectietest' uit, waarbij fagen met een geëvolueerd eiwit worden uitgedaagd om zich voort te planten op bacteriën die dat eiwit nodig hebben.
OPMERKING: Bepaal van tevoren welke lagunes zullen worden geënt met fagen en welke lagunes niet zullen worden geënt en dus zullen dienen als lagunes zonder faagcontrole om kruisbesmetting te detecteren.- Voltooi de voorbereiding voorafgaand aan de run zoals hierboven beschreven met de controller_manifest en robot_method ingesteld voor een effectieve verdunningssnelheid van 1 volume/uur, zoals weergegeven in figuur 5 en figuur 6. Zorg ervoor dat de kachels zijn ingeschakeld voor een doeltemperatuur van 37 °C.
- Sluit de 'bacteriën in'-lijn aan op de geselecteerde bron van log-fase bacteriën.
- Open de opdrachtregel in de juiste map.
- Roep het robotmethodeprogramma met Python aan met de nieuwe run-vlag (py robot_method.py --new) en voer de gevraagde argumenten in zoals eerder beschreven in paragraaf 4.1.4.
- Selecteer de PLAY-knop in de linkerbovenhoek van het Robot Run Control-venster dat wordt geopend wanneer het programma wordt uitgevoerd zodra argumenten zijn opgegeven.
- Voordat u bacteriofaag toevoegt, voert u de methode 2-3 uur uit om het volume en de OD van bacteriën in de laguneplaten in evenwicht te brengen.
- Inoculeer de with-faaglagunes met 106 pfu/ml bacteriofaag aan het einde van een run-cyclus wanneer het programma slaapt (bijv. 5,5 μL faagaliquot bij 108 pfu/ml, zoals bepaald door plaquetest of qPCR), in een lagune van 550 μL.
- Voer het programma 's nachts uit en controleer vervolgens de faagtiter in de laguneputten door middel van plaquetest of qPCR.
Representative Results
Resultaten infectietest
Deze test zal problemen aan het licht brengen met bacteriecultuur, het klonen en titer van fagen, temperatuurstabiliteit van de apparatuur, instellingen voor vloeistofverwerking en integratie van plaatlezers. Een succesvolle faaginfectietest zal een duidelijke en snelle faaginfectie aan het licht brengen in lagunes die zijn geïnoculeerd met faag, en geen signaal in lagunes zonder faag. Figuur 10 toont enkele representatieve resultaten van een faaginfectietest. De experimentele resultaten kunnen ook worden vergeleken met de figuren 1d en 1c van dit PRANCE-artikel8, afhankelijk van de vraag of een "hot PRANCE" (gevoed door een levende bacteriële turbidostat) of "cool PRANCE" (gevoed door gekoelde mid-log fasecultuur) configuratie wordt toegepast. Deze test kan verschillende veelvoorkomende problemen aan het licht brengen. Problemen met de bereiding van bacterieculturen kunnen vaak leiden tot een zwakke of afwezige infectie. Bacteriën kunnen alleen optimaal worden geïnfecteerd door M13-faag als ze zich in het midden van de logfase en bij 37 °C bevinden. Bij andere temperaturen en groeistadia vertonen ze een zwakkere pilusexpressie en zijn ze dus minder vatbaar voor faaginfectie12. Inoculatie met faag met lage titer of faag met ruggengraatmutaties kan leiden tot een vertraagd of afwezig signaal. Problemen met de versterkingsinstellingen van de plaatlezer voor fluorescentie of luminescentie zullen door deze test aan het licht komen.
Figuur 1: Schema van het genetische circuit dat in werking is tijdens de infectietest van het PRANCE-apparaat. Wanneer T7-RNA-polymerase, gecodeerd op het faaggenoom, de Escherichia coli-gastheer infecteert, wordt het getranscribeerd en bindt het zich aan het AP bij de T7-promotor, wat leidt tot transcriptie van het pIII-faageiwit en luxAB-eiwit, wat op zijn beurt de faagvoortplanting en productie van luminescentie vergemakkelijkt. Afkortingen: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; AP = accessoire plasmide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een schema van de fysieke componenten van het PRANCE-systeem. Een koelkast bewaart geroerde culturen, die vervolgens door een reeks pompen naar het robotdek worden verplaatst, naar het bacteriële reservoir, 'de wafel'. De vloeistofbehandelingsrobot wordt gebruikt om bacterieculturen van "de wafel" te verplaatsen met behulp van de pipetteerkop naar de opslagputten om op te warmen tot incubatietemperatuur, en vervolgens naar de lagunes waar de hoofdincubatie plaatsvindt. Zowel de opslagputten als de lagunes zijn standaard 2 ml deep-well platen. De robot neemt monsters in leesplaten voor eenmalig gebruik, die op hun beurt naar een plaatlezer worden verplaatst voor meting. Afkorting: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het PRANCE-robotapparaat. (A) PRANCE-opstelling. (I) HEPA-filter en externe verwarming. (II) Kweek koelkast. (III) Hoofdbehuizing van de robot. (IV) Plaatlezer. (V) Pompen en tanks. (B) Robotbehuizing. (VI) Pompen voor de hoofdcultuur. (VII) Water-, afval- en bleekwatertanks. VIII) Ruitensproeierpompen. (C) Robotbehuizing. (IX) Robotpipetteerarm en grijper. (X) Pipetpunten. (XI) 3D-geprinte component om de kweekverdeling op de robot ("de wafel") mogelijk te maken. XII) Platen voor bemonstering in de plaatlezer. (XIII) Emmers voor het wassen van de puntjes. (XIV) "Lagunes": cultuurvaten waar evolutionaire cultivatie plaatsvindt. Afkortingen: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; HEPA = hoogrenderende fijnstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Dek lay-out. (A) 3D-weergave van de deck layout in de robotbesturingssoftware. (B) Foto van de onderdelen van het dek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Screenshot van de opdrachtregel met voorbeeldparameters (hierboven) en besturingssoftware uitvoeren (hieronder). De afspeelknop bevindt zich linksboven en kan worden aangeklikt met een muis of worden bediend met een touchscreen, afhankelijk van de lokale implementatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Het manifestbestand van de controller zoals geconfigureerd voor testruns. Lagunes met cultuur #0 zouden zich in kolommen 1 en 3 van de 96-deep-well plaat bevinden. De overige kolommen zouden leeg zijn. Rijen A, B, D en E van de 96-deep-well-plaat zijn in de rechterkolom gemarkeerd voor infectie door faag (1), de andere rijen (0) zijn no-faagcontroles. Dit exemplaar van het controllermanifest zou ertoe leiden dat het programma de lagune elke cyclus verdunt met 210 μL cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Berekening van de effectieve verdunningssnelheid van de lagune met behulp van de DilutionCalculator Spreadsheet. Zie Supplemental File 2 voor de DilutionCalculator Spreadsheet. Zoals te zien is in deze figuur, komt een lagune van 550 μL die elke cyclus van 30 minuten wordt verdund met 210 μL verse cultuur, waarbij om de vier cycli monsters van 150 μL worden genomen voor het meten van de lezerplaat, overeen met een effectieve verdunningssnelheid van 1,0 lagunevolumes/uur (na elke 1 uur blijft 50% van de oorspronkelijke lagunevloeistof aan het begin van het uur over) Klik hier om een grotere versie hiervan te bekijken cijfer.
Afbeelding 8: Robot verwarmingssysteem. De kachel wordt geactiveerd door de stekker in het stopcontact te steken, zoals aangegeven door de rode cirkel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Instellingen van het UV-ontsmettingsprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Een meting van een infectietest die is uitgevoerd op het PRANCE-systeem. Tijdens de run worden monsters genomen en metingen van de luminescentie en absorptie uitgevoerd. Voor elke lagune worden de luminescentiemetingen gedeeld door de overeenkomstige extinctiemeting en uitgezet als functie van de tijd. De lagunes die zijn geïnfecteerd met faag zijn groen gekleurd, terwijl de niet-geïnfecteerde controlelagunes zwart zijn gekleurd. Afkorting: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: STL-bestand voor het 3D-printen van de vereiste aangepaste dekcomponenten voor het PRANCE-systeem, inclusief ten minste het bacteriële reservoir/verdeelspruitstuk ("wafel". Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: DilutionCalculator Spreadsheet. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Ondanks inspanningen om apparatuur te standaardiseren, zal praktisch gezien elke PRANCE-opstelling anders zijn als gevolg van veranderingen in de levering van apparatuur, hardware en softwareversies. Als gevolg hiervan vertoont elke PRANCE-installatie unieke installatie-uitdagingen, die een uitgebreid begrip vereisen van het doel van elk onderdeel voor effectieve modulaire probleemoplossing.
Deze methode schetst een stapsgewijs protocol voor het opzetten en testen van een gevestigd PRANCE-systeem. We richten ons eerst op de kritieke elementen van de hardware en software en beschrijven vervolgens de essentiële stappen om een reeks testruns voor te bereiden en uit te voeren, die vaststellen dat het systeem klaar is voor PRANCE.
Een essentieel kenmerk van de hardware is optimalisatie om het risico op kruisbesmetting van monsters tijdens multiplex-experimenten met bacteriofaag te verminderen. Het wordt aanbevolen om uitsluitend gefilterde tips te gebruiken met robottiptechnologie die compatibel is met hergebruik van tips en waarvan wordt gedacht dat deze aerosolen die worden geproduceerd tijdens het uitwerpen van de tip minimaliseren door geforceerde tips te vermijden. Robuust wassen van de tip volgens dit protocol maakt hergebruik van de tip mogelijk, hoewel de geschiktheid hiervan moet worden gevalideerd als onderdeel van de infectietest op elk systeem. Zelfsterilisatie is ook afhankelijk van een constante toevoer van water en bleekmiddel voor het systeem. Deze worden opgeslagen in tanks/emmers en als ze leeg zijn, zullen ze resulteren in verminderde zelfsterilisatie en snelle kruisbesmetting. Er kunnen foto's worden gemaakt van de tanks/emmers die voor en na het programma zijn gemaakt om de snelheid te benchmarken waarmee de wasapparatuur water en bleekmiddel verbruikt, gegeven een bepaalde pompopstelling.
Een ander belangrijk element van het systeem is het handhaven van de groeifase en temperatuur van bacteriën. PRANCE-experimenten worden uitgevoerd met behulp van de S2060 E. coli-bacteriestam (Addgene: #105064). Dit is een van K12 afgeleide F-plasmide-bevattende stam die is geoptimaliseerd om biofilms te verminderen7. Bovendien is het F-plasmide in deze stam bewerkt met de toevoeging van een tetracycline-resistentiecassette voor plasmide-onderhoud, luxCDE en luxR als aanvulling op luxAB-gemedieerde luminescentiemonitoring, evenals lacZ onder de faagschokpromotor om colorimetrische visualisatie van plaques mogelijk te maken. De F-plasmide-gecodeerde F-pilus is nodig voor M13-faaginfectie. Bacteriën die in PACE worden gebruikt, moeten daarom worden gekweekt bij 37 °C en in het midden van de logfase wanneer de F-pilus12 tot expressie wordt gebracht en M13-faaginfectie, voortplanting en evolutie mogelijk zijn. Voor statische temperatuurregeling kan een kant-en-klare verwarmde platendrager worden gebruikt. Een alternatief is het simpelweg verwarmen van de lucht die in het HEPA-filter gaat met behulp van goedkope kachels, hoewel dit niet wordt aanbevolen omdat dit kan leiden tot versnelde slijtage van de hardware. Bovendien versnelt dit de verdamping van extra vloeistoffen aan dek, zoals de bleek-/wateremmers en inductor, wanneer deze worden gebruikt.
Kalibratie van de softwarepakketten is ook essentieel voor een goede werking van het systeem. Verschillen tussen de lay-out van het softwaredek en het eigenlijke robotdek zijn de meest voorkomende oorzaak van systeemstoringen tijdens het gebruik. Regelmatige kalibratie van de hulppompen die bacteriecultuur, bleekmiddel en afvoer van het systeem leveren, is van vitaal belang, aangezien het gebruik van peristaltische pompen kan leiden tot slijtage van slangen en veranderingen in het vloeistofvolume.
De waterlooptest zal snel een aantal veelvoorkomende installatieproblemen aan het licht brengen, waaronder onjuiste instellingen voor vloeistofbehandeling, vloeistoflekken/defecte verbindingen en software-instabiliteit. Een succesvolle waterloop vertoont geen onverwachte vloeistoflekken en loopt 's nachts stabiel en foutloos. Er zijn een aantal veelvoorkomende problemen die zich kunnen voordoen tijdens een waterrun, zoals het niet uitvoeren van bepaalde stappen voor het verwerken van vloeistoffen, het druppelen van pipetten en het stoppen van het protocol halverwege de run. Als bepaalde vloeistofbehandelingsstappen niet worden uitgevoerd, controleer dan of alle vloeistofklassen zijn geïnstalleerd. Deze vermelden de juiste viscositeit en pipetteersnelheden en worden aangepast in de door de fabrikant geleverde robotbesturingssoftware. Als er druppels uit pipetten komen, is het belangrijk dat de instellingen van de robotpipetteerarm correct zijn om schoon pipetteren mogelijk te maken en kruisbesmetting van fagen te voorkomen. Succesvol robotpipetteren vereist, naast de juiste vloeistofklassen, de juiste deklay-outhoogtes van alle laboratoriumartikelen en de juiste pipetteerhoogte-offsets die zijn gespecificeerd in het PRANCE-robotmethodeprogramma. Deze hoogteverschuivingen kunnen direct moeten worden aangepast. Als het protocol halverwege stopt, wordt dit vaak gegenereerd door een breed scala aan fouten die erop wijzen dat het decklay-outbestand mogelijk niet overeenkomt met de werkelijke deckconfiguratie.
De test met alleen bacteriën zal problemen aan het licht brengen met de instellingen van de plaatlezer en real-time gegevensvisualisatie, problemen met een te hoge bleekconcentratie of onvoldoende spoelen, en temperatuurstabiliteit. Een succesvolle run met alleen bacteriën vertoont een evenwicht van de absorptie van de lagune gedurende de eerste drie cycli, gevolgd door een stabiele absorptie voor de duur van de run. Bovendien kan het verschillende veelvoorkomende problemen aan het licht brengen. Dit is de eerste stap waarbij de gegevens die door de plaatlezer worden gegenereerd, worden uitgezet. Gegevens in de database van de plaatlezer worden mogelijk niet correct opgeslagen of niet correct geplot. Als bacteriën er niet in slagen om in evenwicht te komen in hun absorptie, kan dit erop wijzen dat de bleekconcentratie te hoog is. Overmatig bleekmiddel of onvoldoende wassen kan het hele experiment steriliseren, in plaats van alleen het stuk laboratoriumgerei. Als dit wordt vermoed, kunnen bleekstrips worden gebruikt om de lagune te testen. De stabiliteit van de temperatuur van de cultuur kan worden gecontroleerd met een thermometerpistool.
Een succesvolle infectietest geeft aan dat het systeem klaar is voor PRANCE-runs. Een infectietest kan worden uitgevoerd door een subset van lagunes met bacteriecultuur te inoculeren. Deze bacteriën zullen pIII tot expressie brengen wanneer ze worden geïnfecteerd door de juiste faag die het gen voor pIII (ΔgIII) mist, waardoor faagvoortplanting mogelijk is. Een mogelijke combinatie voor testen is het gebruik van S2060-bacteriën die zijn getransformeerd met een plasmide die pIII tot expressie brengt onder de faagschokpromotor met een ΔgIII-faag. We raden aan om ΔgIII-faag te gebruiken met het wildtype T7-RNA-polymerase met S2060-bacteriën getransformeerd met een accessoire plasmide, waarin pIII en luxAB worden aangedreven door de T7-promotor (plasmide pJC173b13), zoals geïllustreerd in figuur 1. Dit maakt het ook mogelijk om de infectie tijdens de testrun met een plaatlezer te monitoren. Definitief bewijs van het succes van de infectietest en het ontbreken van kruisbesmetting zal komen van faagtitering van test- en controlelagunes. Wanneer een luciferase-reporter wordt gebruikt, is een toename van de luminescentie in alleen testputten, zoals te zien is in figuur 3, ook een indicator voor succesvolle faaginfectie en -voortplanting. De gouden standaard voor de kwantificering van faagtiters is de plaquetest7. Er is ook een protocol voor M13-kwantificering door qPCR7 dat mogelijk sneller is, hoewel dit geen onderscheid maakt tussen infectieuze en niet-infectieuze faagdeeltjes en dus titers kan overschatten.
Het hoofdprogramma verwijst naar een manifestbestand, dit is een databasebestand met platte tekst, dat het verdunningsvolume per cyclus van elke vermeerderingscultuur dicteert, evenals de selectie van een willekeurig aantal potentiële bacteriële cultuurgrondstoffen, die kunnen verschillen in selectiestrengheid. Op deze manier definieert het manifestbestand veel van de parameters van de PRANCE-run. Opgemerkt moet worden dat dit bestand tijdens het draaien zowel door de operator als door het systeem kan worden bewerkt, wat betekent dat handmatige of automatische terugkoppelingscontrole kan worden uitgevoerd.
Het nut van een volledig functionerende PRANCE-opstelling ligt in het vermogen om snel grote populaties te laten evolueren in een zorgvuldig bewaakte en gecontroleerde omgeving. Het plaatformaat onderscheidt PRANCE van andere technieken, zoals het gebruik van kleinere kant-en-klare systemen op basis van turbidostat 14,15. De plaatgebaseerde opstelling vergemakkelijkt niet alleen de eenvoudige integratie met extra robotbewerkingsstappen, maar ook de compatibiliteit met andere laboratoriuminstrumenten zoals centrifuges. Bovendien voegt de mogelijkheid om versnelde evolutie gelijktijdig uit te voeren over meerdere instanties een extra dimensie toe aan het experiment, waardoor het vooruitzicht op het bereiken van diverse en robuuste resultaten wordt vergroot. Het granulaire controle- en feedbacksysteem dat integraal deel uitmaakt van PRANCE versterkt de voorspelbaarheid en betrouwbaarheid van het experiment verder en markeert een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van gerichte evolutietechnieken. Deze techniek is echter beperkt in het aantal parallelle experimenten dat het kan uitvoeren. Afhankelijk van de configuratie worden PRANCE-opstellingen meestal beperkt door de snelheid van de robot pipetteeren of door de beschikbare dekruimte.
Dezelfde hardware en software die voor PRANCE worden gebruikt, kunnen ook worden toegepast op evolutiemethoden waarbij geen bacteriofaag betrokken is. Zoals aangetoond in de veel-turbidostatenmethode11, kan ditzelfde instrument uitsluitend worden gebruikt met bacteriën, waardoor adaptieve evolutie-experimenten met het hele genoom mogelijk worden. Dit aanpassingsvermogen verbreedt de reikwijdte van dit instrument en maakt de weg vrij voor nieuwe vormen van robotica-versnelde evolutie.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
We danken Emma Chory en Kevin Esvelt voor hun hulp en advies bij het instellen van hardware en software. Samir Aoudjane, Osaid Ather en Erika DeBenedictis worden ondersteund door de Steel Perlot Early Investigator Grant. Dit werk werd ondersteund door het Francis Crick Institute, dat zijn kernfinanciering ontvangt van Cancer Research UK (CC2239), de UK Medical Research Council (CC2239) en de Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
