Summary
אבולוציה כמעט רציפה בסיוע פאג'ים ורובוטיקה, PRANCE, היא טכניקה לאבולוציה מהירה וחזקה של חלבונים. רובוטיקה מאפשרת הקבלה של ניסויים, ניטור בזמן אמת ובקרת משוב.
Abstract
טכניקות אבולוציה מואצות רובוטיקה משפרות את האמינות והמהירות של האבולוציה באמצעות בקרת משוב, ומשפרות את התוצאות של ניסויים באבולוציה של חלבונים ואורגניזמים. במאמר זה, אנו מציגים מדריך להגדרת החומרה והתוכנה הדרושות ליישום אבולוציה כמעט רציפה (PRANCE) בסיוע פאג'ים ורובוטיקה. PRANCE משלב אבולוציה מולקולרית מהירה מבוססת פאגים עם היכולת להריץ מאות ניסויי אבולוציה עצמאיים מבוקרי משוב בו זמנית. מאמר זה יתאר את דרישות החומרה וההתקנה עבור PRANCE, כולל מכשיר לטיפול בנוזלים, קורא לוחות, משאבות עזר, תנורי חימום ומכלים מודפסים בתלת-ממד. אנו מתארים כיצד להגדיר את רובוט הטיפול בנוזלים כך שיהיה תואם לתוכנת קוד פתוח מבוססת Python. לבסוף, אנו מספקים הצעות לשני הניסויים הראשונים שניתן לבצע עם מערכת PRANCE חדשה שנבנתה לאחרונה המפעילה את יכולותיה ומאמתת שהמערכת מוכנה לבצע אבולוציה מרובה. מדריך זה נועד לשמש כמדריך לניווט במערך הציוד הניכר הקשור לביצוע אבולוציה מואצת רובוטיקה.
Introduction
PRANCE הוא שילוב של שתי טכניקות רבות עוצמה של אבולוציה מכוונת. הראשונה היא PACE1, טכניקה מולקולרית שמחברת סבבי גיוון וברירה של גנים למחזור החיים המהיר של הבקטריופאג' M13, ומאפשרת לסבבי אבולוציה מהירים להתרחש ברציפות בתרבית פאגים נוזליים. הבחירה הזו מונעת על-ידי שימוש במעגל גנים מקודד פלסמיד שמקשר את תפקוד החלבון המתפתח לביטוי של pIII, חלבון מעיל הזנב של M13, הדרוש להפצת פאגים, כפי שמודגם באיור 1. ברמת הניסוי, דילול מתמשך של תרבית הפאגים הנוזליים מאפשר ברירה רציפה. לפיכך ניתן לווסת את קשיחות הברירה הן ברמת מעגל הגנים והן ברמת הניסוי על ידי שליטה בקצב דילול תרביות הפאגים. לכן, PACE יכול להיות מיושם על כל אתגר הנדסת ביומולקולות שעבורו יש חיישן מולקולרי שיכול לזהות את הפעילות הרצויה בחיידקי E. coli כדי לגרום לביטוי pIII. היישומים כוללים אבולוציה של קשירת חלבון-חלבון 2,3,4, קשירת חלבון-דנ"א5, מסיסות חלבונים6, ופונקציות אנזימטיות ספציפיות רבות7. השני הוא Evolution 8,9 המואץ על ידי רובוטיקה, המשתמש בבקר משוב כדי לחסל שני מצבי כשל נפוצים של אבולוציה מכוונת: הכחדה, המתרחשת כאשר הסביבה מחמירה מדי, וחוסר אבולוציה, המתרחשת כאשר הסביבה מקלה מדי. שלא כמו העברה סדרתית של פאגים כפי שנעשה ב-PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, אבולוציה "כמעט רציפה" המואצת על ידי רובוטיקה כוללת פיפטינג מהיר השומר על תרבויות בשלב אמצע הלוג, ומאפשר לאוכלוסיות לחוות מחזורים מתמשכים של זיהום והתפשטות. כאשר משתמשים בשתי טכנולוגיות אלה יחד, הן נקראות PRANCE, עבור Phage and Robotics-assisted Near-Continuous Evolution8, המאפשר אבולוציה רציפה חזקה, מרובבת ומהירה. PRANCE שימש לפיתוח פולימראזות, tRNAs וסינתזות tRNA אמינו-אציל ולביצוע בקרת משוב במהלך אבולוציות אלה כדי לשפר את מהירותם ואמינותם8.
ישנם מספר פרטים על הגדרת החומרה והתוכנה עבור PRANCE המאפשרים שימוש בבקטריופאג' על רובוט לטיפול בנוזלים. במקום להשתמש בתוכנת ברירת מחדל המסופקת על ידי יצרן הרובוט, אנו משתמשים בחבילת תוכנה מבוססת קוד פתוח11 מבוססת פיתון, המאפשרת ביצוע מהיר ומקבילי ובכך את היכולת לשמור על הביוריאקטורים הרציפים למחצה בשלב אמצע הלוג. ניתן להאריך את זמן עבודת החוקר למספר ימים על ידי עיקור עצמי שגרתי של מספר רכיבים על הסיפון, וזה מושג באמצעות בקרה אוטומטית של משאבות שיכולות להלבין ולשטוף רכיבים אלה. ניתן לבטל זיהום צולב בפאגים על ידי שימוש ברובוט לטיפול בנוזלים שאינו משתמש בקצוות התאמה בכוח והתאמה זהירה של הגדרות הטיפול בנוזלים.
Protocol
1. הגדרת חומרה
הערה: ראה איור 2 לקבלת סקירה כללית של רכיבי החומרה של מערכת PRANCE ואיור 3 עבור תמונות של רכיבים אלה שהורכבו פיזית.
- השג את החומרה העיקרית עבור מערכת PRANCE, כולל מכשיר לטיפול בנוזלים, קורא לוחות ומשאבות עזר.
הערה: כל מערכות PRANCE יושמו עד כה במכשירי טיפול בנוזלים בינוניים עד גדולים המצוידים בזרועות פיפטינג בנות 8 ערוצים, הניתנות להתייחסות בנפרד, זרוע פיפטינג בעלת 96 חוד בוכנה יחידה, ידית אחיזה רובוטית להעברת פלטות, תחנת שטיפה משולבת לעיקור חוד וקורא לוחות משולב המסוגל למדדי ספיגה והארה. - הגדר את אסטרטגיות החימום בהתאם לדגם ולתכונות של הרובוט המטפל בנוזלים. השתמש במנשא צלחת מחומם או בבקרת אקלים רובוטית בתיווך תנור.
- הקימו תחנת שטיפת טיפ כדי לאפשר שימוש חוזר בטיפ.
הערה: עד כה, מערכות PRANCE השתמשו בתחנות שטיפה מהמדף, אם כי, באופן עקרוני, רכיב זה יכול בקלות להיות בנוי מרכיבים בעלות נמוכה. - קבע מקור של תרבית חיידקים המתוחזקת בשלב היומן על ידי הגדרת ביוריאקטור בזמן אמת הפועל ב -37 מעלות צלזיוס ככימוסטט / טורבידוסטט. לחלופין, עצרו תרבית חיידקים בשלב היומן בנפח של לפחות 1 ליטר שגודלה מראש ב-37°C בשלב לוג (OD600 בין 0.25 ל-0.45) ב-4°C במקרר סמוך. הקפידו לערבב את התרבית, בין אם היא צוננת או חמה, באופן קבוע באמצעות צלחת שייקר או צלחת ערבוב כדי למנוע שיקוע.
- הגדר את המשאבות המועדפות לשילוב רובוטי עם התוכנה ומנהלי ההתקן הדרושים. ליישם את התוכנה כדי לאפשר למשאבות לספק כמויות מוגדרות של נוזלים בסדר גודל של 10-100 מ"ל.
הערה: עיין בטבלת החומרים עבור משאבות המשמשות ביישום זה ובאתר האינטרנט של היצרן לקבלת תוכנה המשמשת להפעלת משאבות אלה ותיעוד כיצד להגדיר אותן. תוכנה כזו עבור המשאבות המשמשות בהגדרת PRANCE המתוארת בכתב יד זה מסופקת בקוד פתוח במאגר GitHub הבא https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE דורש לפחות סעפת של שלוש משאבות המסוגלת לשאוב שלוש ערוצים נפרדים (להעביר חיידקים למאגר חיידקי, לספק אקונומיקה למאגר חיידקי, ולנקז מאגר חיידקים לפסולת), כאשר המהירות של כל אחד מהם מכויל ומבוקר באופן עצמאי. בעבר, אנשים השתמשו במשאבות מיכלי דגים ומערכי משאבות הידרופוניקה, אם כי, באופן עקרוני, ניתן להשתמש בכל משאבה פריסטלטית הניתנת לשליטה על פיתון. פונקציות חיוניות כוללות את היכולת להשתמש באחיזה רובוטית כדי להעביר לוחות פנימה או החוצה מהקורא, ליזום מדידה של קורא לוחות ולגשת למדידות. - הדפסה תלת-ממדית של רכיבי הסיפון המותאמים אישית הנדרשים עבור מערכת PRANCE, כולל, לכל הפחות, סעפת המאגר/פיזור החיידקים ("וופל"), כפי שנמצא בקובץ משלים 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). אבטח מיכלים אלה על הסיפון וכייל את מיקומם באמצעות תוכנת רובוט סטנדרטית לטיפול בנוזלים. חברו את המאגר למערך המשאבות.
הערה: עיין בתיעוד של יצרן הרובוט לקבלת פרטים על אופן ביצוע הכיול מכיוון שהוא יהיה תלוי ברובוט. מדפסות תלת-ממד מבוססות שרף הן המתאימות ביותר; דוגמה לסוג המדפסת בה נעשה שימוש ניתנת בטבלת החומרים; נעשה שימוש בשרף שקוף סטנדרטי עם הגדרות ברירת המחדל של המדפסת. - ציידו את המערכת בפתח ניקוז התואם את המלצות הבטיחות הביולוגית המקומיות.
- הניחו כלי מעבדה על הסיפון של הרובוט לטיפול בנוזלים כפי שמודגם באיור 4.
- יש להקפיד על נהלי בטיחות סטנדרטיים, כולל שימוש בציוד מגן אישי סטנדרטי למעבדה (כלומר, מעיל מעבדה, כפפות והגנה על העיניים).
2. הכנת תוכנה
- התקן תוכנת קוד פתוח המשמשת לשליטה ברובוטים לטיפול בנוזלים עם Python11, הזמינה ממאגר הקוד הפתוח PyHamilton. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- שנה וכייל את קובץ פריסת הסיפון עבור תוכנת הרובוט לטיפול בנוזלים כדי לשקף במדויק את מיקומי כלי המעבדה בסיפון הרובוט, כפי שמוצג באיור 4.
הערה: ההתקנה המשמשת כאן משתמשת בתוכנה שסופקה על-ידי יצרן הרובוט לטיפול בנוזלים, בהתאם לתיעוד שסופק. - הפעל את תוכנית שיטת הרובוט PRANCE במצב סימולציה.
- פתח את שורת הפקודה עם הפקודות הבאות (במערכת ההפעלה Windows), כפי שמוצג באיור 5.
מקש Windows + R
הזן: cmd - שנה את ספריית האב לספריה של תוכנית שיטת הרובוט. הזן פקודה כמפורט להלן עם הנתיב הנכון, כפי שמוצג באיור 5.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - קראו לתוכנית שיטת הרובוט עם Python עם דגל מצב הסימולציה, כפי שמוצג באיור 5.
py robot_method.py --לדמות - בחר בלחצן PLAY בפינה השמאלית העליונה של חלון בקרת הפעלת הרובוט שייפתח בעת הפעלת התוכנית (איור 5).
הערה: ודא ששיטת PRANCE יכולה לפעול ללא שגיאות בסימולציה לפני שתתקדם. מתברר אם הסקריפט מסוגל לפעול במצב סימולציה ללא שגיאות, מכיוון שהוא ישלים לולאות מרובות של התוכנית הראשית מבלי לקרוא לטיפול בשגיאות של המערכת, מה שמסיים את לולאת התוכנית הראשית.
- פתח את שורת הפקודה עם הפקודות הבאות (במערכת ההפעלה Windows), כפי שמוצג באיור 5.
- הפעל את תוכנית שיטת הרובוט PRANCE כאשר מצב הסימולציה מושבת.
- פתח את שורת הפקודה בספריה המתאימה (איור 5).
מקש Windows + R
הזן: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - התקשר לתוכנית שיטת הרובוט עם Python ללא דגלים:
py robot_method.py - בחר בלחצן PLAY בפינה השמאלית העליונה של חלון בקרת הפעלת הרובוט שייפתח בעת הפעלת התוכנית.
- ודא כי PyHamilton יכול לשלוט במכשיר ולגרום לו לאתחול.
- פתח את שורת הפקודה בספריה המתאימה (איור 5).
- צור סנכרון נתונים בזמן אמת.
הערה: עד כה, מערכות PRANCE השתמשו במחשבים מרושתים המאפשרים למשתמשים לנטר את קבצי יומן הרישום ואת גרפי מדידת קורא הלוחות בזמן אמת באמצעות תוכנת שיתוף קבצים מרוחקת, או באמצעות שולחן עבודה מרוחק. - כבה עדכונים אוטומטיים.
3. הכנה לפני הריצה
- ודא כי מקורות תרבית חיידקים בשלב היומן זמינים עבור כל התרביות הדרושות לריצה המתוכננת וכי הם מעורבבים באופן פעיל כדי למנוע שיקוע. השתמש כימוסטט פעיל / turbidostat או תרבית קירור בקירור עצר צמיחה.
- עדכן את קובץ מניפסט הבקר עם הפרטים של איזה נפח (טווח 0-500 μL) של איזה תרבית חיידקים יש לשאוב לתוך כל באר של לגונת 96 בארות לכל מחזור התוכנית. זה מאפשר שליטה מדויקת בקצב דילול הלגונה האפקטיבי. ניתן לראות זאת באיור 6.
- חשב את קצב הדילול של הלגונה באמצעות הגיליון האלקטרוני DilutionCalculator.xlsx (שסופק כקובץ משלים 2), כפי שניתן לראות באיור 7.
- עדכן את קובץ robot_method.py בגובה הלגונה המיועד. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש ב- 14 (ביחידות מילימטריות ) כערך ברירת המחדל עבור fixed_lagoon_height המשתנה בתוכנית. זה מתאים נפח לגונה של 550 μL על המערכת, אבל עשוי להשתנות בהתאם צלחת 96 עמוק מסוים בשימוש.
- הניחו קצוות פיפטה מסוננים ונקיים על סיפון הרובוט במיקומם המיועד והדביקו את מתלי הקצוות למחזיקי החוד כדי להבטיח יציבות במהלך הריצה.
- הניחו צלחות נקיות בעומק 96 על סיפון הרובוט במיקומים המיועדים לכך.
- הניחו צלחות קריאה נקיות של 96 בארות על סיפון הרובוט במיקומים המיועדים לכך.
- ודא שמגש קורא הצלחות אינו תפוס על ידי צלחת קיימת.
- ודא שהמשאבות מחוברות למחשב ומוקצות לכתובת הנכונה.
- נקו את קווי המשאבה על ידי הפעלת המשאבות לשאיבת אקונומיקה ולאחר מכן מים.
- חברו את קווי המשאבה למקורות וליציאות המתאימים, תוך שימת לב רבה כדי לוודא שהקווים הנכונים מחוברים לתרביות החיידקים הרלוונטיות.
- מילוי מיכלים/דליים המכילים אקונומיקה/מים לשטיפת מיכל חיידקים וקצה פיפטה.
- ודא שכל הרכיבים על הסיפון, במיוחד אלמנטים ניידים, מיוצבים במיקומם המיועד.
- הפעל תנורי חימום בהתאם ליישום מקומי לטמפרטורת היעד (כלומר 37 ° C; איור 8).
- הפעל את קובץ פרוטוקול עיקור UV למשך 10 דקות כדי להפעיל את מנורת העיקור המובנית UV ברובוטים לטיפול בנוזלים כפי שסופקו על-ידי היצרן (איור 9).
- בחר בלחצן PLAY בפינה השמאלית העליונה של חלון בקרת הפעלת הרובוט שייפתח בעת הפעלת התוכנית.
- הפעל את הקובץ עם האפשרות parametrized עבור 600 שניות.
- ודא שהתוכנה Robot Run Control סגורה.
הערה: תוכנית שיטת הרובוט תקרוס אם קיימים מופעים כלשהם של תוכנת Run Control פועלת.
4. שילוב חומרה ותוכנה
- ערכו 'ריצת מים', שבה תוכנית שיטת הרובוט PRANCE מופעלת במשך הלילה עם החלפת מים לכל התרבויות וריאגנטים רטובים.
הערה: ניתן לבצע בדיקה זו בטמפרטורת החדר.- השלימו את ההכנה לפני הריצה כמפורט לעיל עם controller_manifest ו-robot_method שהוגדרו לקצב דילול לגונה אפקטיבי של 1 נפח/שעה כפי שמוצג באיור 5 ובאיור 6.
- חבר את קו 'החיידקים פנימה' למיכל מים כדי להחליף חיידקים בשלב הלוג לזרימת המים.
הערה: ניתן להוסיף צבעי מאכל למקורות המים כדי לעקוב אחר תנועת הנוזלים במהלך הניסוי. - פתח את שורת הפקודה בספריה המתאימה.
- התקשר לתוכנית שיטת הרובוט עם Python עם דגל ההפעלה החדש (py robot_method.py --new) והזן את הארגומנטים המבוקשים, כולל שם קובץ יומן (TestRun), מספר בארות לגונה (16), משך מחזור (30), מספר מחזורים למדידת לוחית קורא (4) ונפח השראה (נפח השראה הוא 0 μL עבור ניסוי זה, במהלך אבולוציה שבה מוטגנזה נגרמת עם אראבינוז, ערך זה עשוי להיות 10 μL), כפי שמוצג באיור 5.
- בחר בלחצן PLAY בפינה השמאלית העליונה של חלון בקרת הפעלת הרובוט שייפתח בעת הפעלת התוכנית לאחר אספקת הארגומנטים.
הערה: ניתן להתחיל בשיטת PRANCE באמצעות לוח לגונה ריק, והנפח הנוזלי של הלגונות יתאזן לנפח הסופי במהלך ששת המחזורים הראשונים.
- בצע "ריצה של חיידקים בלבד", שבה פרוטוקול PRANCE מופעל במשך הלילה רק עם תרבית חיידקים בטמפרטורת היעד אך ללא בקטריופאג'.
- השלימו את ההכנה לפני הריצה כמפורט לעיל עם controller_manifest ו-robot_method שהוגדרו לקצב דילול לגונה אפקטיבי של 1 נפח/שעה, כפי שמוצג באיור 5 ובאיור 6. ודא כי תנורי חימום מופעלים לטמפרטורת יעד של 37 ° C.
- חברו את קו ה'חיידקים פנימה' למקור הנבחר של חיידקי לוג-פאזה.
- פתח את שורת הפקודה בספריה המתאימה.
- התקשר לתוכנית שיטת הרובוט עם Python עם דגל ההפעלה החדש (py robot_method.py --new) והזן את הארגומנטים המבוקשים, כמפורט קודם לכן בסעיף 4.1.4.
- בחר בלחצן PLAY בפינה השמאלית העליונה של חלון בקרת הפעלת הרובוט שייפתח בעת הפעלת התוכנית לאחר אספקת הארגומנטים.
- הפעל "מבחן זיהום", שבו פאגים הנושאים חלבון מפותח מאותגרים להתפשט על חיידקים הזקוקים לחלבון זה.
הערה: החליטו מראש אילו לגונות יחוסנו בפאגים ואילו לגונות לא יחוסנו ובכך ישמשו כלגונות בקרה ללא פאגים לאיתור זיהום צולב.- השלימו את ההכנה לפני הריצה כמפורט לעיל עם controller_manifest ו-robot_method שהוגדרו לקצב דילול אפקטיבי של 1 נפח/שעה, כפי שמוצג באיור 5 ובאיור 6. ודא כי תנורי חימום מופעלים לטמפרטורת יעד של 37 ° C.
- חברו את קו ה'חיידקים פנימה' למקור הנבחר של חיידקי לוג-פאזה.
- פתח את שורת הפקודה בספריה המתאימה.
- התקשר לתוכנית שיטת הרובוט עם Python עם דגל ההפעלה החדש (py robot_method.py --new) והזן את הארגומנטים המבוקשים כמפורט קודם לכן בסעיף 4.1.4.
- בחר בלחצן PLAY בפינה השמאלית העליונה של חלון בקרת הפעלת הרובוט שייפתח בעת הפעלת התוכנית לאחר אספקת הארגומנטים.
- לפני הוספת בקטריופאג', הפעל את השיטה במשך 2-3 שעות כדי לאזן את הנפח ואת החיידקים OD בלוחות הלגונה.
- חסן את לגונות הפאגים עם 106 pfu/mL של בקטריופאג' בסוף מחזור ריצה כאשר התוכנית ישנה (למשל, 5.5 μL של פאג aliquot ב 108 pfu/mL, כפי שנקבע על ידי בדיקת פלאק או qPCR), לתוך לגונה 550 μL.
- הפעל את התוכנית במשך הלילה ולאחר מכן בדוק את titer הפאגים בבארות הלגונה על ידי בדיקת פלאק או qPCR.
Representative Results
תוצאות בדיקת זיהום
בדיקה זו תחשוף בעיות בתרבית חיידקים, שיבוט פאגים וטיטר, יציבות הטמפרטורה של הציוד, הגדרות טיפול בנוזלים ושילוב קורא צלחות. בדיקת זיהום מוצלחת בפאגים תגלה זיהום פאגים ברור ומהיר בלגונות המחוסנות בפאגים, וללא אות בלגונות ללא פאגים. איור 10 מראה כמה תוצאות מייצגות של בדיקת זיהום פאגים. ניתן גם להשוות את תוצאות הניסוי לאיורים 1d ו-1cשל מאמר PRANCE 8 זה, תלוי אם תצורת "PRANCE חם" (מוזן על-ידי טורבידוסטט חיידקי חי) או תצורת "PRANCE קריר" (מוזן על-ידי תרבית צוננת של שלב אמצע הלוג) מיושמת. בדיקה זו עשויה לחשוף מספר בעיות נפוצות. בעיות בהכנת תרבית חיידקים יכולות לעתים קרובות לגרום לזיהום חלש או נעדר. חיידקים יכולים להידבק בצורה אופטימלית בפאג M13 רק כאשר הם נמצאים בשלב אמצע לוג ובטמפרטורה של 37°C. בטמפרטורות אחרות ובשלבי גדילה אחרים, הם מפגינים ביטוי פילוס חלש יותר ולכן הם פחות רגישים לזיהום פאגים12. חיסון בפאגים בעלי טיטר נמוך, או בפאגים עם מוטציות בעמוד השדרה עלול לגרום לעיכוב או להיעדר סיגנל. בעיות עם הגדרות רווח של קורא לוחות עבור פלואורסצנטיות או הארה יתגלו על ידי בדיקה זו.
איור 1: סכמטי של המעגל הגנטי הפועל במהלך בדיקת הזיהום של מכשיר PRANCE. כאשר T7 RNA פולימראז, המקודד על גנום הפאגים, מדביק את המארח Escherichia coli , הוא משועתק ונקשר ל-AP במקדם T7, מה שמוביל לשעתוק של חלבון הפאג pIII וחלבון luxAB, אשר, בתורו, מאפשר התפשטות פאגים וייצור של לומינסנציה. קיצורים: PRANCE = אבולוציה כמעט רציפה בסיוע פאגים ורובוטיקה; AP = פלסמיד אביזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמה של המרכיבים הפיזיים של מערכת PRANCE. מקרר מאחסן תרביות מעוררות, שמועברות לסיפון הרובוט על ידי מערך משאבות, אל מאגר החיידקים, "הוופל". הרובוט המטפל בנוזלים משמש להעברת תרביות חיידקים מ"הוופל" באמצעות ראש הפיפטינג לבארות האחיזה כדי להתחמם לטמפרטורת הדגירה, ולאחר מכן ללגונות שבהן מתרחשת הדגירה העיקרית. גם בארות האחיזה וגם הלגונות הן צלחות באר עומק סטנדרטיות של 2 מ"ל. הרובוט לוקח דגימות לתוך לוחות קורא חד-פעמיים, אשר בתורו מועברים לקורא לוחות למדידה. קיצור: PRANCE = אבולוציה כמעט רציפה בסיוע פאגים ורובוטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: המנגנון הרובוטי PRANCE. (A) הגדרת PRANCE. (I) מסנן HEPA ומחמם חיצוני. (II) מקרר תרבות. (III) מארז רובוט ראשי. (IV) קורא לוחות. (V) משאבות ומכלים. (B) מארז רובוט. (VI) משאבות תרבית עיקריות. (VII) מכלי מים, פסולת ואקונומיקה. (VIII) משאבות מכונת כביסה. (C) מארז רובוט. (IX) זרוע ואחיזת צנרת רובוטית. (X) טיפים לפיפטה. (XI) רכיב מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הפצת תרבית על הרובוט ("הוופל"). (XII) לוחות לדגימה בקורא הלוחות. (XIII) דליים לשטיפת טיפים. (XIV) "לגונות": כלי תרבות שבהם מתרחשת התרבות האבולוציונית. קיצורים: PRANCE = אבולוציה כמעט רציפה בסיוע פאגים ורובוטיקה; HEPA = אוויר חלקיקי בעל יעילות גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פריסת סיפון. (A) ייצוג תלת-ממדי של פריסת הסיפון בתוכנת הבקרה של הרובוט. (B) צילום של רכיבי הסיפון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צילום מסך של שורת הפקודה עם פרמטרים לדוגמה (למעלה) והפעלת תוכנת בקרה (להלן). לחצן ההפעלה ממוקם בפינה השמאלית העליונה וניתן ללחוץ עליו באמצעות עכבר או להפעיל אותו באמצעות מסך מגע בהתאם ליישום המקומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: קובץ המניפסט של הבקר כפי שהוגדר עבור הרצות בדיקה. לגונות המכילות תרבות #0 יהיו בעמודות 1 ו -3 של צלחת באר 96 עמוק. שאר העמודות יהיו ריקות. השורות A, B, D ו-E של לוח הבאר בעומק 96 מסומנות בטור הימני להדבקה בפאגים (1), השורות האחרות (0) הן בקרות ללא פאגים. מופע זה של מניפסט הבקר יגרום לתוכנית לדלל את הלגונה עם 210 μL של תרבית בכל מחזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: חישוב קצב דילול הלגונה האפקטיבי באמצעות הגיליון האלקטרוני DilutionCalculator. ראה קובץ משלים 2 עבור הגיליון האלקטרוני DilutionCalculator. כפי שניתן לראות באיור זה, לגונה של 550 μL המדוללת על ידי 210 μL של תרבית טרייה בכל מחזור של 30 דקות, עם דגימות של 150 μL למדידת לוחית קורא שנלקחות כל ארבעה מחזורים תתאים לקצב דילול אפקטיבי של 1.0 נפחי לגונה / שעה (לאחר כל שעה אחת, 50% מנוזל הלגונה המקורי בתחילת השעה יישאר) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה איור.
איור 8: מערכת חימום רובוטית. תנור החימום מופעל על ידי חיבור ספק הכוח כפי שמצוין בעיגול האדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: הגדרות פרוטוקול טיהור UV. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: מדידה של בדיקת זיהום שבוצעה במערכת PRANCE. דגימות נלקחות במהלך הריצה ומדידות של זוהר וספיגה נעשים. עבור כל לגונה, מדידות ההארה מחולקות במדידת הספיגה המתאימה ומתוארות כפונקציה של זמן. הלגונות שנדבקו בפאג' צבועות בירוק, ואילו לגונות הבקרה הלא נגועות צבועות בשחור. קיצור: PRANCE = אבולוציה כמעט רציפה בסיוע פאגים ורובוטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: קובץ STL להדפסה תלת-ממדית של רכיבי הסיפון המותאמים אישית הנדרשים למערכת PRANCE, כולל, לכל הפחות, מאגר חיידקי/סעפת הפצה ("וופל"). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: גיליון אלקטרוני של DilutionCalculator. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
למרות המאמצים לתקנן ציוד, מבחינה מעשית, כל הגדרת PRANCE תהיה שונה עקב שינויים באספקת ציוד, חומרה וגרסאות תוכנה. כתוצאה מכך, כל הגדרת PRANCE מבטאת אתגרי התקנה ייחודיים, הדורשים הבנה מקיפה של המטרה של כל רכיב לפתרון בעיות מודולרי יעיל.
שיטה זו מגדירה פרוטוקול שלב אחר שלב להתקנה ובדיקה של מערכת PRANCE מבוססת. תחילה אנו מתמקדים באלמנטים הקריטיים של החומרה והתוכנה ולאחר מכן מפרטים את השלבים החיוניים כדי להתכונן ולבצע סדרה של ריצות בדיקה, אשר קובעות כי המערכת מוכנה PRANCE.
תכונה חיונית של החומרה היא אופטימיזציה כדי להפחית את הסיכון של זיהום צולב מדגם במהלך ניסויים מרובים באמצעות בקטריופאג '. מומלץ להשתמש בקצוות מסוננים באופן בלעדי עם טכנולוגיית קצה רובוט התואמת לשימוש חוזר בחוד ונחשבת כמזערית אירוסולים המיוצרים במהלך פליטת החוד על ידי הימנעות מקצות התאמה בכוח. שטיפת חוד חזקה בהתאם לפרוטוקול זה מאפשרת שימוש חוזר בטיפ, אם כי יש לאמת את הלימות הטיפ כחלק מבדיקת הזיהום בכל מערכת. עיקור עצמי תלוי גם באספקה סדירה של מים ואקונומיקה למערכת. אלה מאוחסנים במיכלים/דליים ואם הם מתרוקנים הם יגרמו לעיקור עצמי לקוי ולזיהום צולב מהיר. ניתן לצלם תמונות של המיכלים/דליים שצולמו לפני ואחרי הפעלת התוכנית כדי למדוד את הקצב שבו ציוד הכביסה צורך מים ואקונומיקה בהינתן הגדרת משאבה מסוימת.
מרכיב מרכזי נוסף של המערכת הוא שמירה על שלב צמיחת החיידקים והטמפרטורה. ניסויי PRANCE נערכים באמצעות זן החיידקים S2060 E. coli (Addgene: #105064). זהו זן המכיל פלסמיד F הנגזר מ-K12 ומותאם להפחתת ביופילמים7. בנוסף, פלסמיד F בזן זה נערך עם תוספת של קסטת התנגדות טטרציקלין לתחזוקת פלסמיד, luxCDE ו - luxR כדי להשלים ניטור זוהר בתיווך luxAB, כמו גם lacZ תחת מקדם זעזועי הפאגים כדי לאפשר הדמיה קולורימטרית של פלאקים. F-pilus מקודד F-פלסמיד הכרחי לזיהום פאג M13. חיידקים המשמשים ב-PACE חייבים אפוא להיות מתורבתים בטמפרטורה של 37°C ובשלב ה-mid-log כאשר F-pilus12 מבוטא וזיהום, התפשטות ואבולוציה של פאגים M13 אפשריים. לוויסות טמפרטורה סטטית, ניתן להשתמש במנשא צלחת מחומם מהמדף. חלופה היא פשוט לחמם את האוויר הנכנס למסנן HEPA באמצעות תנורי חימום זולים, אם כי זה לא מומלץ מכיוון שזה עלול להוביל לבלאי מואץ של החומרה. בנוסף, זה מאיץ את האידוי של נוזלי עזר על הסיפון, כגון אקונומיקה/דליי מים ומשרה, בעת השימוש.
כיול חבילות התוכנה חיוני גם לתפקוד תקין של המערכת. הבדלים בין פריסת סיפון התוכנה לבין סיפון הרובוט בפועל הם הגורם השכיח ביותר לכשל במערכת במהלך הפעולה. כיול קבוע של משאבות העזר המספקות תרבית חיידקים, אקונומיקה וניקוז המערכת הוא חיוני מכיוון ששימוש במשאבה פריסטלטית עלול להוביל לשחיקת צינורות ולשינויים בנפח הנוזלים.
בדיקת זרימת המים תחשוף במהירות מספר בעיות התקנה נפוצות, כולל הגדרות טיפול שגויות בנוזלים, דליפות פלואידיקה/חיבורים פגומים וחוסר יציבות תוכנה. ריצת מים מוצלחת לא תציג דליפות נוזלים בלתי צפויות ותפעל ביציבות ללא טעויות במהלך הלילה. ישנן מספר בעיות נפוצות שעלולות להתעורר במהלך ריצת מים, כגון אי ביצוע שלבים מסוימים לטיפול בנוזלים, טפטוף מפיפטות והפרוטוקול העוצר באמצע הריצה. במקרה של כשל בביצוע שלבים מסוימים לטיפול בנוזלים, ודא שכל מחלקות הנוזלים הותקנו. אלה מפרטים את הצמיגות המתאימה ואת מהירויות הצנרת ומותאמים בתוכנת בקרת הרובוט המסופקת על ידי היצרן. אם יש טפטוף מפיפטות חשוב שהגדרות זרוע הפיפט של הרובוט יהיו נכונות כדי לאפשר פיפטינג נקי ולמנוע זיהום צולב בפאגים. צנרת רובוטית מוצלחת דורשת, בנוסף למחלקות נוזלים נכונות, גבהים נכונים של פריסת הסיפון של כל כלי המעבדה, וקיזוזי גובה צנרת מתאימים המפורטים בתוכנית שיטת הרובוט PRANCE. קיזוז גובה זה עשוי לדרוש התאמה ישירה. אם הפרוטוקול נעצר באמצע הריצה, לעתים קרובות הדבר ייווצר על-ידי מגוון רחב של שגיאות המציינות שקובץ פריסת הסיפון עשוי שלא להתאים לתצורת הסיפון בפועל.
בדיקת ההפעלה של חיידקים בלבד תחשוף בעיות בהגדרות קורא הצלחות והדמיית נתונים בזמן אמת, בעיות עם ריכוז אקונומיקה מופרז או שטיפה לא מספקת, ויציבות טמפרטורה. ריצה מוצלחת של חיידקים בלבד תציג שיווי משקל של ספיגת הלגונה בשלושת המחזורים הראשונים, ולאחר מכן ספיגה יציבה למשך כל הריצה. בנוסף, הוא עשוי לחשוף מספר בעיות נפוצות. זהו השלב הראשון שבו הנתונים שנוצרו על ידי קורא הלוחות הם שרטוט. ייתכן שהנתונים במסד הנתונים של קורא הלוחות לא יישמרו כראוי או לא יותוו כראוי. אם חיידקים אינם מצליחים לאזן את ספיגתם, הדבר עשוי להצביע על כך שריכוז האקונומיקה גבוה מדי. אקונומיקה מוגזמת או כביסה לא מספקת יכולים לעקר את הניסוי כולו, ולא רק את כלי המעבדה. אם יש חשד לכך, ניתן להשתמש ברצועות לזיהוי אקונומיקה כדי לבדוק את הלגונה. יציבות הטמפרטורה של התרבות ניתן לבדוק עם אקדח מדחום.
בדיקת זיהום מוצלחת מצביעה על כך שהמערכת מוכנה לריצות PRANCE. בדיקת זיהום יכולה להתבצע על ידי חיסון תת-קבוצה של לגונות המכילות תרבית חיידקים. חיידקים אלה יבטאו pIII כאשר הם נגועים בפאגים המתאימים שחסר להם הגן ל-pIII (ΔgIII), מה שיאפשר התפשטות פאגים. שילוב אפשרי אחד לבדיקה הוא שימוש בחיידקי S2060 שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד המבטא pIII מתחת למקדם זעזועי הפאגים עם כל פאג ΔgIII. אנו ממליצים להשתמש בפאג ΔgIII הנושא את ה-RNA פולימראז מסוג T7 עם חיידקי S2060 שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד אביזר, שבו pIII ו-luxAB מונעים על-ידי מקדם T7 (פלסמיד pJC173b13), כפי שמודגם באיור 1. זה גם מאפשר ניטור בתיווך קורא צלחות של זיהום במהלך ריצת הבדיקה. ראיות חד-משמעיות להצלחת בדיקת ההדבקה ולהיעדר זיהום צולב יגיעו מטיטרינג פאגים של לגונות בדיקה ובקרה. כאשר משתמשים בכתב לוציפראז, עלייה באור בבארות בדיקה בלבד, כפי שניתן לראות באיור 3, היא גם אינדיקטור לזיהום מוצלח של פאגים והתפשטותם. תקן הזהב לכימות טיטר פאגים הוא מבחן פלאק7. יש גם פרוטוקול לכימות M13 על ידי qPCR7 שעשוי להיות מהיר יותר, אם כי זה לא מפלה בין חלקיקי פאגים זיהומיים ולא זיהומיים ולכן עלול להעריך יתר על המידה טיטרים.
התוכנית הראשית מפנה לקובץ מניפסט, זהו קובץ מסד נתונים טקסט רגיל, המכתיב את נפח הדילול למחזור של כל תרבית מתפשטת, כמו גם את הבחירה של כל מספר של חומרי הזנה פוטנציאליים לתרבית חיידקים, אשר עשויים להיות שונים בחומרת הבחירה. באופן זה, קובץ המניפסט מגדיר רבים מהפרמטרים של הפעלת PRANCE. יש לציין כי קובץ זה ניתן לעריכה במהלך ההפעלה על ידי המפעיל או המערכת, כלומר ניתן לבצע בקרת משוב ידנית או אוטומטית.
התועלת של מערך PRANCE המתפקד במלואו טמונה ביכולתו לפתח במהירות אוכלוסיות גדולות בסביבה מנוטרת ומבוקרת בקפידה. הפורמט מבוסס הלוחות מבדיל את PRANCE מטכניקות אחרות, כמו שימוש במערכות מדף קטנות יותר מבוססות טורבידוסטט14,15. ההתקנה מבוססת הלוחות לא רק מאפשרת שילוב קל עם שלבי עיבוד רובוטיים נוספים, אלא גם תאימות עם מכשירי מעבדה אחרים כגון צנטריפוגות. יתר על כן, היכולת לבצע אבולוציה מואצת בו זמנית על פני מקרים מרובים מכניסה ממד נוסף לניסוי, ומשפרת את הסיכוי להשיג תוצאות מגוונות וחזקות. מערכת הבקרה והמשוב הגרעינית האינטגרלית של PRANCE מחזקת עוד יותר את יכולת החיזוי והאמינות של הניסוי, ומסמנת התקדמות משמעותית בתחום טכניקות האבולוציה המכוונת. עם זאת, טכניקה זו מוגבלת במספר הניסויים המקבילים שהיא יכולה לבצע. בהתאם לתצורה, הגדרות PRANCE מוגבלות בדרך כלל על ידי מהירות צנרת הרובוט או על ידי שטח סיפון זמין.
אותה חומרה ותוכנה המשמשות עבור PRANCE יכולות להיות מיושמות גם בשיטות אבולוציה שאינן מערבות בקטריופאג'. כפי שהודגם בשיטת טורבידוסטטים רבים11, ניתן להשתמש באותו מכשיר באופן בלעדי עם חיידקים, מה שמאפשר ניסויי אבולוציה אדפטיבית של גנום שלם. יכולת הסתגלות זו מרחיבה את היריעה של מכשיר זה, וסוללת את הדרך לצורות חדשות של אבולוציה מואצת רובוטיקה.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לאמה צ'ורי ולקווין אסוולט על עזרתם וייעוציהם בהתקנת חומרה ותוכנה. סמיר אודג'אן, אוסעיד אתר ואריקה דבנדיקיס נתמכים על ידי מענק החוקר המוקדם של פלדה פרלוט. עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרנסיס קריק אשר מקבל את מימון הליבה שלו מ- Cancer Research UK (CC2239), המועצה הבריטית למחקר רפואי (CC2239) ו- Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
