Summary
- och robotassisterad Near-continuous Evolution (PRANCE) är en teknik för snabb och robust proteinevolution. Robotik möjliggör parallellisering av experiment, övervakning i realtid och återkopplingskontroll.
Abstract
Robotaccelererade evolutionstekniker förbättrar evolutionens tillförlitlighet och hastighet med hjälp av återkopplingskontroll, vilket förbättrar resultaten av protein- och organismevolutionsexperiment. I den här artikeln presenterar vi en guide för att ställa in den hårdvara och mjukvara som krävs för att implementera Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution (PRANCE). PRANCE kombinerar snabb fagbaserad molekylär evolution med förmågan att köra hundratals oberoende, återkopplingsstyrda evolutionsexperiment samtidigt. Det här dokumentet kommer att beskriva hårdvarukraven och installationen för PRANCE, inklusive ett vätskehanteringsinstrument, en plattläsare, hjälppumpar, värmare och 3D-printade behållare. Vi beskriver hur man konfigurerar vätskehanteringsroboten så att den är kompatibel med Python-baserad programvara med öppen källkod. Slutligen ger vi förslag på de två första experimenten som kan utföras med ett nykonstruerat PRANCE-system som utövar sina förmågor och validerar att systemet är redo att genomföra multiplexerad evolution. Den här guiden är avsedd att fungera som en handbok för att navigera i den omfattande utrustningsuppsättning som är förknippad med att genomföra robotaccelererad utveckling.
Introduction
PRANCE är en kombination av två kraftfulla tekniker för riktad evolution. Den första är PACE1, en molekylär teknik som kopplar omgångar av gendiversifiering och selektion till den snabba livscykeln för M13-bakteriofagen, vilket gör det möjligt för snabba evolutionsrundor att ske kontinuerligt i flytande fagkultur. Detta urval drivs av användningen av en plasmidkodad genkrets som kopplar funktionen hos det evolverande proteinet till uttrycket av pIII, M13:s svanspälsprotein, som behövs för fagförökning, detta illustreras i figur 1. På experimentnivå möjliggör kontinuerlig utspädning av den flytande fagkulturen ett kontinuerligt urval. Selektionsstringensen kan således moduleras både på genkretsnivå och på experimentell nivå genom att kontrollera fagkulturens utspädningshastighet. PACE kan därför tillämpas på alla biomolekyltekniska utmaningar för vilka det finns en molekylär sensor som kan detektera den önskade aktiviteten i E. coli-bakterier för att inducera pIII-uttryck. Tillämpningar inkluderar evolution av protein-proteinbindning 2,3,4, protein-DNA-bindning5, proteinlöslighet6 och många specifika enzymatiska funktioner7. Den andra är Robotics-accelerated Evolution 8,9, som använder en återkopplingsregulator för att eliminera två vanliga fellägen för riktad evolution: utrotning, som inträffar när miljön är för sträng, och brist på evolution, som inträffar när miljön är för mild. Till skillnad från seriell passage av fager som görs i PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, involverar robotaccelererad "nästan kontinuerlig" evolution snabb pipettering som upprätthåller kulturer i mitten av log-fasen, vilket gör det möjligt för populationer att uppleva kontinuerliga cykler av infektion och förökning. När dessa två tekniker används tillsammans kallas de PRANCE, för Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution8, vilket möjliggör robust, multiplexerad och snabb kontinuerlig utveckling. PRANCE har använts för att utveckla polymeraser, tRNA och aminoacyl-tRNA-syntetaser och för att göra återkopplingskontroll under dessa utvecklingar för att förbättra deras hastighet och tillförlitlighet8.
Det finns flera detaljer i hårdvaru- och mjukvaruinstallationen för PRANCE som möjliggör användning av bakteriofag på en vätskehanteringsrobot. Istället för att använda standardprogramvara som tillhandahålls av robottillverkaren använder vi ett python-baserat programvarupaket med öppen källkod11, vilket möjliggör snabb, samtidig exekvering och därmed möjligheten att hålla de semi-kontinuerliga bioreaktorerna i mitten av log-fasen. Forskarens hands-off-tid kan förlängas till flera dagar genom att flera komponenter på däck rutinmässigt självsteriliseras, och detta uppnås med automatisk styrning av pumpar som kan bleka och skölja dessa komponenter. Korskontaminering av fager kan elimineras genom användning av en vätskehanteringsrobot som inte använder tvångsanpassade spetsar och noggrann justering av vätskehanteringsinställningarna.
Protocol
1. Inställning av hårdvara
OBS: Se figur 2 för en överview av hårdvarukomponenterna i ett PRANCE-system och figur 3 för foton av dessa komponenter fysiskt monterade.
- Skaffa den primära hårdvaran för PRANCE-systemet, inklusive ett vätskehanteringsinstrument, en plattläsare och hjälppumpar.
OBS: Alla PRANCE-system hittills har implementerats på medelstora till stora vätskehanteringsinstrument utrustade med en 8-kanals, individuellt adresserbara pipetteringsarmar, en 96-spetss pipetteringsarm med en kolv, ett robotgripdon för rörliga plattor, en integrerad tvättstation för spetssterilisering och en integrerad plattläsare som kan mäta absorbans och luminiscens. - Konfigurera uppvärmningsstrategierna beroende på modell och funktioner hos vätskehanteringsroboten. Använd en bärare för uppvärmda plattor eller värmemedierad robotklimatkontroll.
- Upprätta en tipptvättstation för att möjliggöra återanvändning av spetsen.
OBS: Hittills har PRANCE-system använt standardtvättstationer, även om denna komponent i princip lätt kan konstrueras av billiga komponenter. - Etablera en källa till bakteriekultur som upprätthålls i log-fasen genom att installera en bioreaktor i realtid som körs vid 37 °C som en kemostat/turbidostat. Alternativt kan en bakteriekultur i logfas på minst 1 l som förodlats vid 37 °C i logfas (OD600 mellan 0,25 och 0,45) vid 4 °C stoppas i ett närliggande kylskåp. Se till att grödan, oavsett om den är kyld eller varm, omrörs regelbundet med hjälp av en skakplatta eller omrörningsplatta för att förhindra sedimentering.
- Konfigurera de föredragna pumparna för robotintegrering med nödvändig programvara och drivrutiner. Implementera programvaran för att göra det möjligt för pumparna att leverera definierade mängder vätska i storleksordningen 10-100 ml.
OBS: Se materialtabellen för pumpar som används i denna implementering och tillverkarens webwebbplats för programvara som används för att driva dessa pumpar och dokumentation om hur du konfigurerar dem. Sådan programvara för pumparna som används i PRANCE-installationen som illustreras i detta manuskript tillhandahålls med öppen källkod i följande GitHub-arkiv https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE kräver minst ett grenrör med tre pumpar som kan pumpa tre separata kanaler (leverera bakterier till bakteriereservoarer, leverera blekmedel till bakteriereservoar och dränera bakteriebehållaren till avfall), med hastigheten för var och en kalibrerad och kontrollerad oberoende av varandra. Tidigare har människor använt akvariepumpar och hydroponiska pumpmatriser, även om i princip vilken pytonormstyrbar peristaltisk pump som helst kan användas. Viktiga funktioner inkluderar möjligheten att använda ett robotgripdon för att överföra plattor in i eller ut ur läsaren, för att initiera en plattläsarmätning och för att komma åt mätningar. - 3D-printa de nödvändiga anpassade däckkomponenterna för PRANCE-systemet, inklusive, åtminstone, bakteriereservoaren/fördelningsgrenröret ("våfflor"), som finns i Supplemental File 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Säkra dessa behållare på däck och kalibrera deras positioner med hjälp av standardprogramvaran för vätskehanteringsrobotar. Anslut behållaren till pumpmatrisen.
OBS: Se robottillverkarens dokumentation för detaljer om hur du utför kalibreringen eftersom den kommer att vara robotberoende. Hartsbaserade 3D-skrivare är mest lämpliga; Ett exempel på den skrivartyp som används ges i materialförteckningen. Standard genomskinligt harts användes med standardskrivarinställningarna. - Utrusta systemet med ett avlopp som är kompatibelt med de lokala biosäkerhetsrekommendationerna.
- Placera laboratorieutrustning på däcket på vätskehanteringsroboten som exemplifieras i figur 4.
- Följ standardsäkerhetsprocedurer, inklusive användning av standardutrustning för laboratoriets personliga skyddsutrustning (t.ex. labbrock, handskar och ögonskydd).
2. Förberedelse av programvara
- Installera programvara med öppen källkod som används för att styra vätskehanteringsrobotar med python11, tillgänglig från PyHamilton-förvaret med öppen källkod. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- Ändra och kalibrera däcklayoutfilen för Liquid Handling-robotprogramvaran för att korrekt återspegla laboratorieutrustningens positioner på robotdäcket, som visas i figur 4.
OBS: Installationen som används här använder programvaran som tillhandahålls av tillverkaren av vätskehanteringsroboten, enligt den medföljande dokumentationen. - Kör robotmetodprogrammet PRANCE i simuleringsläge.
- Öppna kommandoraden med följande kommandon (i Windows-operativsystemet), som du ser i figur 5.
Windows-tangent + R
Ange: cmd - Ändra den överordnade katalogen till katalogen för robotmetodprogrammet. Ange ett kommando enligt nedan med rätt sökväg, som visas i figur 5.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Anropa robotmetodprogrammet med Python med simuleringslägesflaggan, som du ser i figur 5.
py robot_method.py --simulate - Välj PLAY-knappen längst upp till vänster i fönstret Robot Run Control som öppnas när programmet körs (Figur 5).
OBS: Se till att PRANCE-metoden kan köras utan fel i simuleringen innan du går vidare. Det blir uppenbart om skriptet kan fungera i simuleringsläge utan fel, eftersom det kommer att slutföra flera loopar av huvudprogrammet utan att systemets felhantering anropas, vilket avslutar huvudprogramslingan.
- Öppna kommandoraden med följande kommandon (i Windows-operativsystemet), som du ser i figur 5.
- Kör robotmetodprogrammet PRANCE med simuleringsläget inaktiverat.
- Öppna kommandoraden i lämplig katalog (bild 5).
Windows-tangent + R
Ange: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Anropa robotmetodprogrammet med Python utan flaggor:
py robot_method.py - Välj PLAY-knappen längst upp till vänster i fönstret Robot Run Control som öppnas när programmet körs.
- Bekräfta att PyHamilton kan styra instrumentet och få det att initieras.
- Öppna kommandoraden i lämplig katalog (bild 5).
- Upprätta datasynkronisering i realtid.
OBS: Hittills har PRANCE-system använt nätverksanslutna datorer som gör det möjligt för användare att övervaka loggfilerna och mätdiagrammen för plattläsare i realtid via programvara för fjärrfildelning eller via ett fjärrskrivbord. - Stäng av automatiska uppdateringar.
3. Förberedelse före körning
- Se till att bakterieodlingskällor i logfas finns tillgängliga för alla odlingar som krävs för den planerade körningen och att de aktivt omrörs för att förhindra sedimentering. Använd en aktiv kemostat/turbidostat eller en tillväxthämmad kyld förodlad kultur.
- Uppdatera styrenhetens manifestfil med information om vilken volym (intervall 0-500 μL) av vilken bakteriekultur som ska pumpas in i varje brunn i 96-hålslagunen per programcykel. Detta möjliggör exakt kontroll av den effektiva utspädningshastigheten för lagunen. Detta kan ses i figur 6.
- Beräkna lagunens utspädningshastighet med hjälp av kalkylbladet DilutionCalculator.xlsx (tillhandahålls som kompletterande fil 2), som visas i figur 7.
- Uppdatera robot_method.py file med den avsedda lagunhöjden. För att följa detta protokoll, använd 14 (i millimeterenheter ) som standardvärde för variabeln fixed_lagoon_height i programmet. Detta motsvarar en lagunvolym på 550 μL i systemet, men kan variera beroende på vilken 96-djupsbrunnsplatta som används.
- Placera rena, filtrerade pipettspetsar på robotdäcket i deras avsedda positioner och tejpa fast spetsställen på spetshållarna för att säkerställa stabilitet under körningen.
- Placera rena 96-hålsplattor på robotdäcket i deras avsedda positioner.
- Placera rena 96-brunnars läsarplattor på robotdäcket på deras avsedda platser.
- Se till att plåtläsarfacket inte är upptaget av en befintlig platta.
- Se till att pumparna är anslutna till datorn och är tilldelade rätt adress.
- Rengör pumpledningarna genom att aktivera pumparna för att pumpa blekmedel och sedan vatten.
- Anslut pumpledningar till lämpliga källor och utgångar, var noga med att säkerställa att rätt ledningar är anslutna till de relevanta bakteriekulturerna.
- Fyll på tankar/hinkar med blekmedel/vatten för tvätt av bakteriebehållare och pipettspetsar.
- Se till att alla komponenter på däck, särskilt rörliga element, är stabiliserade på sina avsedda positioner.
- Aktivera värmare enligt lokal implementering till måltemperatur (dvs. 37 °C; Figur 8).
- Kör UV-steriliseringsprotokollet file i 10 minuter för att använda den inbyggda UV-steriliseringslampan i vätskehanteringsrobotarna som tillhandahålls av tillverkaren (Figur 9).
- Välj PLAY-knappen längst upp till vänster i fönstret Robot Run Control som öppnas när programmet körs.
- Kör filen med det parametriserade alternativet i 600 s.
- Se till att programvaran för robotkörningskontroll är stängd.
OBS: Robotmetodprogrammet kommer att krascha om det finns några befintliga instanser av Run Control-programvaran som körs.
4. Integrering av hårdvara och mjukvara
- Genomför en "vattenkörning", där PRANCE-robotmetodprogrammet körs över natten med vatten som ersättning för alla kulturer och våta reagenser.
OBS: Detta test kan köras i rumstemperatur.- Slutför förberedelserna före körningen enligt beskrivningen ovan med controller_manifest och robot_method inställda för en effektiv utspädningshastighet för lagunen på 1 volym/h som visas i figur 5 och figur 6.
- Anslut "bakterier in"-ledningen till en behållare med vatten för att ersätta logfasbakterier för vattenkörningen.
OBS: Matfärg kan tillsättas till vattenkällorna för att spåra vätskans rörelse genom experimentet. - Öppna kommandoraden i lämplig katalog.
- Anropa robotmetodprogrammet med Python med den nya körningsflaggan (py robot_method.py --new) och mata in de begärda argumenten, inklusive loggfilens namn (TestRun), antal lagunbrunnar (16), cykelns varaktighet (30), antal cykler per avläsningsplattamätning (4) och inducervolym (inducervolymen är 0 μL för denna testkörning, under en evolution där mutagenes induceras med arabinos, kan detta värde vara 10 μL), som visas i figur 5.
- Välj PLAY-knappen längst upp till vänster i fönstret Robot Run Control som öppnas när programmet körs när argument har angetts.
OBS: PRANCE-metoden kan startas med en tom lagunplatta, och vätskevolymen i lagunerna kommer att utjämnas med den slutliga volymen under de första sex cyklerna.
- Genomför en "endast bakteriekörning", där PRANCE-protokollet körs över natten endast med bakteriekultur vid måltemperatur men utan bakteriofag.
- Slutför förberedelserna före körningen enligt beskrivningen ovan med controller_manifest och robot_method som ställts in för en effektiv utspädningshastighet för lagunen på 1 volym/h, som visas i figur 5 och figur 6. Se till att värmare är påslagna för en måltemperatur på 37 °C.
- Anslut "bakterier in"-ledningen till den valda källan till logfasbakterier.
- Öppna kommandoraden i lämplig katalog.
- Anropa robotmetodprogrammet med Python med den nya run-flaggan (py robot_method.py --new) och mata in de begärda argumenten, som beskrivits tidigare i avsnitt 4.1.4.
- Välj PLAY-knappen längst upp till vänster i fönstret Robot Run Control som öppnas när programmet körs när argumenten har angetts.
- Kör ett "infektionstest" där fager som innehåller ett utvecklat protein utmanas att föröka sig på bakterier som kräver det proteinet.
OBS: Bestäm i förväg vilka laguner som ska inokuleras med och vilka laguner som inte ska inokuleras och därmed fungera som laguner utan fagkontroll för att upptäcka korskontaminering.- Slutför förberedelsen före omgångskörning enligt beskrivningen ovan med controller_manifest och robot_method inställda för en effektiv utspädningshastighet på 1 volym/timme, som visas i figur 5 och figur 6. Se till att värmare är påslagna för en måltemperatur på 37 °C.
- Anslut "bakterier in"-ledningen till den valda källan till logfasbakterier.
- Öppna kommandoraden i lämplig katalog.
- Anropa robotmetodprogrammet med Python med den nya run-flaggan (py robot_method.py --new) och mata in de begärda argumenten enligt beskrivningen tidigare i avsnitt 4.1.4.
- Välj PLAY-knappen längst upp till vänster i fönstret Robot Run Control som öppnas när programmet körs när argument har angetts.
- Innan du tillsätter bakteriofag, kör metoden i 2-3 timmar för att balansera volymen och bakteriernas OD i lagunplattorna.
- Inokulera faglagunerna med 106 pfu/ml bakteriofag i slutet av en körcykel när programmet sover (t.ex. 5,5 μL fagamalikvot vid 108 pfu/ml, bestämt med plackanalys eller qPCR), i en 550 μL lagun.
- Kör programmet över natten och kontrollera sedan fagtitern i lagunbrunnarna med plackanalys eller qPCR.
Representative Results
Resultat av infektionstest
Detta test kommer att avslöja problem med bakterieodling, fagkloning och titer, utrustningens temperaturstabilitet, vätskehanteringsinställningar och integration av plattläsare. Ett framgångsrikt faginfektionstest kommer att avslöja tydlig och snabb faginfektion i laguner som inokulerats med, och ingen signal i laguner utan. Figur 10 visar några representativa resultat av ett faginfektionstest. Experimentella resultat kan också jämföras med figurerna 1d och 1c i denna PRANCE-artikel8, beroende på om en "het PRANCE" (matad av en levande bakteriell turbidostat) eller "kall PRANCE" (matad genom kyld odling i mitten av logfasen) implementeras. Det här testet kan avslöja flera vanliga problem. Problem med bakterieodlingsberedning kan ofta resultera i svag eller frånvarande infektion. Bakterier kan endast infekteras optimalt med M13-när de befinner sig i mitten av logfasen och vid 37 °C. Vid andra temperaturer och tillväxtstadier uppvisar de svagare pilusuttryck och är därför mindre mottagliga för faginfektion12. Inokulering med lågtiterfag, eller med ryggradsmutationer kan resultera i fördröjd eller frånvarande signal. Problem med plattläsarens förstärkningsinställningar för fluorescens eller luminiscens kommer att avslöjas av detta test.
Figur 1: Schematisk bild av den genetiska krets som är verksam under infektionstestkörningen av PRANCE-apparaten. När T7 RNA-polymeras, som kodas på faggenomet, infekterar Escherichia coli-värden , transkriberas det och binder på AP vid T7-promotorn, vilket leder till transkription av pIII-fagproteinet och luxAB-proteinet, vilket i sin tur underlättar fagförökning och produktion av luminiscens. Förkortningar: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; AP = accessorisk plasmid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: En schematisk bild av de fysiska komponenterna i PRANCE-systemet. I ett kylskåp förvaras de omrörda kulturerna, som sedan flyttas till robotdäcket med hjälp av en rad pumpar, till bakteriereservoaren, "våfflan". Vätskehanteringsroboten används för att flytta bakteriekulturer från "våfflan" med hjälp av pipetteringshuvudet till förvaringsbrunnarna för att värmas upp till inkubationstemperatur, och sedan till lagunerna där huvudinkubationen sker. Både förvaringsbrunnarna och lagunerna är standard 2 ml djupa brunnsplattor. Roboten tar prover till engångsläsplattor, som i sin tur flyttas till en plattläsare för mätning. Förkortning: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Robotutrustningen PRANCE. (A) Inställning av PRANCE. (I) HEPA-filter och extern värmare. (II) Kylskåp för odling. (III) Huvudrobotens hölje. (IV) Plattläsare. (V) Pumpar och tankar. (B) Robotens hölje. VI) Huvudsakliga odlingspumpar. (VII) Vatten-, avfalls- och blekmedelstankar. VIII. Spolarpumpar. (C) Robotens hölje. (IX) Robotpipetteringsarm och gripdon. (X) Pipettspetsar. (XI) 3D-printad komponent för att möjliggöra kulturdistribution till roboten ("våfflan"). (XII) Plattor för provtagning i plattläsaren. (XIII) Hinkar för spetstvätt. XIV) "Laguner": odlingskärl där evolutionär odling äger rum. Förkortningar: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; HEPA = högeffektiv partikelluft. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Däckets utformning. (A) 3D-representation av däckets layout i robotens styrprogramvara. B) Fotografi av däckskomponenterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Skärmbild av kommandoraden med exempelparametrar (ovan) och körkontrollprogramvara (nedan). Uppspelningsknappen finns längst upp till vänster och kan klickas med en mus eller aktiveras med en pekskärm beroende på lokal implementering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6: Kontrollantens manifestfil som konfigurerats för testkörningar. Laguner som innehåller kultur #0 skulle finnas i kolumnerna 1 och 3 på plattan med 96 djupa brunnar. Återstående kolumner skulle vara tomma. Raderna A, B, D och E i plattan med 96 djupa brunnar är markerade i den högra kolumnen för infektion med (1), de andra raderna (0) är kontroller utan. Denna instans av styrenhetsmanifestet skulle resultera i att programmet späder ut lagunen med 210 μL odling varje cykel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Beräkning av den effektiva utspädningshastigheten för lagunen med hjälp av kalkylbladet DilutionCalculator. Se Tilläggsfil 2 för kalkylbladet DilutionCalculator. Som framgår av denna figur kommer en lagun på 550 μL som späds ut med 210 μL färsk kultur var 30:e minut, med 150 μL prover för avläsningsplattmätning som tas var fjärde cykel, att motsvara en effektiv utspädningshastighet på 1,0 lagunvolymer/h (efter var 1:e timme kommer 50 % av den ursprungliga lagunvätskan i början av timmen att finnas kvar) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Robotens värmesystem. Värmaren aktiveras genom att koppla in strömförsörjningen enligt den röda cirkeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Inställningar för UV-dekontamineringsprotokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: En mätning av ett infektionstest som körts på PRANCE-systemet. Prover tas under körningen och mätningar av luminiscens och absorbans görs. För varje lagun divideras luminiscensmätningarna med motsvarande absorbansmätning och plottas som en funktion av tiden. De laguner som har infekterats med fager är färgade i grönt, medan de oinfekterade kontrolllagunerna är färgade i svart. Förkortning: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: STL-fil för 3D-utskrift av de anpassade däckkomponenter som krävs för PRANCE-systemet, inklusive, åtminstone, bakteriereservoaren/fördelningsgrenröret ("våfflor"). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: DilutionCalculator kalkylblad. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Trots ansträngningar för att standardisera utrustning kommer praktiskt taget varje PRANCE-installation att vara annorlunda på grund av förändringar i utrustningsförsörjning, hårdvara och programvaruversioner. Som ett resultat av detta uppvisar varje PRANCE-installation unika installationsutmaningar, vilket kräver en omfattande förståelse för syftet med varje komponent för effektiv modulär felsökning.
Denna metod beskriver ett steg-för-steg-protokoll för installation och testning av ett etablerat PRANCE-system. Vi fokuserar först på de kritiska delarna av hårdvaran och mjukvaran och beskriver sedan de viktigaste stegen för att förbereda för och genomföra en serie testkörningar, som fastställer att systemet är redo för PRANCE.
En viktig egenskap hos hårdvaran är optimering för att minska risken för korskontaminering av prover under multiplexerade experiment med bakteriofag. Det rekommenderas att använda uteslutande filtrerade spetsar med robotspetsteknik som är kompatibel med återanvändning av spetsar och som är tänkt att minimera aerosoler som produceras under spetsutmatning genom att undvika tvångsanpassade spetsar. Robust spetstvätt enligt detta protokoll möjliggör återanvändning av spetsar, även om lämpligheten av detta måste valideras som en del av infektionstestet på varje system. Självsterilisering är också beroende av en jämn tillförsel av vatten och blekmedel för systemet. Dessa lagras i tankar/hinkar och om de är uttömda kommer de att resultera i försämrad självsterilisering och snabb korskontaminering. Fotografier kan tas av tankarna/hinkarna som tas före och efter att programmet körs för att jämföra hur snabbt tvättutrustningen förbrukar vatten och blekmedel med tanke på en viss pumpinställning.
En annan viktig del av systemet är upprätthållandet av bakteriens tillväxtfas och temperatur. PRANCE-experiment utförs med S2060 E. coli-bakteriestammen (Addgene: #105064). Detta är en K12-härledd F-plasmidinnehållande stam optimerad för att reducera biofilmer7. Dessutom har F-plasmiden i denna stam redigerats med tillägg av en tetracyklinresistenskassett för plasmidunderhåll, luxCDE och luxR för att komplettera luxAB-medierad luminiscensövervakning, samt lacZ under fagchockpromotorn för att möjliggöra kolorimetrisk visualisering av plack. Den F-plasmidkodade F-pilus är nödvändig för M13-faginfektion. Bakterier som används i PACE måste därför odlas vid 37 °C och i mitten av log-fasen när F-pilus12 uttrycks och M13-faginfektion, förökning och evolution är möjlig. För statisk temperaturreglering kan en hylla uppvärmd plattbärare användas. Ett alternativ är att helt enkelt värma upp luften som går in i HEPA-filtret med hjälp av billiga värmare, även om detta inte rekommenderas eftersom det kan leda till snabbare slitage på hårdvaran. Dessutom påskyndar detta avdunstningen av extra vätskor på däck, såsom blekmedels-/vattenhinkar och inducerare, när de används.
Kalibrering av programvarupaketen är också avgörande för att systemet ska fungera korrekt. Avvikelser mellan programvarudäckets layout och det faktiska robotdäcket är den vanligaste orsaken till systemfel under drift. Regelbunden kalibrering av hjälppumparna som levererar bakteriekultur, blekmedel och dränering av systemet är avgörande eftersom peristaltisk pumpanvändning kan leda till slangslitage och förändringar i vätskevolymen.
Vattenkörningstestet kommer snabbt att avslöja ett antal vanliga installationsproblem, inklusive felaktiga vätskehanteringsinställningar, vätskeläckor/felaktiga anslutningar och instabilitet i programvaran. En lyckad vattenkörning kommer inte att uppvisa några oväntade vätskeläckor och gå stabilt utan fel över natten. Det finns ett antal vanliga problem som kan uppstå under en vattenkörning, t.ex. att vissa vätskehanteringssteg inte utförs, droppar från pipetter och att protokollet stannar mitt i körningen. Om det inte går att utföra vissa vätskehanteringssteg, bekräfta att alla vätskeklasser har installerats. Dessa listar lämplig viskositet och pipetteringshastigheter och justeras i robotstyrningsprogramvaran som tillhandahålls av tillverkaren. Om det droppar från pipetter är det viktigt att robotpipetteringsarmens inställningar är korrekta för att möjliggöra ren pipettering och eliminera korskontaminering av fager. Framgångsrik robotpipettering kräver, förutom korrekta vätskeklasser, korrekta däckslayouthöjder för all laboratorieutrustning och lämpliga pipetteringshöjdsförskjutningar som anges i PRANCE-robotmetodprogrammet. Dessa höjdförskjutningar kan kräva direkt justering. Om protokollet stoppas mitt i körningen genereras detta ofta av ett brett spektrum av fel som indikerar att däcklayoutfilen kanske inte matchar den faktiska däckkonfigurationen.
Testet med endast bakterier kommer att avslöja problem med plattläsarinställningar och datavisualisering i realtid, problem med för hög koncentration av blekmedel eller otillräcklig sköljning och temperaturstabilitet. En lyckad körning med enbart bakterier kommer att uppvisa jämvikt av lagunens absorbans under de tre första cyklerna, följt av stabil absorbans under hela körningen. Dessutom kan det avslöja flera vanliga problem. Detta är det första steget där data som genereras av plattläsaren plottas. Data i plattläsardatabasen kanske inte sparas korrekt eller plottas korrekt. Om bakterier inte är i jämvikt i sin absorbans kan det tyda på att blekmedelskoncentrationen är för hög. Överdriven blekning eller otillräcklig tvätt kan sterilisera hela experimentet, snarare än bara laboratorieutrustningen. Om detta misstänks kan blekmedelsdetekteringsremsor användas för att testa lagunen. Stabiliteten i grödans temperatur kan kontrolleras med en termometerpistol.
Ett lyckat infektionstest indikerar att systemet är redo för PRANCE-körningar. Ett infektionstest kan utföras genom att inokulera en undergrupp av laguner som innehåller bakteriekultur. Dessa bakterier kommer att uttrycka pIII när de infekteras av lämplig som saknar genen för pIII (ΔgIII), vilket möjliggör fagförökning. En möjlig kombination för testning är att använda S2060-bakterier transformerade med en plasmid som uttrycker pIII under fagchockpromotorn med valfri ΔgIII-. Vi rekommenderar att du använder ΔgIII-som bär vildtyp T7 RNA-polymeras med S2060-bakterier transformerade med en accessorisk plasmid, där pIII och luxAB drivs av T7-promotorn (plasmid pJC173b13), som illustreras i figur 1. Detta möjliggör också plattläsarmedierad övervakning av infektion under testkörningen. Definitiva bevis på att infektionstestet är framgångsrikt och att det inte finns någon korskontaminering kommer att komma från fagtititering av test- och kontrolllaguner. Om en luciferasrapportör används är en ökning av luminiscensen endast i testbrunnar, som visas i figur 3, också en indikator på framgångsrik faginfektion och fagförökning. Guldstandarden för fagtiterkvantifiering är plackanalys7. Det finns också ett protokoll för M13-kvantifiering med qPCR7 som kan vara snabbare, även om detta inte skiljer mellan infektiösa och icke-infektiösa fagpartiklar och därmed kan överskatta titrar.
Huvudprogrammet refererar till en manifestfil, detta är en databasfil med vanlig text, som dikterar utspädningsvolymen per cykel för varje förökningskultur samt valet av valfritt antal potentiella bakterieodlingsråvaror, som kan skilja sig åt i selektionsnoggrannhet. På så sätt definierar manifestfilen många av parametrarna för PRANCE-körningen. Det bör noteras att denna fil kan redigeras under körningen av antingen operatören eller systemet, vilket innebär att manuell eller automatisk återkopplingskontroll kan utföras.
Nyttan av en fullt fungerande PRANCE-anläggning ligger i dess förmåga att snabbt utveckla stora populationer i en noggrant övervakad och kontrollerad miljö. Det plattbaserade formatet skiljer PRANCE från andra tekniker, som att använda mindre turbidostatbaserade system14,15. Den plattbaserade installationen underlättar inte bara enkel integration med ytterligare robotbearbetningssteg utan även kompatibilitet med andra laboratorieinstrument som centrifuger. Möjligheten att genomföra accelererad evolution samtidigt över flera instanser introducerar dessutom ytterligare en dimension till experimentet, vilket ökar utsikterna för att uppnå olika och robusta resultat. Det granulära kontroll- och återkopplingssystemet som är integrerat i PRANCE stärker ytterligare förutsägbarheten och tillförlitligheten i experimentet, vilket markerar ett betydande framsteg inom området riktade evolutionstekniker. Denna teknik är dock begränsad i antalet parallella experiment som den kan utföra. Beroende på konfigurationen begränsas PRANCE-inställningarna vanligtvis antingen av robotpipetteringshastigheten eller av tillgängligt däckutrymme.
Samma hårdvara och mjukvara som används för PRANCE kan också tillämpas på evolutionsmetoder som inte involverar bakteriofag. Som demonstrerats i metoden11 med många turbidostater kan samma instrument användas uteslutande med bakterier, vilket möjliggör adaptiva evolutionsexperiment med hela genomet. Denna anpassningsförmåga breddar räckvidden för detta instrument och banar väg för nya former av robotaccelererad evolution.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Emma Chory och Kevin Esvelt för deras hjälp och råd med hårdvaru- och mjukvaruinstallation. Samir Aoudjane, Osaid Ather och Erika DeBenedictis stöds av Steel Perlot Early Investigator Grant. Detta arbete stöddes av Francis Crick Institute som får sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (CC2239), UK Medical Research Council (CC2239) och Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
