نموذج خارج الجسم الحي للورم الخبيث البريتوني لسرطان المبيض باستخدام الثرب البشري
Summary
يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. يوفر النموذج منصة لتوضيح الآليات المؤيدة للورم داخل المكانة الدهنية ولاختبار العلاجات الجديدة.
Abstract
سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا. يلعب الثرب دورا رئيسيا في توفير بيئة دقيقة داعمة لخلايا سرطان المبيض النقيلي بالإضافة إلى الإشارات المعدلة المناعية التي تسمح بتحمل الورم. ومع ذلك ، لدينا نماذج محدودة تحاكي عن كثب التفاعل بين خلايا سرطان المبيض والأنسجة الغنية بالدهون. لمزيد من الفهم للآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم ، قمنا بتطوير نموذج 3D ex vivo فريد من نوعه للتفاعل بين الخلايا السرطانية والثرب. باستخدام الثرب البشري ، نحن قادرون على زراعة خلايا سرطان المبيض داخل هذه البيئة المكروية الغنية بالدهون ومراقبة العوامل المسؤولة عن نمو الورم وتنظيم المناعة. بالإضافة إلى توفير منصة لدراسة هذه البيئة المكروية الغنية بالورم الدهني ، يوفر النموذج منصة ممتازة لتطوير وتقييم مناهج علاجية جديدة لاستهداف الخلايا السرطانية النقيلي في هذا المجال. النموذج المقترح سهل الإنشاء وغير مكلف وقابل للتطبيق على التحقيقات الانتقالية.
Introduction
سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة النسائية فتكا في جميع أنحاء العالم1. يبلغ خطر الإصابة بهذا السرطان مدى الحياة حوالي 1 من كل 70 ، مع متوسط عمر التشخيص عند 63 عاما2. تصنف أورام المبيض الخبيثة الأولية نسيجيا على أنها إما ظهارية أو غير ظهارية. تمثل سرطانات المبيض الظهارية (EOC) أكثر من 90٪ من الأورام ، والنوع الفرعي الأكثر شيوعا هو السرطان المصلي عالي الدرجة (HGSC) ، والذي يمثل حوالي 70٪ -80٪ من EOCs. حاليا ، لا توجد طرق فحص فعالة للكشف عن المرض مبكرا. لذلك يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة متقدمة (أي الاتحاد الدولي لأمراض النساء والتوليد [FIGO] المرحلة الثالثة أو الرابعة) بعد انتشار السرطان في جميع أنحاء التجويف البريتوني2.
العلاج القياسي في الخطوط الأمامية هو الجراحة الخلوية لإزالة جميع الأمراض العيانية المرئية ، يليها العلاج الكيميائي المساعد القائم على البلاتين لتدمير أي مرض مجهري متبقي. في حين كان هناك العديد من التطورات في علاج سرطان المبيض على مدى العقدين الماضيين ، فإن ما يقرب من 70 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم سوف ينتكسون في غضون 3 سنوات من العلاج3. بالنظر إلى التشخيص السيئ العام لهؤلاء المرضى ، تهدف الجهود البحثية الانتقالية الجارية والمستقبلية في EOC إلى تحديد المؤشرات الحيوية للكشف المبكر ، ومنع ورم خبيث ، وتحسين العلاجات الحالية لتجنب المقاومة وتطوير علاجات شخصية جديدة للسرطان.
ورم خبيث معمم داخل التجويف البريتوني والمقاومة الكيميائية المرتبطة به هما من القيود الرئيسية لتحسين علاج المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض 4,5. الثرب ، وهو هيكل يشبه المريلة الدهنية يتدلى من المعدة فوق الأمعاء ، هو الموقع الرئيسي لورم خبيث لسرطان المبيض 6,7. بالإضافة إلى وظيفته كحاجز مادي ، فقد ثبت أن الثرب له قدرات متجددة وعائية ويمتلك أنشطة مناعية ، والتي تعزز معا الأوعية الدموية ، وتسريع التئام الجروح ، والحد من العدوى8. يحتوي على تركيز عال من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ويمكن أن تساعد في إصلاح الأنسجة التالفة. يمكن أن يلتهب الثرب استجابة للإصابة أو العدوى ، مما يؤدي إلى هجرة الخلايا المناعية إلى موقع الإصابة9. تطلق هذه الخلايا المناعية عوامل النمو والجزيئات الأخرى التي تساعد على تعزيز إصلاح وتجديد الأنسجة التالفة. الخلايا المناعية ، مثل الضامة والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما ، المترجمة في الثرب هي هياكل تعرف باسم “البقع اللبنية” ، وهي المسؤولة عن اكتشاف مسببات الأمراض ومهاجمتها وتنظيم المناعة البريتونية. كما ثبت أن الثرب يلعب دورا في تحفيز التحمل المناعي10 ، وهو قدرة الجهاز المناعي على تحمل المستضدات الذاتية وعدم مهاجمة الأنسجة السليمة. ومع ذلك ، فإن نفس الأنشطة المتعلقة بالمناعة تشارك أيضا في الاستجابات المرضية ، مثل نمو الأورام الأذنية ، ورم خبيث ، والهروب من المراقبة المناعية 9,11. أظهرت الدراسات السابقة من مختبرنا وغيره دورا فريدا ونشطا للبيئة المكروية الدهنية في تثبيط الاستجابات المناعية المضادة للأورام وفي اكتساب المقاومة الكيميائية12،13،14. لسوء الحظ ، لدينا معلومات محدودة عن الآليات الخلوية والجزيئية التي يوفر بها الثرب بيئة دقيقة مؤيدة للورم.
لفهم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والثرب بشكل أفضل ، تم تطوير نظام ثقافة 3D يتكون من خلايا سرطان المبيض البشري ونباتات الثرب المشتقة من المريض. يمثل البروتوكول الموصوف هنا نموذجا جديدا خارج الجسم الحي للسرطان البريتوني. يحاكي هذا النموذج التطور الطبيعي لتكوين أورام سرطان المبيض في هذا النسيج الغني بالدهون. النموذج المقترح سهل التوليد وغير مكلف ويحتمل أن يكون قابلا للتطبيق على التحقيقات الانتقالية في أبحاث سرطان المبيض.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير نموذج قبل السريري لسرطان الصفاق لسرطان المبيض باستخدام مزيج من التقنيات الأساسية في المختبر وخارج الجسم الحي. لوحظ نمو تدريجي للورم على مدار 50 يوما من الثقافة المشتركة بعد بذر عينات الثرب بخلايا سرطان المبيض البشري mCherry + OCSC1-F2. تم تطوير هذه الطر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة جانيت بوروس التذكارية. نحن نعترف بالمرضى وقسم الأورام النسائية في معهد كارمانوس للسرطان لجمع عينات الثرب. كما نعترف بالبنك الحيوي وجوهر العلوم المترابطة في معهد كارمانوس للسرطان لتنسيق توظيف المرضى وإعداد شرائح علم الأمراض. يتم دعم البنك الحيوي وجوهر العلوم المرتبطة جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة P30 CA22453 لمعهد كارمانوس للسرطان في جامعة واين ستيت.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle | BD | 329652 | |
| 10 mL Serological Pipets | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 Well Cell Culture Plate | Costar | 3524 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve microscope | Echo |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update. Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).
- Ledermann, J. A., et al. Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).
- Morgan, R. J., et al. Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Di Nicola, V. Omentum a powerful biological source in regenerative surgery. Regen Ther. 11, 182-191 (2019).
- Meza-Perez, S., Randall, T. D. Immunological functions of the omentum. Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).
- Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).
- Lee, W., et al. Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum. J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).
- Cardenas, C., et al. Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells. Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).
- Wu, Q., et al. Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression. J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).
- Zhang, Z., Scherer, P. E. Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte – a cancer cell’s best friend. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).
- Alvero, A. B., et al. TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo. Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).
- Alvero, A. B., et al. Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model. Sci Rep. 7, 40989 (2017).
- Craveiro, V., et al. Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment. Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).
- Sumi, N. J., et al. Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence. J Vis Exp. (93), e51815 (2014).
- Agarwal, R., et al. Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).
- Kelly, M. G., et al. TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer. Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).
- Li, J., et al. CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential. Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).
- Tedja, R., et al. Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential. Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).
- Dauleh, S., et al. Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum. PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).
