Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines dreidimensionalen (3D) ex vivo Modells der Krebszell-Omentum-Interaktion. Das Modell bietet eine Plattform zur Aufklärung von Pro-Tumor-Mechanismen in der Fettnische und zur Erprobung neuartiger Therapien.

Abstract

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität. Das Omentum spielt eine Schlüsselrolle bei der Bereitstellung einer unterstützenden Mikroumgebung für metastasierende Eierstockkrebszellen sowie bei immunmodulatorischen Signalen, die eine Tumortoleranz ermöglichen. Wir haben jedoch nur begrenzte Modelle, die die Interaktion zwischen Eierstockkrebszellen und fettreichem Gewebe genau nachahmen. Um die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die das Omentum eine pro-tumorale Mikroumgebung bietet, besser zu verstehen, haben wir ein einzigartiges 3D-Ex-vivo-Modell der Krebszell-Omentum-Interaktion entwickelt. Mit Hilfe des menschlichen Omentums sind wir in der Lage, Eierstockkrebszellen in dieser fettreichen Mikroumgebung zu züchten und die Faktoren zu überwachen, die für das Tumorwachstum und die Immunregulation verantwortlich sind. Das Modell bietet nicht nur eine Plattform für die Untersuchung dieser fettreichen Tumormikroumgebung, sondern auch eine hervorragende Plattform für die Entwicklung und Bewertung neuartiger therapeutischer Ansätze, um metastasierende Krebszellen in dieser Nische anzugreifen. Das vorgeschlagene Modell ist einfach zu generieren, kostengünstig und auf translationale Untersuchungen anwendbar.

Introduction

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität weltweit¹. Das Lebenszeitrisiko, an diesem Krebs zu erkranken, liegt bei etwa 1 zu 70, wobei das mediane Alter bei der Diagnose bei 63 Jahren liegt². Primäre Malignome der Eierstöcke werden histologisch entweder als epithelial oder nicht-epithelial klassifiziert. Epitheliale Ovarialkarzinome (EOC) machen über 90 % der Tumoren aus, und der häufigste Subtyp ist das hochgradige seröse Karzinom (HGSC), das etwa 70 % bis 80 % der EOCs ausmacht. Derzeit gibt es keine wirksamen Screening-Methoden, um Krankheiten frühzeitig zu erkennen. Daher werden die meisten Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert (d. h. Fédération Internationale de Gynécologie et d’Obstétrique [FIGO] Stadium III oder IV), nachdem sich der Krebs in der Bauchhöhle ausgebreitet hat².

Die Standardbehandlung an vorderster Front ist die zytoreduktive Chirurgie, um alle sichtbaren makroskopischen Erkrankungen zu entfernen, gefolgt von einer adjuvanten Chemotherapie auf Platinbasis, um alle verbleibenden mikroskopischen Erkrankungen zu zerstören. Obwohl es in den letzten zwei Jahrzehnten viele Fortschritte in der Behandlung von Eierstockkrebs gegeben hat, erleiden etwa 70 % der Patientinnen mit fortgeschrittener Erkrankung innerhalb von 3 Jahren nach der Behandlung einen Rückfall³. Angesichts der insgesamt schlechten Prognose dieser Patienten zielen laufende und zukünftige translationale Forschungsbemühungen im EOC darauf ab, Biomarker für die Früherkennung zu identifizieren, Metastasen zu verhindern, aktuelle Therapien zu verbessern, um Resistenzen zu umgehen und neue personalisierte Krebsbehandlungen zu entwickeln.

Generalisierte Metastasen in der Peritonealhöhle und die damit verbundene Chemoresistenz sind zwei der Haupteinschränkungen für die Verbesserung der Behandlung von Patientinnen mit Ovarialkarzinom ^4,5. Das Omentum, eine fettige, schürzenartige Struktur, die vom Magen über den Darm herabhängt, ist ein Hauptort der Metastasierung von Eierstockkrebs ^6,7. Zusätzlich zu seiner Funktion als physikalische Barriere hat das Omentum nachweislich regenerative und angiogene Fähigkeiten und besitzt Immunaktivitäten, die zusammen die Vaskularisierung fördern, die Wundheilung beschleunigen und Infektionen begrenzen⁸. Es enthält eine hohe Konzentration an Stammzellen, die sich in verschiedene Zelltypen differenzieren und bei der Reparatur von beschädigtem Gewebe helfen können. Das Omentum kann sich als Reaktion auf eine Verletzung oder Infektion entzünden, was die Migration von Immunzellen an die Verletzungsstelle auslöst⁹. Diese Immunzellen setzen Wachstumsfaktoren und andere Moleküle frei, die dazu beitragen, die Reparatur und Regeneration von geschädigtem Gewebe zu fördern. Immunzellen wie Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen, die im Omentum lokalisiert sind, sind Strukturen, die als “milchige Flecken” bekannt sind und für die Erkennung und Bekämpfung von Krankheitserregern und die Regulierung der peritonealen Immunität verantwortlich sind. Es wurde auch gezeigt, dass das Omentum eine Rolle bei der Induktion der Immuntoleranz¹⁰ spielt, d. h. der Fähigkeit des Immunsystems, Selbstantigene zu tolerieren und gesundes Gewebe nicht anzugreifen. Dieselben immunbezogenen Aktivitäten sind jedoch auch an pathologischen Reaktionen beteiligt, wie z. B. dem Wachstum von omentalen Tumoren, Metastasen und der Flucht aus der Immunüberwachung ^9,11. Frühere Studien aus unserem Labor und anderen haben eine einzigartige und aktive Rolle der adipösen Mikroumgebung bei der Hemmung antitumoraler Immunantworten und beim Erwerb von Chemoresistenzen gezeigt^12,13,14. Leider haben wir nur begrenzte Informationen über die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die das Omentum eine pro-tumorale Mikroumgebung bietet.

Um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und dem Omentum besser zu verstehen, wurde ein 3D-Kultursystem entwickelt, das aus humanen Ovarialkarzinomzellen und patienteneigenen Omentum-Explantaten besteht. Das hier beschriebene Protokoll stellt ein neuartiges ex vivo Modell der Peritonealkarzinose dar. Dieses Modell ahmt den natürlichen Verlauf der Tumorgenese von Eierstockkrebs in diesem fettreichen Gewebe nach. Das vorgeschlagene Modell ist einfach zu generieren, kostengünstig und potenziell auf translationale Untersuchungen in der Eierstockkrebsforschung anwendbar.

Protocol

Das folgende Forschungsprotokoll wurde vom Wayne State University Institutional Review Board (IRB) geprüft und genehmigt. Vor der Operation wurde von allen Patienten eine Einverständniserklärung eingeholt. Abbildung 1 veranschaulicht die drei allgemeinen Schritte in diesem Protokoll. 1. Präparation von menschlichem Omentumgewebe Omentum-Nährmedien (DMEM/F12 + 10 % fötales Kälberserum + 1 % Penicillin-Streptomycin) vorbereiten und …

Representative Results

Die erfolgreiche Etablierung von Ovarialkarzinomzellen in Omentumproben war etwa am 14. Tag offensichtlich (Abbildung 3A-C). Mindestens 24 Replikate wurden präpariert und pro entnommener Probe injiziert, um weitere Experimente zu ermöglichen. Das Tumorwachstum wurde durch Fluoreszenzaufnahmen überwacht (Abbildung 3D,E). Die Bilder mussten vorsichtig interpretiert werden, da eine Monoschicht von Krebszellen au…

Discussion

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde ein präklinisches Modell der Peritonealkarzinose bei Ovarialkarzinom entwickelt, das eine Kombination aus grundlegenden In-vitro– und Ex-vivo-Techniken verwendet. Ein progressives Tumorwachstum wurde über 50 Tage in Kokultur beobachtet, nachdem Omentumproben mit mCherry+ OCSC1-F2 humanen Ovarialkarzinomzellen ausgesät wurden. Diese Methode wurde in mehreren experimentellen Versuchen mit verschiedenen Omentumproben entwickelt und optimiert. Ein erfolgreiches Tu…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo