İnsan Omentumu Kullanılarak Over Kanseri Periton Metastazının Ex Vivo Modeli
Summary
Bu protokol, kanser hücresi-omentum etkileşiminin üç boyutlu (3D) ex vivo modelinin kurulmasını açıklar. Model, yağ nişi içindeki pro-tümör mekanizmalarını aydınlatmak ve yeni tedavileri test etmek için bir platform sağlar.
Abstract
Over kanseri en ölümcül jinekolojik malignitedir. Omentum, metastatik yumurtalık kanseri hücrelerine destekleyici bir mikro çevrenin yanı sıra tümör toleransına izin veren immün modülatör sinyallerin sağlanmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri hücreleri ile yağdan zengin dokular arasındaki etkileşimi yakından taklit eden sınırlı modellerimiz var. Omentumun pro-tümöral bir mikroçevre sağladığı hücresel ve moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, kanser hücresi-omentum etkileşiminin benzersiz bir 3D ex vivo modelini geliştirdik. İnsan omentumunu kullanarak, bu yağ açısından zengin mikro çevre içinde yumurtalık kanseri hücrelerini büyütebilir ve tümör büyümesi ve bağışıklık regülasyonundan sorumlu faktörleri izleyebiliriz. Model, bu adipoz açısından zengin tümör mikroçevresinin incelenmesi için bir platform sağlamanın yanı sıra, bu niş içindeki metastatik kanser hücrelerini hedeflemek için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için mükemmel bir platform sağlar. Önerilen modelin üretilmesi kolaydır, ucuzdur ve translasyonel araştırmalara uygulanabilir.
Introduction
Over kanseri dünya çapında en ölümcül jinekolojik malignitedir1. Bu kansere yakalanma riski yaklaşık 70’de 1’dir ve ortalama tanı yaşı 63’tür2. Primer over maligniteleri histolojik olarak epitelyal ve epitelyal olmayan olarak sınıflandırılır. Epitelyal over kanserleri (EOC) tümörlerin %90’ından fazlasını oluşturur ve en sık görülen alt tip, EOC’lerin yaklaşık %70-80’ini oluşturan yüksek dereceli seröz karsinomdur (HGSC). Şu anda, hastalığı erken teşhis etmek için etkili bir tarama yöntemi yoktur. Bu nedenle çoğu hasta, kanser periton boşluğuna yayıldıktan sonra ileri bir aşamada (yani, Fédération Internationale de Gynécologie et d’Obstétrique [FIGO] evre III veya IV) teşhis edilir2.
Standart ön cephe tedavisi, tüm görünür makroskopik hastalıkları ortadan kaldırmak için sitoredüktif cerrahi ve ardından herhangi bir kalıntı mikroskobik hastalığı yok etmek için adjuvan platin bazlı kemoterapidir. Son yirmi yılda yumurtalık kanseri tedavisinde birçok ilerleme olmasına rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların yaklaşık %70’i tedaviden sonraki 3 yıl içinde nüksedecektir3. Bu hastaların genel olarak kötü prognozu göz önüne alındığında, EOC’de devam eden ve gelecekteki translasyonel araştırma çabaları, erken teşhis için biyobelirteçleri tanımlamayı, metastazı önlemeyi, dirençten kaçınmak için mevcut tedavileri iyileştirmeyi ve yeni kişiselleştirilmiş kanser tedavileri geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Periton boşluğu içindeki jeneralize metastaz ve buna bağlı kemorezistans, yumurtalık kanserli hastaların tedavisinin iyileştirilmesi için en önemli sınırlamalardan ikisidir 4,5. Mideden bağırsakların üzerine sarkan yağlı önlük benzeri bir yapı olan omentum, yumurtalık kanseri metastazının ana bölgesidir 6,7. Fiziksel bir bariyer olarak işlevine ek olarak, omentumun rejeneratif ve anjiyojenik kapasitelere sahip olduğu ve birlikte vaskülarizasyonu destekleyen, yara iyileşmesini hızlandıran ve enfeksiyonu sınırlayan bağışıklık aktivitelerine sahip olduğu gösterilmiştir8. Çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilen ve hasarlı dokuların onarılmasına yardımcı olabilen yüksek konsantrasyonda kök hücre içerir. Omentum, yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak iltihaplanabilir, bu da bağışıklık hücrelerinin yaralanma bölgesinegöçünü tetikler 9. Bu bağışıklık hücreleri, hasarlı dokunun onarımını ve yenilenmesini desteklemeye yardımcı olan büyüme faktörlerini ve diğer molekülleri serbest bırakır. Omentumda lokalize olan makrofajlar, lenfositler ve plazma hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, patojenleri tespit etmekten ve bunlara saldırmaktan ve periton bağışıklığını düzenlemekten sorumlu olan “sütlü lekeler” olarak bilinen yapılardır. Omentumun ayrıca, bağışıklık sisteminin kendi antijenlerini tolere etme ve sağlıklı dokulara saldırmama yeteneği olan bağışıklık toleransını10 indüklemede rol oynadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, aynı bağışıklıkla ilgili aktiviteler, omental tümörlerin büyümesi, metastaz ve bağışıklık sürveyansından kaçış gibi patolojik yanıtlarda da rol oynar 9,11. Laboratuvarımızdan ve diğerlerinden yapılan önceki çalışmalar, anti-tümöral immün yanıtların inhibisyonunda ve kemodirenç12,13,14 kazanılmasında adipoz mikroçevrenin benzersiz ve aktif bir rolünü göstermiştir. Ne yazık ki, omentumun pro-tümöral bir mikroçevre sağladığı hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında sınırlı bilgiye sahibiz.
Kanser hücreleri ve omentum arasındaki etkileşimleri daha iyi anlamak için, insan yumurtalık kanseri hücreleri ve hasta kaynaklı omentum eksplantlarından oluşan bir 3D kültür sistemi geliştirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, peritoneal karsinomatozisin yeni bir ex vivo modelini temsil etmektedir. Bu model, bu yağ açısından zengin dokuda yumurtalık kanseri tümör oluşumunun doğal ilerlemesini taklit eder. Önerilen modelin üretilmesi kolaydır, ucuzdur ve yumurtalık kanseri araştırmalarında translasyonel araştırmalara potansiyel olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol kullanılarak, temel in vitro ve ex vivo tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak yumurtalık kanseri için klinik öncesi bir peritoneal karsinomatoz modeli geliştirilmiştir. Omentum örneklerinin mCherry + OCSC1-F2 insan yumurtalık kanseri hücreleri ile tohumlanmasından sonra 50 günlük ko-kültür boyunca ilerleyici bir tümör büyümesi gözlendi. Bu yöntem, farklı omentum örnekleri kullanılarak yapılan çeşitli deneysel çalışmalarda geliştirilmiş ve optimize edilmiş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Janet Burros Memorial Vakfı tarafından finanse edilmektedir. Omentum örneklerinin toplanması için hastalara ve Karmanos Kanser Enstitüsü Jinekolojik Onkoloji Bölümü’ne teşekkür ederiz. Ayrıca, hasta alımının koordinasyonu ve patoloji slaytlarının hazırlanması için Karmanos Kanser Enstitüsü’ndeki Biobank ve Korelasyon Bilimleri Çekirdeği’ne de teşekkür ediyoruz. Biobank ve Correlative Sciences Core, kısmen NIH Center’ın Wayne State Üniversitesi’ndeki Karmanos Kanser Enstitüsü’ne verdiği P30 CA22453 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle | BD | 329652 | |
| 10 mL Serological Pipets | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 Well Cell Culture Plate | Costar | 3524 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve microscope | Echo |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update. Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).
- Ledermann, J. A., et al. Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).
- Morgan, R. J., et al. Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Di Nicola, V. Omentum a powerful biological source in regenerative surgery. Regen Ther. 11, 182-191 (2019).
- Meza-Perez, S., Randall, T. D. Immunological functions of the omentum. Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).
- Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).
- Lee, W., et al. Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum. J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).
- Cardenas, C., et al. Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells. Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).
- Wu, Q., et al. Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression. J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).
- Zhang, Z., Scherer, P. E. Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte – a cancer cell’s best friend. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).
- Alvero, A. B., et al. TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo. Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).
- Alvero, A. B., et al. Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model. Sci Rep. 7, 40989 (2017).
- Craveiro, V., et al. Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment. Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).
- Sumi, N. J., et al. Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence. J Vis Exp. (93), e51815 (2014).
- Agarwal, R., et al. Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).
- Kelly, M. G., et al. TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer. Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).
- Li, J., et al. CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential. Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).
- Tedja, R., et al. Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential. Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).
- Dauleh, S., et al. Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum. PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).
