Un modèle ex vivo de métastases péritonéales du cancer de l’ovaire à l’aide d’un épiploon humain

Summary

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle tridimensionnel (3D) ex vivo de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. Le modèle fournit une plate-forme pour élucider les mécanismes pro-tumoraux dans la niche adipeuse et pour tester de nouvelles thérapies.

Abstract

Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle. L’épiploon joue un rôle clé en fournissant un microenvironnement favorable aux cellules cancéreuses de l’ovaire métastatiques ainsi que des signaux immunomodulateurs qui permettent la tolérance tumorale. Cependant, nous disposons de modèles limités qui imitent étroitement l’interaction entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les tissus riches en tissu adipeux. Pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’épiploon fournit un microenvironnement pro-tumoral, nous avons développé un modèle 3D ex vivo unique de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. À l’aide de l’épiploon humain, nous sommes en mesure de cultiver des cellules cancéreuses de l’ovaire dans ce microenvironnement riche en graisse et de surveiller les facteurs responsables de la croissance tumorale et de la régulation immunitaire. En plus de fournir une plate-forme pour l’étude de ce microenvironnement tumoral riche en graisse, le modèle fournit une excellente plate-forme pour le développement et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler les cellules cancéreuses métastatiques dans cette niche. Le modèle proposé est facile à générer, peu coûteux et applicable aux investigations translationnelles.

Introduction

Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle dans le monde¹. Le risque de développer ce cancer au cours de la vie est d’environ 1 sur 70, l’âge médian du diagnostic étant de 63 ans². Les tumeurs malignes primitives de l’ovaire sont classées histologiquement comme épithéliales ou non épithéliales. Les cancers épithéliaux de l’ovaire (COE) représentent plus de 90 % des tumeurs, et le sous-type le plus courant est le carcinome séreux de haut grade (HGSC), qui représente environ 70 à 80 % des COE. À l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode de dépistage efficace pour détecter la maladie à un stade précoce. Ainsi, la plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé (c’est-à-dire le stade III ou IV de la Fédération internationale de gynécologie et d’obstétrique [FIGO]) après que le cancer se soit propagé dans toute la cavité péritonéale².

Le traitement de première ligne standard est la chirurgie cytoréductrice pour enlever toutes les maladies macroscopiques visibles, suivie d’une chimiothérapie adjuvante à base de platine pour détruire toute maladie microscopique résiduelle. Bien qu’il y ait eu de nombreux progrès dans le traitement du cancer de l’ovaire au cours des deux dernières décennies, environ 70 % des patientes atteintes d’une maladie avancée rechuteront dans les 3 ans suivant le traitement³. Compte tenu du mauvais pronostic global de ces patients, les efforts de recherche translationnelle en cours et à venir dans le cadre de l’EOC visent à identifier des biomarqueurs pour une détection précoce, à prévenir les métastases, à améliorer les thérapies actuelles pour échapper à la résistance et à développer de nouveaux traitements personnalisés contre le cancer.

Les métastases généralisées dans la cavité péritonéale et la chimiorésistance qui leur est associée sont deux des principales limites à l’amélioration du traitement des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire ^4,5. L’épiploon, une structure graisseuse en forme de tablier qui pend de l’estomac au-dessus des intestins, est l’un des principaux sites de métastases du cancer de l’ovaire ^6,7. En plus de sa fonction de barrière physique, il a été démontré que l’épiploon a des capacités régénératrices et angiogéniques et possède des activités immunitaires qui, ensemble, favorisent la vascularisation, accélèrent la cicatrisation des plaies et limitent l’infection⁸. Il contient une forte concentration de cellules souches qui peuvent se différencier en différents types de cellules et peuvent aider à réparer les tissus endommagés. L’épiploon peut s’enflammer en réponse à une blessure ou à une infection, ce qui déclenche la migration des cellules immunitaires vers le site de la blessure⁹. Ces cellules immunitaires libèrent des facteurs de croissance et d’autres molécules qui aident à favoriser la réparation et la régénération des tissus endommagés. Les cellules immunitaires, telles que les macrophages, les lymphocytes et les plasmocytes, localisées dans l’épiploon sont des structures connues sous le nom de « taches laiteuses », qui sont responsables de la détection et de l’attaque des agents pathogènes et de la régulation de l’immunité péritonéale. Il a également été démontré que l’épiploon joue un rôle dans l’induction de la tolérance immunitaire¹⁰, c’est-à-dire la capacité du système immunitaire à tolérer les auto-antigènes et à ne pas attaquer les tissus sains. Cependant, les mêmes activités liées au système immunitaire sont également impliquées dans les réponses pathologiques, telles que la croissance des tumeurs omentales, les métastases et l’échappement de la surveillance immunitaire ^9,11. Des études antérieures de notre laboratoire et d’autres ont démontré un rôle unique et actif du microenvironnement adipeux dans l’inhibition des réponses immunitaires anti-tumorales et dans l’acquisition de la chimiorésistance^12,13,14. Malheureusement, nous disposons de peu d’informations sur les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’épiploon fournit un microenvironnement pro-tumoral.

Pour mieux comprendre les interactions entre les cellules cancéreuses et l’épiploon, un système de culture 3D composé de cellules cancéreuses de l’ovaire humain et d’explants d’épiploon dérivés de patientes a été développé. Le protocole décrit ici représente un nouveau modèle ex vivo de carcinose péritonéale. Ce modèle imite la progression naturelle de la tumorigenèse du cancer de l’ovaire dans ce tissu riche en graisse. Le modèle proposé est facile à générer, peu coûteux et potentiellement applicable aux recherches translationnelles dans la recherche sur le cancer de l’ovaire.

Protocol

Le protocole de recherche suivant a été examiné et approuvé par le Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Le consentement éclairé de tous les patients a été obtenu avant la chirurgie. La figure 1 illustre les trois étapes générales de ce protocole. 1. Préparation du tissu de l’épiploon humain Préparer les milieux de culture de l’épiploon (DMEM/F12 + 10 % de sérum de veau fœtal + 1 % de pénicilline-…

Representative Results

L’établissement réussi de cellules cancéreuses de l’ovaire dans les échantillons d’épiploon était évident vers le 14e jour (figure 3A-C). Au moins 24 répétitions ont été préparées et injectées par échantillon prélevé pour permettre d’autres expériences. La croissance tumorale a été surveillée par la prise d’images fluorescentes (Figure 3D,E). Les images devaient être interprétée…

Discussion

À l’aide de ce protocole, un modèle préclinique de carcinose péritonéale pour le cancer de l’ovaire a été développé en utilisant une combinaison de techniques de base in vitro et ex vivo. Une croissance tumorale progressive a été observée au cours des 50 jours de co-culture après l’ensemencement d’échantillons d’épiploon avec des cellules cancéreuses de l’ovaire humaines mCherry+ OCSC1-F2. Cette méthode a été développée et optimisée au cours de plusieurs essais expérim…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo