Summary

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten menschlichen Darmorganoiden und bietet einen Ansatz für die Analyse.

Abstract

Die Kalziumsignalisierung ist ein integraler Regulator fast jedes Gewebes. Im Darmepithel ist Kalzium an der Regulierung der sekretorischen Aktivität, der Aktindynamik, der Entzündungsreaktionen, der Stammzellproliferation und vieler anderer nicht charakterisierter zellulärer Funktionen beteiligt. Daher kann die Kartierung der Kalzium-Signaldynamik im Darmepithel Einblicke in homöostatische zelluläre Prozesse geben und einzigartige Reaktionen auf verschiedene Reize aufdecken. Humane intestinale Organoide (HIOs) sind ein vom Menschen abgeleitetes Hochdurchsatzmodell zur Untersuchung des Darmepithels und stellen somit ein nützliches System zur Untersuchung der Kalziumdynamik dar. In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um HIOs mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) stabil zu transduzieren, Live-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen und Bilddaten zu analysieren, um Kalziumsignale aussagekräftig zu charakterisieren. Als repräsentatives Beispiel wurden 3-dimensionale HIOs mit Lentivirus transduziert, um GCaMP6s, eine grün fluoreszierende Protein-basierte zytosolische GECI, stabil zu exprimieren. Die entwickelten HIOs wurden dann in einer einzelligen Suspension dispergiert und als Monolagen ausgesät. Nach der Differenzierung wurden die HIO-Monolayer mit Rotaviren infiziert und/oder mit Medikamenten behandelt, von denen bekannt ist, dass sie eine Kalziumreaktion stimulieren. Ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer temperaturkontrollierten, befeuchteten Live-Imaging-Kammer ausgestattet war, ermöglichte die Langzeitbildgebung von infizierten oder medikamentös behandelten Monoschichten. Im Anschluss an die Bildgebung wurden die aufgenommenen Bilder mit der frei verfügbaren Analysesoftware ImageJ analysiert. Insgesamt etabliert diese Arbeit eine anpassungsfähige Pipeline zur Charakterisierung zellulärer Signaltransduktion in HIOs.

Introduction

Kalzium ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellphysiologie spielt1. Aufgrund seiner starken Ladung, seiner geringen Größe und seiner hohen Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen ist Kalzium ein idealer Manipulator der Proteinkonformation. Dies macht Kalzium zu einem leistungsstarken Mittel, um elektrochemische Signale in enzymatische, transkriptionelle oder posttranskriptionelle Veränderungen umzuwandeln. Die strengen Kalziumkonzentrationsgradienten über das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Plasmamembranen erzeugen eine hohe Antriebskraft, die schnelle Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration ermöglicht. Mehrere Mechanismen, darunter sowohl die Pufferung als auch der aktive Transport, halten diesen Gradienten aufrecht. Diese Aufrechterhaltung ist zwar für normale Zellfunktionen notwendig, aber energetisch teuer, was sie besonders anfällig für Stresszustände macht 2.

Daher ist eine Dysregulation von Kalzium im Zytosol ein nahezu universelles Signal für viele Arten von zellulärem Stress. Stoffwechselstörungen, Toxine, Krankheitserreger, mechanische Schäden und genetische Störungen können die Kalziumsignalisierung stören. Unabhängig vom Stimulus kann ein anhaltender, unkontrollierter Anstieg des zytosolischen Kalziums auf Ganzzellebene die Apoptose und schließlich die Nekrose fördern 3,4. Veränderungen des zytosolischen Kalziumspiegels mit geringerer Amplitude oder höherer Frequenz haben jedoch unterschiedliche Auswirkungen2. Ebenso können die Ergebnisse von Kalziumschwankungen je nach räumlicher Mikrodomäne, in der sie auftreten, unterschiedlich sein5. Die Überwachung des Kalziumspiegels kann daher Aufschluss über dynamische Signalprozesse geben, erfordert jedoch eine Probenahme mit relativ hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) sind leistungsfähige Werkzeuge für die kontinuierliche Probenahme in lebenden Zellsystemen6. Einige der am weitesten verbreiteten GECIs sind GFP-basierte, auf Kalzium reagierende fluoreszierende Proteine, die als GCaMPsbekannt sind 7. Die kanonische GCaMP ist eine Fusion von drei verschiedenen Proteindomänen: einem zirkulär permutierten GFP (cpGFP), Calmodulin und M136. Die Calmodulindomäne erfährt bei der Bindung von Kalzium eine Konformationsänderung, die ihre Interaktion mit M13 ermöglicht. Die Calmodulin-M13-Wechselwirkung induziert eine Konformationsänderung des cpGFP, die seine Fluoreszenzemission bei Anregung erhöht. Daher korreliert ein Anstieg der Kalziumkonzentration mit einem Anstieg der GCaMP-Fluoreszenzintensität. Diese Sensoren können zytosolisch oder auf bestimmte Organellen gerichtet sein8.

Ähnlich wie die meisten Gewebe reguliert Kalzium eine Vielzahl von Funktionen innerhalb des Magen-Darm-Epithels. Das Darmepithel ist ein wesentlicher Bestandteil der Nährstoff- und Flüssigkeitsaufnahme, muss aber auch eine dichte Barriere und Immunschnittstelle bilden, um das Eindringen von Krankheitserregern oder toxische Beleidigungen zu vermeiden. Kalziumabhängige Signalwege beeinflussen fast alle diese lebenswichtigen Funktionen 9,10,11. Die Kalziumsignalisierung im Darmepithel ist jedoch nach wie vor ein wenig erforschtes Gebiet mit vielversprechendem Potenzial als therapeutisches Ziel. Während die Überwachung der Kalziumdynamik im Darmepithel in vivo weiterhin eine Herausforderung darstellt, bieten humane Darmorganoide (HIOs) ein anpassungsfähiges ex vivo System für Experimente12. HIOs sind 3-dimensionale (3D) Sphäroide, die aus menschlichen Darmstammzellen gewonnen werden und bei Differenzierung einen Großteil der zellulären Vielfalt des nativen Darmepithels rekapitulieren12.

Dieses Protokoll beschreibt umfassende Methoden zur Entwicklung von HIOs, die GECIs exprimieren, und zur Herstellung von künstlich hergestellten HIOs als Monolayer für die Kalziumbildgebung lebender Zellen. Es bietet eine Virusinfektion als Beispiel für eine pathologische Manipulation, die die Kalziumsignalisierung stört, und bietet einen analytischen Ansatz zur Quantifizierung dieser Veränderungen.

Protocol

Alle menschlichen Darmorganoide (HIOs), die in diesem Protokoll und den repräsentativen Experimenten verwendet wurden, wurden aus menschlichem Gewebe gewonnen, das vom Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core gewonnen und gepflegt wurde. Alle Proben wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll entnommen, das vom Institutional Review Board am Baylor College of Medicine genehmigt wurde. 1. Vorbereitung von Materialien und Reagenzien Für die Organoid-Wa…

Representative Results

Abbildung 1A zeigt eine BMM-Kuppel mit 3-dimensionalen humanen Darmorganoiden, die transduziert wurden, um GCaMP6s stabil zu exprimieren. Abbildung 1B zeigt die gleiche Linie von Organoiden, die 24, 48 und 72 Stunden nach der Aussaat als Monoschicht neu beschichtet wurden. Um die Funktion von GCaMP6s zu validieren, wurde die Monoschicht alle 2 s für 4 min durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und nach ~20 s 100 nM ADP zu den Medien hinzugefügt. ADP löst ein…

Discussion

Veränderungen des zytosolischenCa2+-Spiegels können sowohl Ursache als auch Wirkung von Pathologien innerhalb des Epithels sein 10,16,17. Ein Anstieg des zytosolischen Kalziums kann die Sekretion über die Aktivierung des kalziumabhängigen Chloridkanals direkt antreiben TMEM16A18,19. Die Aktivierung von TMEM16A als Reaktion auf Ca2+ ermöglicht d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DK115507 und R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) der National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Die Praktikanten wurden von NIH Grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) und F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) unterstützt. Wir danken dem Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core für die Bereitstellung der organoiden Erhaltungsmedien.

Materials

Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254

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Gebert, J. T., Scribano, F. J., Engevik, K. A., Hyser, J. M. Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (203), e66132, doi:10.3791/66132 (2024).

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