Summary

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Este protocolo describe un enfoque para la realización de imágenes de calcio en organoides intestinales humanos infectados por virus y ofrece un enfoque para el análisis.

Abstract

La señalización del calcio es un regulador integral de casi todos los tejidos. Dentro del epitelio intestinal, el calcio está involucrado en la regulación de la actividad secretora, la dinámica de la actina, las respuestas inflamatorias, la proliferación de células madre y muchas otras funciones celulares no caracterizadas. Como tal, el mapeo de la dinámica de señalización del calcio dentro del epitelio intestinal puede proporcionar información sobre los procesos celulares homeostáticos y revelar respuestas únicas a diversos estímulos. Los organoides intestinales humanos (HIO) son un modelo de alto rendimiento derivado del ser humano para estudiar el epitelio intestinal y, por lo tanto, representan un sistema útil para investigar la dinámica del calcio. Este artículo describe un protocolo para transducir de manera estable HIOs con indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), realizar microscopía de fluorescencia en vivo y analizar datos de imágenes para caracterizar significativamente las señales de calcio. Como ejemplo representativo, las OHIO tridimensionales se transducieron con lentivirus para expresar de forma estable GCaMP6s, una GECI citosólica verde fluorescente basada en proteínas. A continuación, las OHIO modificadas se dispersaron en una suspensión unicelular y se sembraron como monocapas. Después de la diferenciación, las monocapas de HIO se infectaron con rotavirus y/o se trataron con fármacos que se sabe que estimulan una respuesta de calcio. Un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara de imágenes en vivo humidificada y con temperatura controlada permitió obtener imágenes a largo plazo de monocapas infectadas o tratadas con medicamentos. Después de la obtención de imágenes, las imágenes adquiridas se analizaron utilizando el software de análisis disponible gratuitamente, ImageJ. En general, este trabajo establece una línea adaptable para caracterizar la señalización celular en HIO.

Introduction

El calcio es un segundo mensajero ampliamente conservado que desempeña un papel fundamental en laregulación de la fisiología celular. Dada su fuerte carga, su pequeño tamaño y su alta solubilidad en condiciones fisiológicas, el calcio es un manipulador ideal de la conformación de las proteínas. Esto hace que el calcio sea un medio poderoso para transducir señales electroquímicas en alteraciones enzimáticas, transcripcionales o postranscripcionales. Los estrictos gradientes de concentración de calcio a través del retículo endoplásmico (RE) y las membranas plasmáticas crean una alta fuerza impulsora que permite cambios rápidos en la concentración de calcio citosólico. Múltiples mecanismos, incluyendo tanto la amortiguación como el transporte activo, mantienen estrechamente este gradiente. Si bien es necesario para las funciones celulares normales, este mantenimiento es energéticamente costoso, lo que lo hace particularmente susceptible en estados de estrés 2.

Como tal, la desregulación del calcio dentro del citosol es una señal casi universal de muchos tipos de estrés celular. Las alteraciones metabólicas, las toxinas, los patógenos, los daños mecánicos y las perturbaciones genéticas pueden alterar la señalización del calcio. Independientemente del estímulo, a nivel de toda la célula, los aumentos sostenidos e incontrolados del calcio citosólico pueden promover la apoptosis y, finalmente, la necrosis 3,4. Sin embargo, las alteraciones en los niveles citosólicos de calcio de menor amplitud o mayor frecuencia tienen efectos variables2. Del mismo modo, los resultados de las fluctuaciones de calcio pueden diferir en función del microdominio espacial en el que se producen5. Por lo tanto, el monitoreo de los niveles de calcio puede ofrecer información sobre los procesos de señalización dinámica, pero esto requiere un muestreo con una resolución temporal y espacial relativamente alta.

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) son herramientas poderosas para el muestreo continuo en sistemas de células vivas6. Algunos de los GECI más utilizados son las proteínas fluorescentes sensibles al calcio basadas en GFP conocidas como GCaMPs7. El GCaMP canónico es una fusión de tres dominios proteicos distintos: una GFP permutada circularmente (cpGFP), calmodulina y M136. El dominio calmodulina sufre un cambio de conformación al unirse al calcio, lo que permite su interacción con M13. La interacción calmodulina-M13 induce un cambio conformacional en el cpGFP que aumenta su emisión fluorescente tras la excitación. Como tal, un aumento en la concentración de calcio se correlaciona con un aumento en la intensidad de fluorescencia de GCaMP. Estos sensores pueden ser citosólicos o dirigidos a orgánulos específicos8.

Al igual que la mayoría de los tejidos, el calcio regula una variedad de funciones dentro del epitelio gastrointestinal. El epitelio intestinal es fundamental para la absorción de nutrientes y líquidos, pero también debe formar una barrera hermética y una interfaz inmunitaria para evitar la invasión de patógenos o las agresiones tóxicas. Las vías dependientes del calcio influyen en casi todas estas funciones vitales 9,10,11. Sin embargo, la señalización del calcio dentro del epitelio intestinal sigue siendo una frontera poco explorada con un potencial prometedor como diana terapéutica. Si bien el monitoreo de la dinámica del calcio dentro del epitelio intestinal in vivo sigue presentando desafíos, los organoides intestinales humanos (HIO) ofrecen un sistema ex vivo adaptable para la experimentación12. Los HIO son esferoides tridimensionales (3D) derivados de células madre intestinales humanas y, al diferenciarse, recapitulan gran parte de la diversidad celular del epitelio intestinal nativo12.

Este protocolo describe métodos integrales para diseñar HIO que expresan GECI y luego preparar HIO diseñadas como monocapas para la obtención de imágenes de calcio de células vivas. Ofrece la infección viral como ejemplo de una manipulación patológica que interrumpe la señalización del calcio y proporciona un enfoque analítico para cuantificar estos cambios.

Protocol

Todos los organoides intestinales humanos (HIO) utilizados en este protocolo y los experimentos representativos se derivaron de tejido humano obtenido y mantenido por el Centro Enteroide de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas. Todas las muestras se recolectaron de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Baylor College of Medicine. 1. Preparación de materiales y reactivos Para el mantenimiento de organoides, reúna…

Representative Results

La Figura 1A muestra una cúpula de BMM que contiene organoides intestinales humanos tridimensionales que han sido transducidos para expresar de forma estable GCaMP6s. La Figura 1B muestra la misma línea de organoide resarvida como monocapa a las 24, 48 y 72 h después de la siembra. Para validar la función de GCaMP6s, se obtuvieron imágenes de la monocapa mediante microscopía de fluorescencia cada 2 s durante 4 min, y se añadieron 100 nM de ADP al medio de…

Discussion

Las alteraciones en los niveles citosólicos de Ca2+ pueden ser tanto causa como efecto de patologías dentro del epitelio 10,16,17. Los aumentos en el calcio citosólico pueden impulsar directamente la secreción a través de la activación del canal de cloruro dependiente de calcio TMEM16A18,19. La activación de TMEM16A en respuesta a Ca2+ permit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones R01DK115507 y R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El apoyo de los aprendices fue proporcionado por el F30DK131828 de subvenciones de los NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) y F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Nos gustaría agradecer al Centro Enteroide de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas por proporcionar los medios de mantenimiento de organoides.

Materials

Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254

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Gebert, J. T., Scribano, F. J., Engevik, K. A., Hyser, J. M. Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (203), e66132, doi:10.3791/66132 (2024).

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