הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית
Summary
פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.
Abstract
איתות סידן הוא וסת אינטגרלי של כמעט כל רקמה. בתוך אפיתל המעי, סידן מעורב בוויסות פעילות ההפרשה, דינמיקה של אקטינים, תגובות דלקתיות, התפשטות תאי גזע ותפקודים תאיים רבים אחרים שאינם מאופיינים. ככזה, מיפוי דינמיקת איתות הסידן בתוך אפיתל המעי יכול לספק תובנה לגבי תהליכים תאיים הומיאוסטטיים ולחשוף תגובות ייחודיות לגירויים שונים. אורגנואידי מעיים אנושיים (HIOs) הם מודל בעל תפוקה גבוהה שמקורו בבני אדם לחקר אפיתל המעי ובכך מייצגים מערכת שימושית לחקר דינמיקת הסידן. מאמר זה מתאר פרוטוקול להתמרה יציבה של HIOs עם מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs), ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי וניתוח נתוני הדמיה כדי לאפיין באופן משמעותי אותות סידן. כדוגמה מייצגת, HIOs תלת מימדיים הומרו עם lentivirus כדי לבטא ביציבות GCaMP6s, GECI ציטוסולי ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטי. לאחר מכן פוזרו ה-HIOs המהונדסים לתרחיף חד-תאי ונזרעו כחד-שכבות. לאחר ההתמיינות, חד-שכבות HIO נדבקו בנגיף הרוטה ו/או טופלו בתרופות הידועות כמעוררות תגובת סידן. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בתא הדמיה חי מבוקר טמפרטורה ולח איפשר הדמיה ארוכת טווח של חד-שכבות נגועות או מטופלות בתרופות. לאחר ההדמיה, התמונות שנרכשו נותחו באמצעות תוכנת הניתוח הזמינה באופן חופשי, ImageJ. בסך הכל, עבודה זו מקימה צינור מותאם לאפיון איתות סלולרי ב- HIOs.
Introduction
סידן הוא שליח שני שנשמר באופן נרחב וממלא תפקיד קריטי בוויסות הפיזיולוגיה התאית1. בהתחשב במטען החזק שלו, גודלו הקטן ומסיסותו הגבוהה בתנאים פיזיולוגיים, סידן הוא מניפולטור אידיאלי של קונפורמציה חלבונית. זה הופך את הסידן לאמצעי רב עוצמה להמרת אותות אלקטרוכימיים לשינויים אנזימטיים, שעתוק או לאחר שעתוק. שיפועי ריכוז הסידן המחמירים על פני הרשתית האנדופלסמית (ER) וקרומי הפלזמה יוצרים כוח מניע גבוה המאפשר שינויים מהירים בריכוז הסידן הציטוסולי. מנגנונים מרובים, כולל חציצה והובלה אקטיבית, שומרים בחוזקה על שיפוע זה. בעוד שהוא נחוץ לתפקודים תאיים תקינים, תחזוקה זו יקרה מבחינה אנרגטית, מה שהופך אותו לרגיש במיוחד במצבי לחץ 2.
לכן, חוסר ויסות של סידן בתוך ציטוזול הוא אות כמעט אוניברסלי של סוגים רבים של מתח תאי. הפרעות מטבוליות, רעלים, פתוגנים, נזק מכני והפרעות גנטיות יכולים כולם לשבש את איתות הסידן. ללא קשר לגירוי, ברמת התא כולו, עלייה מתמשכת ובלתי מבוקרת בסידן ציטוסולי יכולה לקדם אפופטוזיס ובסופו של דבר נמק 3,4. עם זאת, לשינויים ברמות הסידן הציטוסולי של משרעת נמוכה יותר או בתדירות גבוהה יותר, יש השפעות משתנות2. כמו כן, התוצאות של תנודות סידן עשויות להיות שונות בהתאם למיקרו-תחום המרחבי שבו הן מתרחשות5. ניטור רמות הסידן יכול אפוא להציע תובנה לגבי תהליכי איתות דינמיים, אך לשם כך נדרשת דגימה ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה יחסית.
מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) הם כלים רבי עוצמה לדגימה רציפה במערכות תאים חיים6. חלק מה- GECIs הנפוצים ביותר הם חלבונים פלואורסצנטיים מבוססי GFP המגיבים לסידן הידועים בשם GCaMPs7. GCaMP הקנוני הוא מיזוג של שלושה תחומי חלבון נפרדים: GFP בעל תמורות מעגליות (cpGFP), קלמודולין ו-M136. תחום הקלמודולין עובר שינוי קונפורמציה עם קשירת הסידן, המאפשר את האינטראקציה שלו עם M13. האינטראקציה קלמודולין-M13 גורמת לשינוי קונפורמטיבי ב-cpGFP שמגביר את הפליטה הפלואורסצנטית שלו בעת עירור. לכן, עלייה בריכוז הסידן נמצאת בקורלציה עם עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP. חיישנים אלה יכולים להיות ציטוסוליים או ממוקדים לאברונים ספציפיים8.
בדומה לרוב הרקמות, סידן מווסת מגוון תפקודים בתוך אפיתל מערכת העיכול. אפיתל המעי הוא אינטגרלי לספיגת חומרים מזינים ונוזלים, אך גם חייב ליצור מחסום הדוק וממשק חיסוני הדוק כדי למנוע פלישת פתוגן או עלבונות רעילים. מסלולים תלויי סידן משפיעים כמעט על כל התפקודים החיוניים הללו 9,10,11. עם זאת, איתות סידן בתוך אפיתל המעי נותר גבול שלא נחקר מספיק עם פוטנציאל מבטיח כמטרה טיפולית. בעוד ניטור דינמיקת הסידן בתוך אפיתל המעי in vivo ממשיך להציב אתגרים, אורגנואידי מעיים אנושיים (HIOs) מציעים מערכת אקס ויו ניתנת להתאמה לניסויים12. HIOs הם ספרואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בתאי גזע אנושיים במעי, ועם התמיינותם, הם משחזרים חלק גדול מהמגוון התאי של אפיתל המעי המקומי12.
פרוטוקול זה מתאר שיטות מקיפות להנדסת HIOs המבטאים GECIs ולאחר מכן מכינים HIOs מהונדסים כמונו-שכבות להדמיית סידן בתאים חיים. הוא מציע זיהום ויראלי כדוגמה למניפולציה פתולוגית המשבשת את איתות הסידן ומספק גישה אנליטית לכימות שינויים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים ברמות Ca2+ ציטוסוליים יכולים להיות סיבה ותוצאה של פתולוגיות בתוך אפיתל 10,16,17. עלייה בסידן ציטוסולי יכולה לגרום ישירות להפרשה באמצעות הפעלת תעלת הכלוריד תלוית הסידן TMEM16A18,19. הפעלת TMEM16A בתגובה ל- C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים R01DK115507 ו R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH). תמיכת המתאמנים ניתנה על ידי מענקי NIH F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) ו- F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). ברצוננו להודות למרכז הרפואי טקסס Digestive Diseases Enteroid Core על אספקת אמצעי תחזוקת האורגנואידים.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
