유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징
Summary
이 프로토콜은 바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드에서 칼슘 이미징을 수행하기 위한 접근 방식을 설명하고 분석에 대한 접근 방식을 제공합니다.
Abstract
칼슘 신호전달은 거의 모든 조직의 필수 조절자입니다. 장 상피 내에서 칼슘은 분비 활동, 액틴 역학, 염증 반응, 줄기 세포 증식 및 기타 많은 특성화되지 않은 세포 기능의 조절에 관여합니다. 따라서 장 상피 내의 칼슘 신호 역학을 매핑하면 항상성 세포 과정에 대한 통찰력을 제공하고 다양한 자극에 대한 고유한 반응을 밝힐 수 있습니다. 인간 장 오가노이드(HIO)는 장 상피를 연구하기 위한 고처리량 인간 유래 모델로, 칼슘 역학을 조사하는 데 유용한 시스템입니다. 이 논문에서는 유전적으로 인코딩된 칼슘 표지자(GECI)를 사용하여 HIO를 안정적으로 transduction하고, 실시간 형광 현미경 검사를 수행하고, 이미징 데이터를 분석하여 칼슘 신호를 의미 있게 특성화하는 프로토콜을 설명합니다. 대표적인 예로, 3차원 HIO를 렌티바이러스로 transduction하여 녹색 형광 단백질 기반 세포질 GECI인 GCaMP6를 안정적으로 발현시켰습니다. 그런 다음 엔지니어링된 HIO를 단일 세포 현탁액으로 분산하고 단층으로 파종했습니다. 분화 후, HIO 단층을 로타바이러스에 감염시키거나 칼슘 반응을 자극하는 것으로 알려진 약물로 처리하였다. 온도 제어, 가습 라이브 이미징 챔버가 장착된 형광 현미경을 사용하면 감염되거나 약물로 처리된 단층의 장기 이미징이 가능합니다. 이미징 후 무료로 제공되는 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 획득한 이미지를 분석했습니다. 전반적으로, 이 연구는 HIO에서 세포 신호 전달을 특성화하기 위한 적응 가능한 파이프라인을 구축합니다.
Introduction
칼슘은 세포 생리학을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 널리 보존된 두 번째 전달자이다1. 생리적 조건에서 강한 전하, 작은 크기 및 높은 용해도를 감안할 때 칼슘은 단백질 구조의 이상적인 조작제입니다. 따라서 칼슘은 전기화학적 신호를 효소, 전사 또는 전사 후 변화로 변환하는 강력한 수단이 됩니다. 소포체(ER)와 원형질막을 가로지르는 엄격한 칼슘 농도 구배는 세포질 칼슘 농도의 급격한 변화를 가능하게 하는 높은 추진력을 생성합니다. 버퍼링과 활성 전송을 모두 포함하는 여러 메커니즘은 이 기울기를 긴밀하게 유지합니다. 정상적인 세포 기능을 위해 필요하기는 하지만, 이러한 유지는 에너지 비용이 많이 들기 때문에 스트레스 상태에서 특히 취약하다 2.
이와 같이, 세포질 내의 칼슘 조절 장애는 많은 종류의 세포 스트레스의 거의 보편적인 신호입니다. 대사 장애, 독소, 병원균, 기계적 손상 및 유전적 교란은 모두 칼슘 신호 전달을 방해할 수 있습니다. 자극에 관계없이, 전체 세포 수준에서 세포질 칼슘의 지속적이고 통제되지 않은 상승은 세포 사멸을 촉진하고 결국 괴사를 촉진할 수 있습니다 3,4. 그러나 진폭이 낮거나 주파수가 높은 세포질 칼슘 수치의 변화는 다양한 영향을 미친다2. 마찬가지로, 칼슘 변동의 결과는 그것이 발생하는 공간적 미세영역에 따라 달라질 수 있다5. 따라서 칼슘 수치를 모니터링하면 동적 신호 전달 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있지만, 이를 위해서는 상대적으로 높은 시간적 및 공간적 분해능을 사용한 샘플링이 필요합니다.
유전자 인코딩 칼슘 지표(GECI)는 살아있는 세포 시스템에서 연속 샘플링을 위한 강력한 도구입니다6. 가장 널리 사용되는 GECI는 GCaMP로 알려진 GFP 기반 칼슘 반응성 형광 단백질입니다7. 표준 GCaMP는 세 가지 뚜렷한 단백질 도메인, 즉 원형으로 치환된 GFP(cpGFP), 칼모듈린 및 M136의 융합입니다. 칼모듈린 도메인은 칼슘과 결합할 때 형태 변화를 겪어 M13과 상호 작용할 수 있습니다. 칼모듈린-M13 상호작용은 cpGFP의 구조적 변화를 유도하여 여기(excitation) 시 형광 방출을 증가시킵니다. 따라서 칼슘 농도의 증가는 GCaMP 형광 강도의 증가와 상관관계가 있습니다. 이들 센서는 세포질(cytosoli)이거나 특정 세포소기관(specific organelle)을 표적으로 할 수 있다8.
대부분의 조직과 마찬가지로 칼슘은 위장 상피 내에서 다양한 기능을 조절합니다. 장 상피는 영양분과 체액 흡수에 필수적이지만 병원균 침입이나 독성 물질을 피하기 위해 단단한 장벽과 면역 인터페이스를 형성해야 합니다. 칼슘 의존 경로는 이러한 거의 모든 중요한 기능에 영향을 미칩니다 9,10,11. 그러나 장 상피 내의 칼슘 신호 전달은 치료 표적으로서 유망한 잠재력과 함께 아직 미개척 분야로 남아 있습니다. 생체 내 장 상피 내 칼슘 역학을 모니터링하는 것은 여전히 어려운 일이지만, 인간 장 오가노이드(HIO)는 실험을 위한 적응 가능한 생체 외 시스템을 제공합니다12. HIO는 인간 장 줄기 세포에서 유래한 3차원(3D) 스페로이드이며, 분화 시 천연 장 상피의 세포 다양성 대부분을 재현합니다12.
이 프로토콜은 GECI를 발현하는 HIO를 엔지니어링한 다음 엔지니어링된 HIO를 라이브 셀 칼슘 이미징을 위한 단층으로 준비하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 칼슘 신호 전달을 방해하는 병리학적 조작의 예로 바이러스 감염을 제시하고 이러한 변화를 정량화하기 위한 분석적 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포질 Ca2+ 수준의 변화는 상피 내 병리학의 원인이자 결과일 수 있습니다10,16,17. 세포질 칼슘의 증가는 칼슘 의존성 염화물 채널의 활성화를 통해 분비를 직접 유도할 수 있습니다18,19 TMEM16A. Ca2 +에 대한 반응으로 TMEM16A의 활성화는 염화물의 정점 유출을 허용하여 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 보조금 R01DK115507 및 R01AI158683(PI: J. M. Hyser)의 지원을 받았습니다. 연수생 지원은 NIH 보조금 F30DK131828(PI: J.T. Gebert), F31DK132942(PI: F. J. Scribano) 및 F32DK130288(PI: K.A. Engevik)에서 제공했습니다. 오가노이드 유지 배지를 제공해 주신 Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core에 감사드립니다.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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