تقييم الفحص عالي الإنتاجية لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE)
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) باستخدام ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) كمسبار صبغة مضان باستخدام نهج فحص عالي الإنتاجية. يصف البروتوكول طرق التقييم الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) في خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الثلاثة المختلفة.
Abstract
تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دورا رئيسيا في تنظيم التمثيل الغذائي الخلوي في العمليات الفسيولوجية والمرضية. يلعب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الفسيولوجية دورا مركزيا في التعديل المكاني والزماني للوظائف الخلوية الطبيعية مثل الانتشار والإشارات وموت الخلايا المبرمج والشيخوخة. في المقابل ، فإن الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المزمن مسؤول عن مجموعة واسعة من الأمراض ، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري وغيرها. وبالتالي فإن قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية بطريقة دقيقة وقابلة للتكرار أمر ضروري لفهم الوظائف الخلوية الطبيعية. تعد الطرق القائمة على التصوير الفلوري لتوصيف أنواع أنواع أنواع ROS داخل الخلايا نهجا شائعا. تستخدم العديد من بروتوكولات ROS التصويرية في الأدبيات صبغة 2′-7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). ومع ذلك ، فإن هذه الصبغة تعاني من قيود كبيرة في استخدامها وتفسيرها. يوضح البروتوكول الحالي استخدام مسبار الفلورسنت ثنائي هيدروإيثيديوم (DHE) كطريقة بديلة لتحديد إجمالي إنتاج ROS في بيئة عالية الإنتاجية. تم استخدام منصة التصوير عالية الإنتاجية ، CX7 Cellomics ، لقياس وقياس إنتاج ROS. أجريت هذه الدراسة في ثلاثة خطوط خلايا سرطانية كبدية – HepG2 و JHH4 و HUH-7. يوفر هذا البروتوكول وصفا متعمقا للإجراءات المختلفة التي ينطوي عليها تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، بما في ذلك – تحضير محلول DHE ، وحضانة الخلايا بمحلول DHE ، وقياس شدة DHE اللازمة لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يوضح هذا البروتوكول أن صبغة الفلورسنت DHE هي خيار قوي وقابل للتكرار لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. من المرجح أن تكون الأساليب عالية الإنتاجية لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة في مجموعة متنوعة من الدراسات ، مثل علم السموم وفحص الأدوية وبيولوجيا السرطان.
Introduction
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي مجموعة من الجذور الكيميائية التي تحدث بشكل طبيعي ، شديدة التفاعل ، وغير مستقرة زمنيا والتي تشكلت كجزء من التمثيل الغذائي الخلوي الطبيعي في الخلايا. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورا رئيسيا وأساسيا في تعديل العمليات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الطبيعية التي تحدث في الخلايا 1,2. المصدر الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا هو من مسار سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) كجزء من دورة الطاقة الحيوية العادية. تشمل المصادر الإضافية المهمة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التفاعلات الأنزيمية مثل أوكسيديز NADPH الخلوي في الخلايا. يحدث استقلاب جزيئات الطعام (مثل الجلوكوز) عبر مسار الفسفرة التأكسدية في مصفوفة الميتوكوندريا. يعد المستوى الأساسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ضروريا لتنظيم عمليات إشارات الخلايا الفسيولوجية الطبيعية. من المعروف أن العديد من جزيئات البروتين الرئيسية التي تشكل جزءا من مسارات إشارات التمثيل الغذائي للجلوكوز (على سبيل المثال ، Akt و PTEN) تستجيب لمستويات ROS داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العديد من الإنزيمات داخل الخلايا مثل أوكسيديز الزانثين ، سينسيز أكسيد النيتريك ، ومكونات البيروكسيسومال كجزء من المسارات الأنزيمية الخلوية 1,2. على النقيض من المصادر الطبيعية لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فإن بعض العوامل البيئية ، مثل xenobiotics ، والعوامل المعدية ، والأشعة فوق البنفسجية ، والتلوث ، وتدخين السجائر ، والإشعاع ، تؤدي أيضا إلى الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتي تعد محركا رئيسيا للإجهاد التأكسدي داخل الخلايا 1,3. يمكن أن يتسبب الإجهاد التأكسدي الخلوي المرتفع في تلف الجزيئات الحيوية الأصلية داخل الخلية ، مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي ، مما يسبب أمراضا مختلفة مثل السرطان والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والالتهابات المزمنة والاضطرابات التنكسية العصبية1،3،4. لذلك ، تعد القياسات الدقيقة لأنواع الأكسجين التفاعلية ضرورية لفهم الآليات الخلوية المشاركة في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الناجمة عن الإجهاد التأكسدي.
نظرا للجداول الزمنية القصيرة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية والقضاء عليها داخل الخلايا ، تظل القياسات الكمية لمختلف جذور أنواع الأكسجين التفاعلية تمثل تحديا. تستخدم طرق مثل الرنين المغنطيسي الإلكتروني (EPR) 5 ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) ، والتصوير القائم على مسبار التألق لقياس مختلف أنواع ROS6 الخلوية. في حين أن طرقا مثل EPR و HPLC تسفر عن تقديرات دقيقة كميا ، فإن هذه الطرق تنطوي على تدمير التشكل المكاني الخلوي وعادة ما تكون في شكل قياسات عالمية ومجمعة للعينة. في المقابل ، تحتفظ الطرق القائمة على التصوير مثل الطرق القائمة على مسبار التألق بالتشكل الخلوي والسياق المكاني لجيل ROS. ومع ذلك ، فإن خصوصية مجسات التألق المختلفة لأنواع مختلفة من جذور ROS لم تكن راسخة 7,8. تتوفر العديد من مجسات الفلورسنت مثل ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) وثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH-DA) وثنائي هيدرورودامين (DHR) وثنائي ميثيل أنثراسين (DMA) و 2،7 ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH) و 1،3-ثنائي فينيل إيزوبنزوفيوران (DPBF) وميتوسوكس للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية تجاريا. في العقود الماضية ، DHE و MitoSox و DCFH-DA هي الأصباغ الفلورية شائعة الاستخدام لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا والأنسجة 8,9. DCFH-DA هي صبغة مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن H2O2 داخل الخلايا والإجهاد التأكسدي. على الرغم من شعبية DCFH-DA ، فقد أظهرت العديد من الدراسات السابقة أنه لا يمكن استخدامه بشكل موثوق لقياس H2O2 داخل الخلايا ومستويات ROS الأخرى8،9،10،11،12،13،14.
في المقابل ، يظهر مسبار الفلورسنت ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) استجابة محددة لجذر الأكسيد الفائق داخل الخلايا (O2–). في حين أن جذر الأكسيد الفائق هو واحد من العديد من أنواع أنواع ROS التي لوحظت في الخلايا ، إلا أنه جذري مهم يشارك في الحد من المعادن الانتقالية ، والتحويل إلى بيروكسي نترات ، وتشكيل هيدروبيروكسيدات ، من بين تأثيرات أخرى داخل الخلايا. DHE تمتص بسرعة من قبل الخلايا ولها انبعاث مضان في نطاق الطول الموجي الأحمر15. عند التفاعل مع جذر الأكسيد الفائق على وجه التحديد ، يشكل DHE منتجا فلوريا أحمر ، 2-هيدروكسي إيثيديوم (2-OH-E +). وبالتالي ، يمكن اعتبار DHE بمثابة مسبار محدد للكشف عن الأكسيد الفائق. ومع ذلك ، يمكن أن يخضع DHE أيضا للأكسدة غير المتخصصة مع ONOO- أو OH. ، H2O 2 ، والسيتوكروم c لتشكيل منتج مضان ثان ، ethidium E + ، والذي يمكن أن يتداخل مع مستويات 2-OH-E + المقاسة. ومع ذلك ، فإن منتجات 2-OH E + و E + هذه ، مجتمعة ، تمثل جزءا رئيسيا من إجمالي أنواع ROS الخلوية التي لوحظت داخل الخلية عند تلطيخها ب DHE. E + يقحم في الحمض النووي ، مما يعزز بشكل كبير مضان8،9،10،11،13،14،15،16. نظرا لأن أطياف التألق للإيثيديوم والإيثيديوم 2-هيدروكسي تختلف اختلافا طفيفا فقط ، يمكن اكتشاف غالبية مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية التي تظهر في خلية ثانوية لإنتاج الأكسيد الفائق وقياسها باستخدام منتجات مضان DHE. تم تحديد أنواع ROS هذه باستخدام إثارة الطول الموجي 480 نانومتر وانبعاث الطول الموجي 610 نانومتر15،16،17.
بالإضافة إلى اختيار مسبار محدد للكشف عن ROS الفلوري ، من المهم اختيار طريقة حساسة للكشف لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. وبالتالي ، فإن التقييم الدقيق لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا هو المفتاح لتحديد حالات توازن الأكسدة والاختزال المضطربة التي تحدث في الخلايا المريضة أو الخلايا التي تعرضت لضغوط بيئية مختلفة مثل الإشعاع والمركبات السمية والعوامل السامة للجينات18. نظرا لأن أنواع الأكسجين التفاعلية هي ظاهرة شائعة الحدوث في الخلايا المسؤولة عن تنظيم مجموعة متنوعة من أنشطة إشارات الخلايا ، فإن الطرق القوية للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية ضرورية. لتمكين مثل هذا التقييم عالي الإنتاجية لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، يستخدم هذا البروتوكول منصة فحص عالية المحتوى (HCS) لقياس أنواع أنواع الأكسجين التفاعلية. يسمح البروتوكول الحالي بتحليل عالي الإنتاجية لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، وهو أمر بالغ الأهمية في العديد من دراسات السموم19. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير حل سهل ومتعدد الاستخدامات لاكتشاف وقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في خلايا سرطان الخلايا الكبدية الملتصقة. تستخدم الكواشف الكيميائية ل H2O2 و menadione كمحفزات ROS قوية لقياس المستويات النسبية لإنتاج ROS في بيئة خاضعة للرقابة وعالية الإنتاجية. يمكن ضبط هذا البروتوكول لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة في ظل الظروف المناسبة ، حسب الضرورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم إنشاء بروتوكول لتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) التي يحركها الأكسيد الفائق باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) على نظام فحص عالي المحتوى. تستخدم غالبية البروتوكولات الحالية المتاحة في الأدبيات DCFH-DA كمسبار تصوير مضان لتحديد أنواع ROS. ومع ذلك …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم RK و RRG بمنحة من مركز UNM للمعادن في علم الأحياء والطب (CMBM) من خلال منحة NIH NIGMS P20 GM130422. تم دعم RRG بجائزة تجريبية من منحة NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. تم توفير الدعم الأساسي للتصوير لأداة CX7 Cellomics من خلال نوى مركز AIM بتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121176. نود أن نشكر الدكتورة شارينا ديساي والدكتور لي تشن على مساعدتهما القيمة في القضايا الفنية المتعلقة باستخدام منصة التصوير CX7 Cellomics.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
