Valutazione dello screening ad alto rendimento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE)

Summary

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per quantificare le specie reattive dell’ossigeno (ROS) intracellulari utilizzando il diidroetidio (DHE) come sonda colorante a fluorescenza utilizzando un approccio di screening ad alto rendimento. Il protocollo descrive i metodi per la valutazione quantitativa delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) intracellulari nelle tre diverse linee cellulari di carcinoma epatocellulare.

Abstract

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) svolgono un ruolo chiave nella regolazione del metabolismo cellulare nei processi fisiologici e patologici. La produzione fisiologica di ROS svolge un ruolo centrale nella modulazione spaziale e temporale delle normali funzioni cellulari come la proliferazione, la segnalazione, l’apoptosi e la senescenza. Al contrario, la sovrapproduzione cronica di ROS è responsabile di un ampio spettro di malattie, come il cancro, le malattie cardiovascolari e il diabete, tra le altre. Quantificare i livelli di ROS in modo accurato e riproducibile è quindi essenziale per comprendere la normale funzionalità cellulare. I metodi basati sull’imaging a fluorescenza per caratterizzare le specie di ROS intracellulari sono un approccio comune. Molti dei protocolli ROS di imaging in letteratura utilizzano il colorante 2′-7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA). Tuttavia, questo colorante soffre di limitazioni significative nel suo utilizzo e nella sua interpretabilità. L’attuale protocollo dimostra l’uso di una sonda fluorescente al diidroetidio (DHE) come metodo alternativo per quantificare la produzione totale di ROS in un ambiente ad alto rendimento. La piattaforma di imaging ad alto rendimento, CX7 Cellomics, è stata utilizzata per misurare e quantificare la produzione di ROS. Questo studio è stato condotto su tre linee cellulari di cancro epatocellulare: HepG2, JHH4 e HUH-7. Questo protocollo fornisce una descrizione approfondita delle varie procedure coinvolte nella valutazione dei ROS all’interno delle cellule, tra cui: preparazione della soluzione di DHE, incubazione delle cellule con soluzione di DHE e misurazione dell’intensità di DHE necessaria per caratterizzare la produzione di ROS. Questo protocollo dimostra che il colorante fluorescente DHE è una scelta robusta e riproducibile per caratterizzare la produzione intracellulare di ROS in modo ad alto rendimento. È probabile che gli approcci ad alto rendimento per misurare la produzione di ROS siano utili in una varietà di studi, come la tossicologia, lo screening dei farmaci e la biologia del cancro.

Introduction

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono un gruppo di radicali chimici presenti in natura, altamente reattivi e temporalmente instabili che si formano come parte del normale metabolismo cellulare nelle cellule. I ROS svolgono un ruolo chiave ed essenziale nella modulazione dei normali processi fisiologici e biochimici che avvengono nelle cellule ^1,2. La principale fonte di produzione di ROS nelle cellule proviene dalla via della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC) come parte del normale ciclo bioenergetico. Ulteriori fonti significative di produzione di ROS includono reazioni enzimatiche come le NADPH ossidasi cellulari nelle cellule. Il metabolismo delle molecole alimentari (ad esempio, il glucosio) avviene attraverso la via della fosforilazione ossidativa nella matrice mitocondriale. Un livello basale di produzione di ROS è essenziale per regolare i normali processi fisiologici di segnalazione cellulare. Molte molecole proteiche chiave che fanno parte delle vie di segnalazione metabolica del glucosio (ad esempio, Akt e PTEN) sono note per rispondere ai livelli intracellulari di ROS. Inoltre, i ROS sono prodotti da vari enzimi intracellulari come la xantina ossidasi, l’ossido nitrico sintasi e i costituenti perossisomiali come parte delle vie enzimatiche cellulari ^1,2. A differenza delle fonti naturali di ROS, alcuni fattori ambientali, come gli xenobiotici, gli agenti infettivi, i raggi UV, l’inquinamento, il fumo di sigaretta e le radiazioni, portano anche a un’eccessiva produzione di ROS, che sono un fattore chiave dello stress ossidativo intracellulare ^1,3. L’elevato stress ossidativo cellulare può causare danni alle biomolecole native all’interno di una cellula, come lipidi, proteine e DNA, causando varie malattie come cancro, diabete, malattie cardiovascolari, infiammazioni croniche e disturbi neurodegenerativi ^1,3,4. Pertanto, misurazioni accurate dei ROS sono essenziali per comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nella fisiopatologia della malattia indotta dallo stress ossidativo.

A causa dei brevi tempi di produzione ed eliminazione dei ROS all’interno delle cellule, le misurazioni quantitative di vari radicali ROS rimangono una sfida. Metodi come la risonanza paramagnetica elettronica (EPR)⁵, la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e l’imaging basato su sonde di fluorescenza vengono utilizzati per misurare i vari ROS^{cellulari 6}. Mentre metodi come l’EPR e l’HPLC forniscono stime quantitativamente accurate, questi metodi comportano la distruzione della morfologia spaziale cellulare e sono solitamente sotto forma di misurazioni globali e di massa di un campione. Al contrario, i metodi basati sull’imaging, come i metodi basati su sonde di fluorescenza, mantengono la morfologia cellulare e il contesto spaziale della generazione di ROS. Tuttavia, la specificità di varie sonde di fluorescenza per diversi tipi di radicali ROS non è stata ben stabilita ^7,8. Diverse sonde fluorescenti come il diidroetidio (DHE), il diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA), la diidrorodamina (DHR), il dimetilantracene (DMA), il 2,7 diclorodiidrofluresceina (DCFH), l’1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) e il MitoSox sono disponibili per il rilevamento dei ROS in commercio. Negli ultimi decenni, DHE, MitoSox e DCFH-DA sono i coloranti fluorescenti comunemente usati per misurare i ROS nelle cellule e nei tessuti ^8,9. DCFH-DA è un colorante ampiamente utilizzato per rilevare H₂O₂ intracellulare e stress ossidativo. Nonostante la popolarità del DCFH-DA, diversi studi precedenti hanno dimostrato che non può essere utilizzato in modo affidabile per misurare i livelli intracellulari di H₂O₂ e altri livelli di ROS 8,9,10,11,12,13,14.

Al contrario, la sonda fluorescente diidroetidio (DHE) mostra una risposta specifica al radicale superossido intracellulare (O₂^–). Mentre il radicale superossido è una delle tante specie di ROS osservate nelle cellule, è un importante radicale coinvolto nella riduzione dei metalli di transizione, nella conversione in perossinitrato e nella formazione di idroperossidi, tra gli altri effetti intracellulari. Il DHE viene rapidamente assorbito dalle cellule e ha un’emissione di fluorescenza nella gamma di lunghezze d’onda rosse¹⁵. In seguito alla reazione con il radicale superossido in particolare, il DHE forma un prodotto fluorescente rosso, 2-idrossietidio (2-OH-E⁺). Pertanto, il DHE può essere considerato come una sonda specifica per il rilevamento del superossido. Tuttavia, il DHE può anche subire un’ossidazione non specifica con ONOO^– o OH^., H₂O₂ e citocromo c per formare un secondo prodotto di fluorescenza, etidio E^+, che può interferire con i livelli misurati di 2-OH-E⁺. Tuttavia, questi prodotti 2-OH E⁺ ed E⁺, in combinazione, rappresentano una parte importante delle specie cellulari totali di ROS osservate all’interno di una cellula quando colorate con DHE. E⁺ si intercala nel DNA, aumentando notevolmente la sua fluorescenza 8,9,10,11,13,14,15,16. Poiché gli spettri di fluorescenza dell’etidio e del 2-idrossietidio differiscono solo leggermente, la maggior parte dei livelli di ROS osservati in una cellula secondaria alla produzione di superossido può essere rilevata e misurata utilizzando prodotti a fluorescenza DHE. Queste specie di ROS sono identificate utilizzando l’eccitazione a 480 nm di lunghezza d’onda e l’emissione di lunghezza d’onda a 610 nm 15,16,17.

Oltre a scegliere una specifica sonda fluorescente per il rilevamento dei ROS, è importante scegliere un metodo di rilevamento sensibile per misurare i ROS intracellulari. Una valutazione accurata dei livelli intracellulari di ROS è quindi fondamentale per identificare gli stati di equilibrio redox disturbati che si verificano nelle cellule malate o nelle cellule che sono state esposte a vari fattori di stress ambientale come radiazioni, composti tossicologici e agenti genotossici¹⁸. Poiché i ROS sono un fenomeno che si verifica comunemente nelle cellule ed è responsabile della regolazione di una varietà di attività di segnalazione cellulare, sono essenziali metodi robusti di rilevamento dei ROS. Per consentire una valutazione ad alto rendimento della produzione di ROS all’interno delle cellule, questo protocollo utilizza una piattaforma di screening ad alto contenuto (HCS) per misurare le specie di ROS. L’attuale protocollo consente l’analisi ad alto rendimento della produzione intracellulare di ROS, che è di fondamentale importanza in molti studi tossicologici¹⁹. Questo protocollo mira a fornire una soluzione semplice e versatile per rilevare e misurare i ROS intracellulari nelle cellule di carcinoma epatocellulare aderenti. I reagenti chimici di H₂O₂ e menadione sono utilizzati come potenti stimolatori di ROS per misurare i livelli relativi di produzione di ROS in un ambiente controllato e ad alta produttività. Questo protocollo può essere messo a punto per misurare la produzione di ROS in cellule aderenti e non aderenti in condizioni appropriate, se necessario.

Protocol

1. Colture cellulari Seminare le cellule di prova (cellule di carcinoma epatocellulare HepG2, HUH7 e JHH4) in una piastra da 96 pozzetti con una densità di semina di 10.000 cellule/pozzetto in un volume di semina finale di 200 μL per pozzetto.Prima di coltivare le cellule HepG2, rivestire i 96 pozzetti della piastra con collagene di tipo IV (50 μg/mL) per una durata di 2 ore a temperatura ambiente (RT). Per evitare la solidificazione del collagene madre, mettere la soluzione madre ne…

Representative Results

Il diidroetidio (DHE) è un colorante fluorescente reattivo ai superossidi che fornisce informazioni specifiche sugli stati dei ROS intracellulari. Il colorante DHE emette intrinsecamente fluorescenza blu nel citoplasma. Tuttavia, in seguito all’interazione con i radicali superossido, si trasforma in 2-idrossietidio, che emette fluorescenza nelle lunghezze d’onda rosse (>550 nm) (Figura 1). Il colorante DHE viene facilmente trasportato nelle cellule e nel nucleo. La fluorescenza emessa può …

Discussion

In questo studio, è stato stabilito un protocollo per valutare la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) intracellulari guidate dal superossido utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE) su un sistema di screening ad alto contenuto. La maggior parte degli attuali protocolli disponibili in letteratura utilizza il DCFH-DA come sonda di imaging a fluorescenza per quantificare le specie di ROS. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che il DCFH-DA non è una sonda ideale per la misurazione dei R…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625